（植物学专业论文）一氧化氮和细胞分裂素互作对拟南芥开花的调控.pdf

中文摘要 摘要 一氧化氮( n 0 ) 是一种生物活性分子，越来越多的证据表明它是生物体内 分布最为广泛的信号分子之一。最初发现n o 是哺乳动物血管和肌肉舒张过程中 主要信号分子的研究成果获得了1 9 9 8 年的诺贝尔生理医学奖。目前已证明在原 生动物、细菌、酵母和植物中，n o 也作为一种普遍存在的信号分子而起作用。 植物体内产生n o 是通过类似于哺乳动物n o 合酶( n 0 s l i l 【e ) 、硝酸还原 酶( n r ) 和或非酶促反应3 条途径完成的。n o 作为植物生长发育的一个关键 调节因子，能对各种生物或非生物胁迫产生应答，在植物生长发育与环境互作的 协调过程中起到中枢性的作用。但是，由于缺乏分子遗传学提供的信息，人们对 n 0 在植物体内的生物学功能多局限于对现象的观察和描述。 本文采用分离和鉴定n o 相关突变体的遗传分析策略对n o 的分子功能进行 深入研究。 在高浓度n o 处理下，我们筛选到一株对n o 较不敏感的拟南芥突变体，在 野生型拟南芥生长己被抑制的情况下，它仍能较好地生长，故将其命名为删一j ( 加怄础矽j ) 。基因图位克隆结果表明，删j 突变等位于口啤，j ：一个已 知的具有较高内源细胞分裂素含量的突变体。据此，我们对s 堋j 突变体对n o 不敏感的机制进行了详细的剖析 不久前报道n o 抑制拟南芥花的转变，内源n o 含量高的突变体慨j 开花 延迟我们发现具早花性状的删n j 突变体中n o 含量低于野生型更令人感兴 趣的是，彻妒j 磁j 双突变体中n o 的含量比加x j 明显降低，开花时间也显著提 前该结果暗示：高浓度的细胞分裂素抑制了n o 延迟开花的效应。而且，外源 细胞分裂素的施用逆转了加x j 由于内源n o 含量高而导致开花延迟的表型，并 表现出剂量依赖性特点。同时，从分子水平上证明了开花抑制子兄c 和开花促 进子刀的表达和这些开花性状完全一致。 为进一步解析高浓度细胞分裂素拮抗n o 作用的分子机制，我们用理化方法 检测了n o ( 植物体内常以0 1 姻。一的形式存在) 和玉米素直接反应的可能性 高效液相色谱、质谱和核磁共振分析结果表明，n o ( o n 0 0 厂) 能与玉米素直接 中文摘要 发生化学反应，将作为其基本结构的腺嘌呤基硝化，生成8 一硝基一反式玉米素 和n 6 一亚硝基一反式玉米素因此，我们认为n o 和0 2 一在体内快速形成的 o n 0 0 一能和细胞分裂素发生化学反应，将n o 作为硝基( 或亚硝基) 传递给细 胞分裂素，导致n o 含量的下降。我们推测，在植物体内的生理条件下，细胞分 裂素通过与n o 的直接反应维持二者的相对稳态平衡；同时，细胞分裂素通过清 除n o 而发挥了抗氧化剂的功能，使细胞维持相对稳定的氧化还原状态，这对于 植物的正常生长发育是十分重要的。 另外，采用药物学、生理生化和分子生物学技术，进一步分析了n o 对细胞 分裂素受体突变体和3 强c d 3 ；j 转基因拟南芥的生长发育等方面的影响，结果 表明，n o 作为信号分子在细胞分裂素下游起作用的可能性不大 总之，来自遗传学、分子生物学、细胞生物学、生理学和生物化学的证据表 明，在拟南芥中，极有可能通过n o 和细胞分裂素的化学反应( 硝化反应) 来维 持植物体内n o 含量的动态平衡，并调节其在开花信号途径中的调控功能。这是 n o 和植物激素之间相互作用的一个独特机制，即通过化学反应来维持两者的相 对平衡，然后触发和维持相关信号途径的运行，保证植物的正常生长和发育。 关键词：拟南芥，一氧化氮，细胞分裂素，基因图位克隆，开花，质谱核磁共 振分析，硝基化，信号转导 英文摘要 a b s t r a c t n i 扫r i co x i d e ( n 0 ) i sab i o a c 6 v em 0 1 e c u l 岛姐di n c r e 勰i n g 州d e n c e 枷i c 捆t l l a tn o i s eo ft h em o s t 埘d 鹤p r e a ds i 驴a l i i l gm o l l l l 铅i nl i v i i i go 增舢蛐s n ow 勰 o r i g m a l l yf o u n d 缸m 锄姗i a l st o b eam 旬讲m 韶明l 培口i nt h ep r o c e s s 鼯o f v 酗o r c l a x a 吐o n 赳l dm u s d er e ：i a x a t i o i l ap i e c co fw o i kt l l a tw t h en o b dp 矗z e 蕾b f p h y s i o l o g y a n d m 础c i i n l 9 9 8 n h 勰b c e l l s h o 、m t h a t n oa l s oa c t s 鹪a 曲i q i | i 幻吣 s i g n a l i l l gm o l c c i l l ei np 咖加嘎b a c t e r i a y e a s t 纽dp 1 粕蚀bp l 锄t s ，t l 】ep 1 o d l l c d o f n oh 勰b 嘲s n 埘i e d 矗) f 辩嘲ld e c a d 髓n oi s 姗c e d d o g 姐。