




已阅读5页,还剩49页未读, 继续免费阅读
(生物化学与分子生物学专业论文)酵母核小体的进化研究.pdf.pdf 免费下载
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
巾山大学硕+ 学位论文 酵母核小体的进化研究 专业:生物化学与分子生物学 硕士生:曾宪锹 指导教师:王殉章教授,贺雄雷教授 摘要 核小体是细胞核中一种由d n a ( 脱氧核糖核苷酸) 和组蛋白组成的复合结构。 在细胞的基因表达调控中,它有着重要的作用。一直以来,对不同基因组区域的 核小体的分布的差异都有不同的解释:一种观点认为这种差异主要是由顺式作用 引起的,即该区域的d 晰列差异导致了核小体的分布差异:而另外一种观点 认为反式作用,即细胞内的各种调控因子在这种差异形成的过程中起了主导作 用。最近一些研究通过对酿酒酵母和鸡的核小体分布进行分析后发现,核小体的 形成存在很强的序列偏好性。例如,在启动子接近起始密码子的区域,往往存在 一个核小体富集的区域;而在鸡的实验中,研究人员将提取出来的基因组序列与 表达的组蛋白结合,再用微球菌酶进行切割后,测序后发现,大部分基因组区域 的核小体分布与原来是一样的。以上都说明在物种内的核小体分布的差异主要是 由顺式作用引起的。 然而,目前还未见有关于物种问核小体位置差异的报道。我们知道物种的进 化其中一个很重要的就是基因表达水平的变化。弄清楚影响物种问核小体同源基 因区域的核小体分布差异的机制,将有助于我们理解基因表达调控的进化,并且 能更好地帮助我们理解顺式和反式作用在物种进化中的作用。 因此,为了验证顺式和反式作用在进化中对酵母核小体分布差异的影响,我 们设计了如下实验。由本室陈智冬硕士从三个不同的酵母菌株3 6 1 ( s c e r e v i s i a e ) i i f i 山大学硕十学位论文 3 6 2 ( s p a r a d o x u s ) 3 6 3 ( 杂合子) 分别提取他们的核小体,并且用i l l u m i n a 公司 的s o l e x 彻4 序仪进行测序。测序结果返回后本人利用由华大基因开发的s o a p 软件对所有的测序结果进行定位和注释。同源性搜索综合打分结果,我们找到 2 6 3 2 个可以用来比较的有效区域。通过对有效区域的比较我们发现,大部分物种 间的核小体分布的差异都是由序列上的差异引起。这一结果提示,无论在物种内 还是物种间,顺式作用在核小体的形成中都发挥着重要的作用。 关键词:核小体分布酵母第二代测序技术生物信息学顺式作用,反式作用 i i i 巾山大学硕十学位论文 t h e e v o l u t i o n a r ya s p e c to fy e a s t n u c l e o s o m e m a j o r :b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l eb i o l o g y m a s t e rc a n d i d a t e : s u p e r v i s o r :p r o f e s s o r : a bs t r a c t t h eo r g a n i z a t i o no fn u c l e o s o m ep l a y sac r i t i c a lr o l ei ng e n er e g u l a t i o n w h e t h e r t h i sd n a - c o i l e ds t r u c t u r ei sd e t e r m i n e db yi t so w nn u c l e o t i d e s e q u e n c e ( t h ec i s e f f e c t ) ,o rt h er e g u l a t o r yf a c t o r st h r o u g h o u tt h ec e l l ( t h et r a n se f f e c t ) ,i sa l w a y sa c o n t r o v e r s i a li s s u e s e v e r a lp r e v i o u sw o r k sh a v es h o w nt h a tm o s to ft h en u c l e o s o m e c o m p o s i t i o n sw i t h i ns p e c i e sh a v eat r e n do fs e q u e n c ep r e f e r e n c e t h a ti st os a y , t h e d i s c r e p