璐l yi np l a n to c l l s ， p s i b l yv i a 柚i m a ln os ) m l h a ( n o s ) - 1 i k ep i o t e i 衄，n i 由陷t er e d u c t a s 鼹，越l d ，b r n o n 跚町啦a t i cr c 吐。璐n oi s 曲0 1 v 。di nt h e 倒a 矗o no f g r o w l h 姐dd e v e l o p 忸饥t ， 翩di n 也er e s p 0 哪et o 曲i o t i c 姐db i 嘶cs t r c s s 瞄h o 硎 v 0 l i r 瑚m 穗t a 】1 d i n go ft h e p h y s i o l o g i c a lf h n 嘶o no fn 0 i np l 柚t si sl i i n i t c dt 0p h e n 咖e l o g i c a l0 b 鳓w 鲥o n s d u et o 也el a c ：ko f m o l e c u l 缸g e n 甜ci n f o m l a 矗o n m m y t 置l e s i ss t l 】d 弘w es c i 嘲o df b fn oi n s 鲫i t i v em u t 锄t sa n df o m l dj f ，d j 嘎g 埘l d 匆r j djo 研d h i 垂l e v e lo f 懿o g e 璐n oj l 】h i b i t e dm e 鲫瑚恤o f 谢l dt y 】p e 加w 6 l d 咖缸p l 觚协b l l t 埘缸t h ej 埘l jm m 蛆t w bi d 蒯矗e dm em u t a 吐o no f 蹦n j 、，i aa m 印p 培b 勰。dd o n i n ga p p l j 阻i h ，a n dr e v e a l c dt h 砒删“i sa l l e l i ct o 口，印j ，al m 倒m 删j 切呲谢t h ah i 曲1 w do f p i 锄t h 0 加伽e c y 吲姚w 色h a w t l l c h 躲i c t 蒯也e m 优h 锄i 锄m l d c f l y i n g 也en oi n 鼬n s i 矗v i 哆o f j 埘ji nd e t a i l s nh 够b 嘲r 钠r t 。d 班鲥m l s l yn l a tp l 距t s 仃t ：曲c d 稍t hn o 姐dj v dd 坩霉m 出鲫。j o 似j ) 删n a n t sn 啪dl a l c w b 白u n d t 1 1 a tt l 坞n 0l e v do f j 堋jw 鹬s l i g l yl o w 盯 l h 锄w i l d - t y p 晦锄dm a l 血em 矾jm u 乇a n tn 旧r e dd f 蒯c a l l ye 训yc o n s i s t 锄t l m 也e ，l 耐s 柳jd o 曲l e 加l h m ts h o w c da1 0 wl “d “n 0o 伽叩鲫e dt ot h a ti n 臃j ，a n d n 嗽日勰e a r l y 勰肌坍j ，印韶脚n g t h a th i g hc y t o 虹1 i n 8 鲫孵s e d n o 硎o ml i l a d d i b o n c y t 0 虹n i 璐托u 。dl a r g d yt h e 加订1 a t en o w 晌g 垂h 伽o t y p ej n - d o s e - d e p d e n tm a 蚰既w bh a v ef i | n l l 簋s h o w nn l a ln 嵋既e 韶i o f ，上an 啪l r l 叼m s s o qa n d ，z 矗n o r a lp n ) l n o t e f w 讹w e nc o n 试a t e dw i t hn l e s en o w 响g p l 砌t y p c s 英文摘要 t oa s s e 鹳缸t l 财t h em o l e c i l i 盯删沛髓i s mb y 讲i i c hh i 曲l 州do fc y 瞄r 血i 璐 锄止嘈嘶z 瞄圮a c t i o no f n 0 ，w eu s e dac h e m i c a l 珥，p m a c ht oe x 锄w h “h 盯n o 觚d c ) r t 0 垴n i 瑚坞a c t e dd i c n y 加咖h l t e ：陀嘶n g i y ，w ef o l m dm a te x c 髑面v en oi l i 协| l i e d a d 鲥岫g 耐叩o f 删i l i l l st l l 址卸陀a d e l l i 捌v a t i v 嚣t h u s ，w ep m p o t h a ln o 锄d0 2 一触mp m x y n i 伍t e 抽v 加，删c ht 1 1 m o d i f i 盥c y “d n i 璐b yn i t r a t i n gt h e a d i n eg r o u p ，l 船d i n gt ot l l e d u c t i o f d o g e 璐n ol e v e l 1 k 矗n d i n 铲a l i m p l y l h a tc ) 恂i k i n i ma 枷o 】【i 出吼c s 曲d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i 畦o n sv i a a c t i n g 勰n o s c a v e n g e 猖 1 ke m ：c t “n o v e g e t a t i v c 铲a w i h ，n o w 锄g 雠l 鹤姐dn 懿p r e 姻i o f 0 d ”；ji nt h ec y t o i c i n i n ，e p t o r 删n 舭t sa l l dm e3 强0 3 j j 缸a n s 鲫i cp l a n t s i n d i c a 主e d 也a t n o h 嬲n od i r e 耽l e i n 雠p r i m a r y c y t o k i i l i ns i 朗a l i n 辱 h n c l u s i o n ，w eh 孙r ep f o v i d o dg 胁e t i c ，m o l e c l l l a r ，c e l lb i o l 晒c a l ，p h y s i o l o 百c a l ， a n db i o c h 印1 i c a i 硎d 锄c e 幻s h o w 吐l a tn oi i l 细徼t s 硒t h 聊。虹n i 邶m o s tl i k e l y 曲加u g hn on i 仃 出n gc y t o l c i l l i 船f 盯t h e 伍_ s t 硒e ，w ch v es h o w nam l i q l l e m 烈b a l l i s mo f n o - h o 瑚o n ei i l t e 朔c 吐o ni np l 柚t sb yw 1 1 ic ：h 协，ob i 0 i n o l 鲫i 嚣伽咀l b 硫 t o 蕾妇a n 鲫p r o d u 吐v i a a c h 锄i c a l 枷o n k e yw o r d 毫：4 阳6 f 蚴，妇，n 硒c 慨i d e c y t o k i n i n p o s i n 伽l a ld 伽【i l i 舀f l o w e 曲& l c 4 讧s ，n m rn i t r a t i i 骣s i 驴a l 位咖d u c t i o n 兰堕壁堕亘一三 a b a a h k 珊，妒， a r r 彳f n o s 剖p r c g m 咿 c h s c k x d a f j 2 d a g c g s n o g s t h h 2 0 2 h p l c h r 口t j a l 鹕 l c - m s m i - n a m e l a p k 髑 m m a b b r e v i a t i o n a b s 西s i ca c i d 彳朋院却凼h i s t i d i n eb n a n l l e 删m e 确f e mp m g m mi 彳，4 脚d 唧盘r e s p o n s er e g u l 栅 4 m 脚妇n i 仃i c o x i d cs ”t l l a 酬i c a d p i i l ) o 3 ，5 州i c 目珈1 0 s i n em o n o p h o s p l l a t e c ：h a l c o n e 町，t h a s e c ) t o k i n i i lo 】【i d 鹊踟e h 如g 朗雠 4 。5 埘黝i l l o n u o 崩o e i l ld i a c e t a t e g 啪y l y lc y c l a s e n i 缸d g l u 例抽o n e g l u t 砌o n e - s - 嘶f 甑s e h o h 加g 吼p e f o x i d e h i 曲岬啊f o 册撇l i 删dc h r o m a t o g r a j p h y h ) p 髓删矗、，c 托印伽 i 鲫p 既删仃a n s f e 澈 j 瑚o n i ca c i d l a r l 洳 l i q l l i d 曲m a ：i o 脚y - t a 】帕既lm a 鼹s p 缸粕鼬r y i ，- c i 仃l l l l i n e 灿b 扣l a r 】咖j i l em 甜i y l 嚣c 玎，an o si n h i b i t o r m i t o g 枷v a t e dp f o t e i nk m i m m 口h o l i n o c i ：h a i l 嚣l l l 删ca d d ，m o l 帕蝎1 妣 m i n u t e 缩略词 m s m 以m 4 2 n h 假 n o n o s n o x l n r n r 0 r o n 0 0 - p 札 p c d p r 1 y 兀0 r n s r o s s a s a r s n p s o d t m v w t m c d i 哪，m 删g e 柚ds k o o gm 。