a n c yo ft h en u c l e o s o m eo c c u p a n c yi sm a i n l yc a u s e db yt h ec i se f f e c t y e tf e w h a v ee x p a n d e dt h i ss t u d yt ot h en u c l e o s o m ed i v e r g e n c eb e t w e e ns p e c i e s h e r ew e d e s i g na ne x p e r i m e n tt oe x t r a c tt h en u c l e o s o m ef r o mt h et h r e es t r a i n so fy e a s t , 3 6 1 ( s c e r e v i s i a e r ) ,3 6 2 ( s p a r a d o x u s ) a n d3 6 3 ( t h e i rh y b r i d ) r e s p e c t i v e l y , a n ds e q u e n c e t h i sp o o lo fd n aw i t ht w or o u n d so fs o l e x a w ef i n d2 6 3 2b l o c k sa f t e rt h e h o m o l o g u ea l i g n m e n tc o m b i n i n gt h er e l a t i v ef r e q u e n c yo fn u c l e o s o m ea te a c hs i t e o u rr e s u l t ss h o wt h a ta sw h a th a p p e nw i t h i ns p e c i e s ,t h ed i f f e r e n to r g a n i z a t i o no f n u c l e o s o m eb e t w e e ns p e c i e si s m o s t l yd u et ot h e i rn u c l e o t i d ec o m p o s i t i o n ,w h i c h i n d i c a t e st h a tt h ec i se f f e c ti st h em a i nf o r c et om a i n t a i nt h eg e n er e g u l a t i o nb o t h b e t w e e na n dw i t h i ns p e c i e s 。”山大学硕十学位论文 k e y w o r d s :n u c l e o s o m eo c c u p a n c y , y e a s t ,s e c o n dg e n e r a t i o n s e q u e n c i n g , b i o i n f o r m a t i c s ,c i s e f f e c t ,t r a n s e f f e c t v 中山大学硕十学位论文 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:、笮芬缪 日期:i p 年5 月e l 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版,有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅,有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索,可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名:督宪震 导师签名: 日期: p 少年 f 1 山大学硕十学位论文 1 1 引言 第一章前言 酵母菌是一类简单的单细胞真核生物的统称。它生长于富含糖分的环境之 中,比如一些水果像葡萄、苹果、桃等,又或者植物分泌物( 如仙人掌的汁) 中; 还有一些酵母生活在昆虫体内。除了生活环境的多样性外,酵母菌细胞的形态也 是千差万别,从球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形到藕节形等,不一而足。 但是一般的酵母细胞都要比细菌的单细胞个体要大得多,最小的一般都可以达到 1 巧微米,最大的可以达到5 - 3 0 微米。 酵母可认为是人类第一种“家养的微生物”1 4 1 。自远古时代开始,人类就开 始利用酵母进行各种产品的生产。