d i 啪 i l i n a t e “翊u c t a s ed o u b l em u t a n t 姗c l 甜m a 印e t i cr c 戳m a n c c n i 砸co x i c l e n i 砸c 【i d es y n m 勰e n o h y p 竹s e 砒缸如el n i 缸疵o d l l c 协e n i h a t c 础c t a 越砷e 】【i d ea i l i 蛐 p e x y n i 埘t ei o l n p h e n y l a l a n i n e 缸l m i al y a s e p r o 掣猢e d c e l l d 髓t h p a t h o g 鹤i sr e i a t o dp f o t c i n 2 一p h 髓y l - 4 ，4 ，5 ，5 蛐e t l l y l i l l l i d 锄l i i l 争1 o x y 3 - 0 x i d e r e a c t i v en i 们g s p c c i 鹤 托a c t i v eo x y 掣ms p e c i 嚣 s a l i c y l i ca c i d s y s t e m i ca c q u i r 。d 删s t a l l s o d i 啪n i 协哪盯玛s i d e 飘l p 蒯d ed i 鳓珊t a t o b a o m o s a i cv i 瞄 词d t y p e 2 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名训研 日期妒7 年彳舳 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出 版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名。剜 日期：撇肉 首都师范大学博士学位论文 1 文献综述 n 0 ( n i t r i c 伽d e ) 是自然界发现的最小的分子之一，生物学家很早就关注 它在植物和微生物氮循环中的重要作用。1 9 8 0 年前后，当研究者们发现n 0 不 仅能在哺乳动物细胞中合成，而且还参与人体许多极为重要的生理和病理过程 ( b r o d t 孤ds n y d 1 9 9 4 ；d a v i sc ta 1 ，2 0 0 l ；pa _ 伊吣s a te ta 1 ，2 0 0 2 ；p a 印瑚s a te ta 1 ， 2 0 0 3 ；p 增m l s s a te ta 1 ，2 0 0 4 ) ( 如记忆、糖尿病、癌症和药物上瘾) 后，引起了人 们巨大的研究兴趣。1 9 9 2 年，5 c 缸胱将n 0 评为1 9 9 2 “年度分子”一一“m o l 伽l e o f 艟m ”；1 9 9 8 年，三位美国科学家( f i 础g o t c ，m 晡l d ，和i 弘a n o ) 因发现 n 0 是心血管系统内皮舒张相关的一种信号分子而获颁了1 9 9 8 年的诺贝尔生理， 医学奖。这些成果促进了人们对其他生物( 包括植物) 中n o 信号系统的研究。 目前人们已认识到：n o 是生物体内分布极为广泛的信号分予之一，除哺乳动物 外，n o 在原生动物、细菌、酵母和植物中也作为一种普遍存在的信号分子而 起作用。在植物中，对n o 的研究主要集中在( 1 ) n o 的产生；( 2 ) 生理功能 和( 3 ) 信号转导三个方面c k g n i 觚dl a m a t 血a ，2 0 0 l ；w 抽d c h 黜e ta 1 ，2 0 0 1 ； i 棚n a 埘n ac ta 1 ，2 0 0 3 ；l 孤曲e f ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 1n o 在植物体内的产生 关于n o 在植物体内产生的研究已经进行了几十年。第一次在植物体内观察 到n o 的产生是e p p e r 等人在用除草剂( 日印p 1 9 7 5 ，1 9 7 9 ) 和水杨酸( 日e p p 1 9 9 1 ) 处理大豆时发现其叶片能够释放出n o 气体。从那以后，尽管对植物体内 n 0 的合成进行了广泛的研究，但对植物细胞内n 0 的来源仍然存在较大的争议 目前比较清楚的是n o 能在植物细胞内内源产生，可能通过( 1 ) 类似于动物的 n o 合酶( n o s l 龇p t e i 地) ，( 2 ) 硝酸还原酶( n i h 砸e 如c t a s ) 和，或( 3 ) 非酶促反应( 邶n z y m 鲥c 僦c t i o n s ) 三条途径完成( 见图1 ) 首都师范大学博士学位论文 1 1 1n o 合酶( n os y n t h 嬲e ，n o s ) n o 的酶促合成按照以下的反应进行：l a r g + n a d ( p ) h + i r + 0 2 一l 正m + n a d ( p ) + + n o ，是一个依赖于l a r g ( a r g i i l i l 静d e p c i l d e n t ) 的n o 合成途径。 在哺乳动物细胞中，已经鉴定了三种同工型的n o s ( u 删1 a ln o s n n o s ， d o n l c l i a in o s e n o s 和i n d u c i b l en o s i n o s ) ( l a m a 仕i n ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在植 物中是否存在类似于动物细胞中的n o s ? 生物化学分析表明植物组织提取物中 能检测到依赖于l 广a r g 的l c i 仃和n o 合成活性( 即存在l - a r g 向【广c 妇和n o 的转变) ，这种活性能被哺乳动物的n 0 s 抑制剂( 【唱类似物，如l n 舢订e ) 所抑制，抑制剂不但阻断了n o 的形成而且阻断了n o 介导的一些反应，如a b a 诱导的气孔关闭( c u 咖e ta 1 ，1 9 9 6 ；n i 锄柚缸dm a i 1 9 9 6 ；b a r r o e ta 1 ， 1 9 9 9 ；d 啪嚣锄d 日鹊s i g ，1 9 9 9 ；贴e i r oe ta 1 ，1 9 9 9 ；w 曲d e h 锄ec ta 1 ，2 0 0 1 ) 电子 显微免疫定位分析表明这些n o s l i l 【e 蛋白可能定位在细胞质( 鼬b e 砷e ta 1 ， 1 9 9 9 ) 、过氧物酶体、叶绿体和细胞核( b a r r o s o 髓a 1 ，1 9 9 9 ；贴e 妊。矗a 1 ，1 9 9 9 ； c 唧勰c ta 1 ，2 0 0 4 ) 中。这些结果表明植物中具有动物细胞n o s 的同源物。免疫 学实验也显示哺乳动物n o s 的抗体( a r n i - m a m m a l i 观n o s 锄b b o d i 哪能和植物蛋 白发生免疫交叉反应( w e s t 锄b l o t 技术) ( b a r r d da 1 ，1 9 9 9 ；砌b e i r oe ta 1 ，1 9 9 9 ) ， 但b u n 等人u 仕e ta 1 ，2 0 0 3 ) 的蛋白质组学分析又表明和哺乳动物n 0 s 的抗体 发生交叉反应的植物蛋白和n o s 无关，这些蛋白是热激蛋白和糖分解的酶。另 外，c m w 自r d 研究小组( g l me ta 1 ，2 0 0 3 ) 从拟南芥( 彳阳6 翻哪由舶肠加) 中发现 的不同于哺乳动物n o s 的n o 合酶( a l n o s l ) 的功能遭到质疑( 世界上有5 个实 验室在“重复实验”中检测不到a i n o s l 的活性) ( z 蹦l o j t de ta 1 ，2 0 0 6 ) ，c w 雠 等人( c 埘椭) r dc ta 1 ，2 0 0 6 ；g u o ，2 0 0 6 ) 因而将该基因重新命名为l 刎j 画t r i c 鲥d e 3 s o c i a t e d1 ) ，以避免和动物的o 雷混淆虽然如此，至今还有证明植物中 n o 合酶活性( n os ) 匿i 也a a 蕊v i t y ) 存在的报道( c 唧鹊e ta 1 ，2 0 0 6 ；j 勰i de ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。如c o r p 勰等人( c 唧勰e ta 1 ，2 0 0 6 ) 用一种对n o 更敏感和特异的基于化 学发光的薪方法( o z 纠h t 执i l u m i n i s c m e l l l o d ) 分析了在豌豆幼苗生长发育 过程中，叶、茎和根中内源性n 0 的生成，在这三种豌豆器官中检测到了组成型 的、依赖于l a r ：g 的n o s 活性( a r g i n i - d e p 锄d e n tn o s 鲫瞳v n y ) ，并且这种n o s 活性对氨基胍( 锄i g i l a l l i d i n c ，一种不可逆的动物n o s 抑制剂) 敏感；同时还 证明n o 主要在维管组织( 木质部) 、表皮细胞和根毛中合成和积累，叶片中n o s 2 首都师范大学博上学位论文 的活性最低。看来，植物中n o s l i k e 蛋白的存在似乎毋容置疑，但目前尚未从 拟南芥中发现具有确切n o s 功能的基因或蛋白，而且在拟南芥菜基因组中也未 能发现动物n o s 的同源物( t h ea m b i d o p s i sg o m eh l i t i a t i v e ，2 0 0 0 ) 。所以n o s 的活性令人困惑! 