据传在二千多年前的埃及,人们已经开始利用 酿酒酵母酿造啤酒;到后来的欧洲,酵母更是成为生产人们的主要吃粮面包必不 可少的原料。正因为这些原因,所以在巴士德最初开展微生物研究的时候,就选 择了酵母作为他的研究对象;在后来的遗传学和分子生物学研究中,又因为酵母 研究开展的历史最长,研究背景最为清楚,再加上容易培养、生活周期短并且与 高等生物生命过程的相似性高等优点,酵母就被作为一个模式生物进行很多f j i f 沿 研究。 1 2 酵母的系统分类 到2 0 0 7 年为止,有2 7 个酵母基因组被测序【2 4 1 。通过这些已有的序列数据, 研究人员运用生物信息学的手段找出每个基因组中的丌放阅读框,并且发现大部 分酵母基因组中不存在很严重的基因丢失和基因重复。亦即一个物种中大部分的 基田,都能在其他酵母物种中找到其相应的虹系同源基因。 在通过基因和基凼组序列构建的系统分类树中( 如图1 ) ,酿酒酵母 ( s a c c h a t o m y c e sc e r e v i s i a e ) 和奇异酵母( s a c c h a r o m y c e sp a r a d o x u s ) 是进化上紧 邻的两个酵母物种俐。他们分化时间很短,他们的单倍体细胞还能通过结合形 成二倍体的杂合体。并且该杂合体在营养生长不表现出明显的劣势,由此可i = 卫看 出他们的在进化上的关系有多么的接近。 。鹱鞠 _ - 、 丽- 雌二粤三挚雪闺 、 j 趸一一i 圄0 1 i 习 1 3 酵母的基因组 1 3 1 酿酒酵母的基因组 酿酒酵母作为酵母菌的代表菌株,是众多酵母中被研究的最为清楚的一个物 种。所以人们对酵母基因组的认识,也是从酿酒酵母开始的。 在酿酒酵母测序计划丌始之前,人们通过传统的遗传学方法已确定了酵母r p 编码r n a 或蛋白质的大约2 6 0 9 个基凼。通过对酿酒酵母的完整基因组测序, 发现在1 2 m b 的全基因组序列中有5 8 8 5 个编码争一性蛋白质的丌放阅读框。这 意味着在酵母基因组中平均每隔2 k b 就存在一个编码蛋白质的基因,即整个摹凼 组自7 2 的核恃酸顺序山丌放阅读桁组成。这说【扪酵母丛凶比其它新锋真核l 【f i 山大学硕十学位论文 物基因排列紧密。如在线虫基因组中,平均每隔6 k b 存在一个编码蛋白质的基因; 在人类基因组中,平均每隔3 0 k b 或更多的碱基才能发现一个编码蛋白质的基因。 酵母基因组的紧密性是因为基因问隔区较短与基因中内含子稀少。酵母基因组的 开放阅读框平均长度为1 4 5 0 b p 即4 8 3 个密码子,最长的是位于x i i 号染色体上 的一个功能未知的开放阅读框( 4 9 1 0 个密码子) ,还有极少数的开放阅读框长度超 过1 5 0 0 个密码子。在酵母基因组中,也有编码短蛋白的基因,例如,编码由4 0 个氨基酸组成的细胞质膜蛋白脂质的p m p l 基因。此外,酵母基因组中还包含: 约1 4 0 个编码r n a 的基因,排列在x i i 号染色体的长末端;4 0 个编码s n r n a 的基因,散布于1 6 条染色体;属于4 3 个家族的2 7 5 个t r n a 基因也广泛分布于 基因组中。表1 提供了酵母基因在各染色体上分布的大致情况。 表1 1 酿酒酵母和奇异酵母染色体的人小 t a b l e1 - 1d i f f e r e n ts i z eo fc h r o m o s o m ei nt h es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n ds a c c h a r o m y c e s p a r a d o x u s 奇异酵母的基因组大小与酿酒酵母类似,总基因组大小为1 1 5 7 m b ;染色体 数目更是与酿酒酵母完全一样,并且每条长短也非常接近| 3 0 】。通过序列分析发 3 - 山大学颀十学位论文 现它们之间的序列差异性仅有1 0 左右,所以两者这种高度的序列相似性就为 我们进行比较基因组和进化基因组研究提供了便利。 1 3 2 第二代测序技术 自从s a n g e r 在1 9 7 7 年首次提出了d n a 的末端终止法以来,d n a 测序技术 的成本大大降低而他的测序长度却又大大地提高了。很多生物学的问题都依靠这 一技术的出现得n - j 长足的发展【3 n 。但是经过3 0 多年的发展,无论是成本还是 它的可测d n a 长度,s a n g e r 法测序都已经达到了它的极限。而这个时候就以罗 氏公司的4 5 4 测序仪为代表出现了一种全新的测序技术称为第二代测序技术,革 命性地将测序成本大大降低,并且令获取海量的基因组规模的核算数据成为可 能。 