植物n o s 研究领域仍然充满挑战，同时存在重大突破的机遇。采用生化分 析和巧妙的筛选策略分离相关突变体仍然是值得思索和实践的有效途径。 n og e n e r 乱l o ng y 科e m s n 。，。，e 一- 一。 n 言、- n 。n 。n ：v m 。c r e d u c t a s e g y n t h a s e ，f o r m a t i o n 。、；。 s t o m a t a ic i o s u r e 一 n ( ) s e n e s c e n c e 卧o t o m 。懈i s7 i m 岫 g e r m i n a t j o n 上 a b i o t i c & b i a 哪c r o o tg r o 、 h s t r e s sr e s p o n s e s 图1 n o 在植物中的合成及功能 f i 印n1 n l cb i o s y n l l l 髓i s 锄df i h l n i 蛐o f n 砌co x i d c ( n o ) 佃p l a 吣， 1 1 2 硝酸还原酶( n i t r a t em d u c t a s e ，n r ) 从上世纪8 0 年代中期始，几个研究小组的结果就表明植物中的n o 能通过 硝酸还原酶生成( d e a na n dh a r p 1 9 8 6 ；e p p e r ，1 9 8 7 ) 。硝酸还原酶( 位于胞质) 通常催化硝酸还原为亚硝酸，但其大约l 的活性( 表现为亚硝酸还原酶的活性) 能利用n a d h 作为还原剂进一步将亚硝酸还原为n 0 f y 蚰l 粥a l 【ie ta 1 ，1 9 9 9 ) ，但 这个活性和质体中亚硝酸还原酶( n i r ) 的活性不同，后者利用6 个电子将亚硝 酸还原为铵。在无氧或缺氧条件下，植物通过硝酸还原酶生成n 0 已在完整的植 首都师范大学博士学位论文 物( 、) l q t a s z d ，2 0 0 0 ；k a i s 盯a n dh i m 盯，2 0 0 l ；w 酬c h e m 坞e ta 1 ，2 0 0 1 ) 、叶片( d e 锄 锄dh a m 1 9 8 6 ；印p 盱1 9 8 7 ；r o c k dc ta 1 ，2 0 0 2 ) 和根( s t o kd a 1 ，2 0 0 1 ) 中广泛 地观察到，利用纯化的酶( n r ) 也能检测到n 0 的生成m m 锻l k i 弛ds a l 【i h 锄a 2 0 0 0 ；r o c k e l 或a 1 ，2 0 0 2 ) 。目前，n r 是植物中唯一确认能够形成n o 的酶，故它 成为植物体内信号转导和防御反应中产生n o 的主要候选酶，已有许多实验证据 把n r 和n o 的信号转导作用联系起来( d 鼯i 】【mc ta 1 ，2 0 0 2 ；v a 血e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。看 来，通过硝酸还原酶生成n o 可能是植物n o 的一个主要来源似c y 盯e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 另外，有一些报道认为除胞质n r 外，还有一些酶系统参与亚硝酸还原为 n 0 的过程。如在根中，与质膜相结合的一些酶系统( n i 砷【e ：n or e d u c t a s e ) 在 n a d h 存在时能把亚硝酸还原为n o ( s t o b re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。最近几项研究结果还表 明植物线粒体也和动物细胞一样，能将亚硝酸还原为n o ( 丽s c h n 盯髓a 1 ，2 0 0 4 ； p l 趾d 瓣c ta 1 ，2 0 0 5 ) ，线粒体电子传递链的抑制剂抑制n o 的生成，说明来自于 线粒体电子传递链的电子能够驱动亚硝酸还原为n o 。n r 在此过程中的作用还 不十分确切，可能因氧的供应状况而异。 其实，这些过程都可归结为依赖于亚硝酸的n o 形成途径( n i 仃i t e d 印m d e n t p a n l w a y ) ，利用n a d h 或者“电子”作为还原剂，通过不同的酶的催化形成 n o ：n 0 2 一+ e 一+ 2 i + 一2 n o + h 2 0 。 1 1 3 非酶促n o 形成 在没有任何酶存在的情况下，硝酸盐溶液能够自发释放出n o ( c 脚l c ye ta 1 ， 1 9 9 娜，这一事实对于生物组织中n o 合成的比较分析来说是至关重要的在植 物中，n o 也能通过非酶促机制产生( c c 啪眄e ta 1 ，1 9 9 4 ；d 啪盯粗d 髓s i 舀1 9 9 9 ； w 黜蛐触犯e ta 1 ，2 0 0 1 ) ；2 h n q + + n o + n 0 2 + h 2 0 2 n o + l 2 0 2 + h 2 0 在酸 性条件下( p h 、卜t，3一芏西19西量口oo 首都师范大学博士学位论文 除对n 0 较不敏感的性状外，我们发现j “n j 突变体还表现出多子叶、丛生、 较快的叶片起始速率和早花等性状( 图9 和1 0 ) 。 因为筛选得到的j “n j 突变体来自于t i v a t i 一切【g g e dp o o l ( w e i g e le ta 1 ， 2 0 0 0 ) ，首先应该确定突变形状是诱导基因过表达引起的还是t - d n a 插入导致的 基因功能缺失性突变。将遗传稳定的s “n j 突变体与野生型c 0 1 o 互交，所有的 f l 代植株都表现出野生型性状( 包括对n 0 处理的敏感性) ；在f 2 代植株中， 分离出约1 3 的突变体植株( 表现为多子叶、丛生和对n o 较不敏感) 和约2 3 的野生型性状植株( 包括对n o 的敏感性) ，占检验表明符合孟德尔遗传分离规 律( 图1 2 ，c ) ，说明对n o 较不敏感的突变形状是单基因控制的隐性突变性状， 该突变是d n a 插入导致的功能缺失性突变。 图8 不同浓度s n p 对w t 和s 枷j 突变体开花时间的影响。 ( a ) w t 和删月j 在1 6 h 光照铀黑 暗光周期条件下，在含有不同浓度s n p 的培养基上生长2 5 天时的开花情况；( b ) s n p 浓度对w t 和册j 开花时间的影响；( c ) s n p 浓度对w t 和$ m 开花时叶片数的影响。 h 鲫n & t h c e 丘鳅o f 锄n 0 d 伽盯s n p 伽n o w c d 鸩“m 船i n w t 朋dj “h ， 首都师范大学博士学位论文 圈9 m s 培养基上生长7 天的、t 和j 州j 突变体表型。( a ) 野生型，两片子叶( 唧c m cd i i ) ；( b f ) 具不同子叶数目和性状的硼n j 突变体，( b ) 杯状子叶( c u p - s i l a p e d 酬c d 明) ；( c ) 扩大的 单子叶( al a l 蓼m o 叫c d 帆c o 叫e d o n ) l ( d ) 不对称的双子叶( a 唧c t r i cd i c o o ；( e ) 三子叶 ( t l l 纠砷l c d o n ) i ( f )四子叶( f 0 1 l 呻l e d o n ) 。b 4 r 产l 姗可以看出j 枷j 突变体叶片的起始速率 比w t 快。 f i 蚪他9 w t 锄d j 删，s e e d l i i l 笋g 舶n i n a t e d i n 伽i t u 他f 研7 出” 4 2 ，州f 基因的克隆与鉴定 图位克隆的b s a ( b u l k c ds e g r e g a n ta l l a l y s i s ) 分析( 图1 1 ) 发现，在第一、 二、四、五条染色体上的几个分子标记，其杂合体对照与s 姗j 突变体之间c o l 和k 扩增产物的比例基本上是相同的，表明突变基因与这些位点都不连锁。而 在第三条染色体的c i w 4 和n g a 6 两个标记处，很明显s “栉j 突变体只有c o l 特异 的条带，从而可以判断出这个在c o l 中产生的突变基因是和c i 、4 和n g a 6 两个位 点相连锁，根据这两个分子标记在染色体中的位置可以知道，这个突变基因位于 拟南芥第三条染色体短臂上的c i w 4 和n g a 6 两个分子标记位点之自j 。 首都师范大学博士学位论文 c e b 一4 知i i o “p 4 舒一略 f 图l0 内源n o 和内源细胞分裂索含量的变化影响拟南芥的开花。( a ) 1 2 h 光照1 2 h 黑暗光周期 条件下，在营养土中生长5 0 天的w t 、j “n j ，4 棚p j 、册妒，肿口j 双突变体和 甜5 种植株的表型， 可以看出4 耕芦j 袱，双突变体的开花时闻明显比n 麟l 早；( b ) 5 种植株的地上部分鲜重比较：5 种 植株在1 6 h 光照，8 h 黑暗光周期条件下的开花时间( c ) 和叶片数( d ) 比较；5 种植株在1 2 h 光照1 2 h 黑暗光周期条件下的开花时问( e ) 和叶片数( f ) 比较。 n g n1o t h cv 撕a l i o f 蛐d o g 朗。哪n o 锄d 哪o k i n i i li 州l s a 疗b c tn l eo n s e to fn o w 甜n gi n m m d 哆出， 当我们对距离突变位点较近的两个分子标记之间的1 3 个具有突变性状的基 因( m e i i l k ec ta 1 ，2 0 0 3 ) 进行分析时，发现口 妒j 突变体( c h a u d h u 哆c ta 1 ，1 9 9 3 ； h e i l i w e i le ta 1 ，2 0 0 1 ) 与s 堋j 突变体的性状极其相似，如多子叶、丛生、早花和 上工i 1日fi跏一墨耋 i再薹譬i羞l差皇詈 首都师范大学博士学位论文 较快的起始叶片速率等，册妒j 突变体也表现出对n o 较不敏感的特性( 图7 ) 为确认鲫l p j 突变体和跚一j 突变体是否是同一基因突变造成的，将蹦开j 突变体 和鲫妒j 突变体杂交( c 鲫) ，所有的f l 代植株都表现为j 研j 表型。