我们知道传统的s a n g e r 测序的基本原理是末端终止,即在测序p c r 扩增反 应的时候在末端掺入一种双脱氧核苷酸来终止反应。之后再通过聚丙烯酰胺胶的 电泳分离不同长度的d n a ,最后依靠不同的荧光信号来分别不同位置的核苷酸 序列。这- n 序方法当应用于单基因测序的时候是十分方便快捷的。但是由于 p c r 反应和荧光信号的特性,当测序循环进行到8 0 0 个碱基以上的时候,错误 的核苷酸比例就会超过2 0 然后令测序反应的荧光信号无法分辨。所以当我们应 用s a n g e r 法测序基因组或者基因组规模的数据的时候就必须将基因组打碎然后 通过构建克隆的方式对每一段序列进行测序,最后再将测序好的序列拼接起来。 然而构建克隆的成本往往是巨大的,如果是微生物基因组,由于比较小,为覆盖 基因组全部序列而需要构建的克隆数目还不算太多;但是当面对真核生物尤其是 高等动植物的时候,为覆盖全部基因组序列而需要构建的克隆数往往是一个不可 能实现的天文数字。 第二代新测序技术的创新之处在于减少了测序反应所需要的模板量所以省 去了构建克隆的巨大花费。所以当要测序基因组规模的数据的时候,测序每个碱 基所花费的成本就大大降低了。 目前主要的第二代测序技术有三种,一种是以罗氏的4 5 4 测序仪为代表的测 序技术,可以对每个片段测定5 0 0 b p 的长度,但是成本也相对较高;而另外两种 4 l ,m 牛峨十学”沦z 分别是l l l u m i n a 公司的s o l e x a 和a b i 公州的s o l i d 技术,每个债k 相对较短 但是成本也相对较低旧。f 图是s o l e x a 拉术的基本原理。 目1 2 s o l e x a 测序不意幽 f i g 1 2 t h ed i a g r a mo f i l l m i n as e q u e n c i n g p l a t f o r m 1 4 酵母的核小体分布 1 4 1 表观遗传学( e p i - g e n e t i c s ) 众所周知生物的遗传物质是脱氧核糖核酸( d n a ) 。而传统的遗传学脱点 认为,生物的表型足由生物的基凶型决定的。那就表示,如果阿个个体的基因组 序列是一样的话( 基| j ;j 型) ,理论上柬说他们的所有特征应该也是一样的( 表型) 。 而实际上,我们知道自然界中很多现琢都币符合返规律,例如码,驴l r 反变的 - 山大学硕十学位论文 后代差别较大;同卵双生的两人具有完全相同的基因组,在同样的环境中长大后, 他们在性格、健康等方面会有较大的差异,并不符合经典遗传学理论预期的情况。 这说明,在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况下,一些生物体的表型却发生 了改变。同时还发现,有些特征只是由一个亲本的基因来决定,而源自另一亲本的 基因却保持”沉默”。人们对于这样一些现象无法用经典的遗传学理论去加以阐 明。于是就发展了表观遗传学这一新兴的学科。 比较通俗的讲表观遗传学是研究在没有细胞核d n a 序列改变的情况时,基 因功能的可逆的、可遗传的改变。也指生物发育过程中包含的程序的研究。在这 两种情况下,研究的对象都包括在d n a 序列中未包含的基因调控信息如何传递 到( 细胞或生物体的) 下一代这个问题【2 5 1 ,例如x 染色体失活,d n a 甲基化和 基因表达中的组蛋白修饰问题。如果再把这种研究扩展到基因组水平,那就衍生 出表观基因组学了。 1 4 2 核小体和组蛋白修饰 组蛋白修饰和核小体研究是目前表观遗传学的一个研究热点。核小体是构成 真核生物染色质的基本结构单位,各核小体串联而成染色质纤维。核小体d n a 长度约为1 6 5 个碱基对,其中缠绕在组蛋白八聚体周围的核心d n a ( c o r c d n a ) 约1 6 5 圈,约合1 4 7 个碱基对;而相邻的核小体之间的自由区域( 1 i n k e r d n a ) 约为2 0 - - - 5 0 个碱基的长度,也就是说基因组的7 5 9 0 被核小体所占 据。组蛋白八聚体由进化上高度保守的h 2 a 、h 2 b 、h 3 和h 4 各两个拷贝组成。 核小体核心颗粒在组蛋白h 1 的作用下形成稳定结构,进一步组装成高级结构 1 9 1 o 通常来说组蛋白和核小体都不是人们认为的静态结构。组蛋白在翻译后的修 饰中会发生改变,从而提供一种识别的标志,为其它蛋白与d n a 的结合产生协同 或拮抗效应,它是一种动态转录调控成分,称为组蛋白密码( h i s t o n ec o d e ) 。这种常 见的组蛋白外在修饰作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、a d p 核糖基化、羰基化等等,它们都是组蛋白密码的基本元素。当组蛋白受到这些修 饰以后,缠绕在上面的d n a 的状态也会随之改变。例如,当组蛋白乙酰化以后, 6 i l l 学顺十学镕女 组蛋白与之 的d n a 结合能力下降,核小体打,r ,各种转蒙因子u r 以与d n a 结合,启动基因表达:反之,当组蚩白去乙酰化以后,与d n a 结合能力增加, 划形成核小体阻遏基因的表达。由此也可知道,核小体和组蛋白修饰,在基因的 表达调控之中的重要作用。 :j me t o n ei i i寝b 老躞 削h 3 酵母桉小体| :| 勺结构 f 9 1 - 3 $ 1 i i c ( l l f e o f y e a s t n u c l e o s o m e 1 4 3 基因组学层面的核小体研究 在2 0 0 4 年,b r a d l e y e b e m s t e i n 等人运用染色质免疫共沉淀( c h i p ) 和d n a 微阵列联用的方法,通过组蛋白的抗体分离出核小体序列,首次在基因组学层面 去研究酵母内的核小体分师。他们发现转录因子的结合位点往往屉一些核小体稀 疏的区域,并且提出转录因子在转录的时候共同作用解丌核小体然后进入目标区 域进行转录的观点j ”i 。随后,y u a n 等人发明了套精度更高的新方法,以叠扎 式的d n a 微阵列为基础,在酵母里面找出了2 0 0 0 多个核小体的分1 1 i 。从他们 得出的结果早面,也发现了基因的启动子区缺乏核小体分布,这也印证了b r a d l e y e b e t n s i e i n 等人的结果。同时,根掘他们的数据,y u a n 等人进_ - 步发展了b r a d l e y eb e r n s t e i n 等人的观点,提出d n a 序列是决定核小体分巾的关键因素i ”】。 灞 n, 一 厂。、= i : a 一秽 ; , 。p 。 j 谲 卢 目1 - 4 核小体在基困上的分布 f i 9 1 4 t h ed i s h i b u t i o n o f y e a s tn u c l r n ea l o n g t h ec o d i n g , e g i o n 以上两个工作的结果随后被很多的研究者的不同实验所证实口”,与此同时他 们还发现终止密码子之后也会有一个核小体缺乏区,并且基因区的核小体分布与 非基因区相比要束得更为密集。因此大部分的研究者都持一种观点认为物种基因 内的核小体分布是由该位置d n a 序列所决定的且核小体对特定序列有所谓的偏 好型( s e q u e c e 口f e 缸e n c e ) 。但是由于在物种体内( 一般是酵母) 存在着很多的 调控园子,他们可以通过对不同的蛋白修饰去改变d n a 与蛋白的相互作用,所 以也存在一种学说认为核小体的分布主要是由于各种调控因子对不同位点的不 同调控作用引起的。同时在考虑核小体序列分布差异性的时候,我们也应该注意 到从体内提取核小体的时候,由于中间要经过微球菌酶的处理;而微球菌酶是存 在一定的序列偏好性的所以最后我们的测序结果中引入的这种误差是会影响我 们对最后结果的分析的。在2 0 0 9 年。n o a mk a p h n 等人用从酵母体内提取的基 因组d n a 在体外与组蛋白结合并且用微球曲酶处理后再测序,拉现在没有其他 调控园子的情况下,胄7 0 的桉小体分布与体内的挟小体分布是一致的【l 。为 了进一步排除微球菌酶所造成的序列偏好性,他们设计了加,0 0 0 条1 5 0 个碱基 的寡聚核苷腹序列柬测试他们与组蛋白的亲和度,其中2 2 2 3 6 条为酵母三号染色 体j :的序列。验证试验得到的数据与上而的体外实验一致。这螳结果就为所谓的 棱小体存在序列偏好性的观点,即基因组某区域是否形成核小体主要是由该位置 d n a 序列决定,提供了一个有力的支持。但是也有人质疑n o a mk a p l a n 等人实 验中的组蛋白与d n a 的比例过低,导致所以得到体内与体外有7 0 相关性的结 _uj;口gie; !jai ;。;k_疆弘;o。o l l l 山大学硕十学位论文 果,而事实上是根本不存在序列偏好性【3 2 1 。 以上所介绍的基因组学层面的酵母核小体的研究都是通过比较同一物种不 同位置核小体分布的差异来解释究竟是序列因素( 也可称为顺式作用) 还是细胞 内各类调控因子的作用( 也可称为反式作用) 是决定核小体分布的关键因素,但 是还没有研究比将触角延伸到不同物种间核小体分布差异的比较。 1 5 研究目的、方法和意义 本研究试图就通过三种不同的酵母菌:酿酒酵母,奇异酵母和他们的杂合体, 通过对他们体内核小体分布差异的分析,弄清楚核小体进化上的差异到底是由该 位点序列的改变还是调控因子的功能改变引起的。 