另外，发 现s 堋j 突变体的p c r 产物检测不到a 炉j 基因( 因其是t d n a 插入造成的突 变) ，而4 碑，j 突变体中能够检测到a 护j 基因( 因其是点突变) 据此，我们认 为j 研j 和4 m p j 为同一基因突变所致( 图1 2 ) 。 图l i 删，突变体的b 鲋- 分析( 翻l l h d 冀簪e 譬锄t 锄a l y s 砷图中示出的是每个s s l pm 舢k c f 的p c r 产物；每张电泳图的左泳道是杂合体对照，右泳道是以船h j 突变体的帆p o o l 为模板的p c 飘产 物； 嚷示叫所特有的条带可以看出，舢j 突变与d _ 4 和n 辨6 连镇，表明蹦_ j 突变位于染 色体3 上的分子标记d w 4 和n 弘6 之甸 h 蚪nn 融i n d 朝印警t 柚4 l y 摹i o f 彻j 咖n 棚。啦 柏 首都师范大学博士学位论文 采用分段p c r 的策略，确认s 堋j 突变是由于t _ d n a ( 来自p s k l 0 1 5 ) 插入 到爿 俨j 基因第五个外显子末端造成的( 图1 2 ) 。 a 咖o m 3 c i w s u n l n g a 6 1 6 4 删 5 4 洲 c d c 2 ba m p l p u r 5 c 筹詈徽产 f mo v v r 囊耐 f 25 1 2 1 3 f 1 0 o m “m n3 2 1 们f x ，m ，f 1o2 1 一 。如哪埘嘶抽d 竹稆bo | 卅r 纠剃h _ l 州删k 图1 2 基因克隆表明舡w ，等同于一 伊j 。( a ) s 啪位于第三条染色体上的c i w 4 和n 驴6 两个分子 标记之间，t d n a 插入到姗基因的第五个外显子末端。两个等位突变唧j 和的突变位点也在 图中标出。黑框表示外显子，黑线表示内含子。( b ) p c r 分析表明w t 和4 珥p j 突变体( 点突变) 中 能够检测到一 护j 基因，而翩h j 突变体( t _ d n a 插入) 中检测不到一埘，j 基因。( c ) 遗传分析表明 s 【刀w 等同于埘，蹦 j 突变是一个单基因控制的隐性突变。 f i g u 陀1 2 m 印b a s e dc l 叩i n gr c v c a l s t l l a t s c w ，i s i d 舶n c a l t o 一 护j 口 l p j ( 口豇e 删所e 廊细”p 删e 即m ) 突变体最初是根据其子叶数目和叶片起始 速率增加而分离得到的( c h a u d l 】u r ye ta 1 ，1 9 9 3 ) ，和翩，l j 突变体一样，表现出多 效性状( p l e i o 仃o p i cp h e n o 咖e s ) 。如茎尖分生组织( s h o o t 印i c a lm 舐s t e r 璐) 体积 增大、细胞增殖( c e l lp m l i f b m t i o n ) 和营养体再生( v e g e t a t i v er e g e n e r a t i o n ) 能 力增强、多子叶、丛生、组成型光形态建成( c o n s 6 t u t i v ep h o t o m o 讪o g e l l e s i s ) 、 生活周期长、早花、半不育性( s e m i s t 谢l 时) 、内源细胞分裂素含量增加和细胞 周期蛋白c y c d 3 表达增强( 硒o u k h 锄l i c h ic ta 1 ，1 9 9 9 ) 等。丘 护基因编码一种具 4 l 首都师范大学博士学位论文 二肽酶活性的谷氨酸羧肽酶，参与蛋白质水解，但其在植物体内的功能尚不清楚。 这些多效性状的核心是该突变体中内源细胞分裂素的含量升高，是野生型的 6 - 7 2 倍( c h 卸d h u r yc ta 1 ，1 9 9 3 ；c l l i n - a 艏璐e ta 1 ，1 9 9 6 ；n o g l l 6da 1 ，2 0 0 0 l a ； h e l l i w d le ta 1 ，2 0 0 1 ) ，其他许多性状其实是由于细胞分裂素含量升高引起的。 n o g 等人饵d l i w e ue ta 1 ，2 0 0 1 ) 认为御删基因参与调控茎尖分生组织体积的 大小，该基因的突变导致茎尖分生组织体积扩大，而茎尖分生组织是细胞分裂素 合成的一个位点，其体积的扩大导致细胞分裂素合成的增加。 口叩j 是一个点突变，是第七个外显子中的一个g a ，导致终止密码提前 出现而造成的无义突变( 肿n s 融n l u t a t i ) 。根据性状的比较分析，由t - d n a 插入引起的j 堋j 突变是一个比口艟j 强的突变，其体内内源激素不平衡的性状表 现更为明显。如鲫l p j 的幼苗中，正常的双子叶仍能占到7 9 ( c h 卸d h m _ y 既a 1 ， 1 9 9 3 ) ，而s ”一j 突变体只有1 7 8 的幼苗具正常双子叶，其余的为杯状子叶( 5 4 ) 、单子叶( 6 8 ) 、不对称的双子叶( 1 4 9 ) 、三子叶( 6 4 1