本文中主要的研究方法为分子生物学实验技术和生物信息学的数据分析,首 先对三株不同酵母3 6 1 ( 酿酒酵母,2 倍体) 、3 6 2 ( 奇异酵母,2 倍体) 、3 6 3 ( 酿 酒酵母和奇异酵母的杂合体,2 倍体) 进行鉴定。接着由本室陈智冬硕士提取核 小体,然后使用i l l u m i n a 公司的s o l e x a 测序仪对提取的核小体进行测序。当 测序结果返回后,本人运用生物信息学的方法对得到的序列进行定位,最后按照 每个位点核小体频率的差异来确定影响核小体分布的主要因素。 本研究得出的结论,不单可以帮助我们认识顺式作用和反式作用在进化上对 核小体形成的影响;同时因为核小体与基因表达调控直接相关,本研究的结果也 可以为我们弄清基因表达调控机制以及它的进化提供一个有力支持。 9 l i 山大学硕十学位论文 2 1 研究目标 第二章酵母菌株的鉴定 鉴定本研究使用的菌株是否符合我们的要求。 2 2 主要实验仪器及试剂材料 2 2 1 主要实验仪器 p b 1 0 p h 计 丹佛t p 2 1 3 型电子分析天平 u n i c o 紫外分光光度计 t h z 3 0 0 恒温培养摇床 l r h 7 0 生化培养箱 三孔电热恒温水槽 盯c 1 0 0p c r 仪 c e n t r i f u g e5 4 2 4 台式离心机 2 2 2 主要试剂材料 1 广r i s e d t a ,2 n a 2h 2 0 t r i t o nx 1 0 0 1 0 赛多利斯科学仪器( 北京) 有限公司 赛多利斯科学仪器( 北京) 有限公司 尤尼科( 上海) 仪器有限公司 上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司 b l o r a d e p p e n d o r f 广州威佳科技有限公司 广州威佳科技有限公司 广州威佳科技有限公司 f 山大学硕十学位论文 t r i s 酚 s d s 葡萄糖 乙酸( 冰醋酸) n a c l 无水乙醇 琼脂粉 玻璃珠 细菌学蛋白胨 酵母粉 氯仿 盐酸 琼脂糖 g e n e t i c i n ( g - 4 1 8s u l f a t e ) e z n a t mg e le x t r a c t i o nk i t 核糖核酸酶( r n a s ea ) l a t a qp c r 试剂盒 d n t pm i 】【 y p d 液体培养基 y p d 固体培养基 t a e 电泳缓冲液 t e 缓冲液 酵母基因组提取裂解缓冲液 2 3 实验菌株 广州威佳科技有限公司 广州威佳科技有限公司 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 北京奇华盛生物技术发展中心 北京奇华盛生物技术发展中心 广东环凯微生物科技有限公司 英国o x o i dl t d 天津市富宇精细化工有限公司 广州市东红化工厂 g e n et e c h ( s h a n g h a i ) c o m p a n yl t d i n v i t r o g e nc o r p o r a t i o n o m e g a s i g m a t a k a r a t a k a r a 详见附录i 详见附录i 详见附录i 详见附录i 详见附录i 3 6 1 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a em a t a m a t ah i s 3 l 1 1 h i s 3 l j ll e u 2 l l o l e u 2 l l o l y s 2 l y s 2 a om e t l 5 l l o m e t l 5u r a 3 a o u r a 3 z j o ) ,3 6 2 ( s a c c h a r o m y c e sp a r a d o x u s m a t a m a t ah i s 3 l j l h i s 3 l l ll e u 2 l l o i e u 2 l j ol y s 2 l y s 2 om e t l 5 z j o m e t l 5 巾山大学硕+ 学位论文 u r a 3 a o u r a 3 a 0 13 6 3 ( 象兮筋m a t a m a t ah i s 3 a 1 h i s 3 a 1l e u 2 a o l e u 2 d o l y s 2 l y s 2 a o m e t l 5 a o m e t l 5u r a 3 d o u r a 3 a o ) ( 注:以上都为二倍体菌株) 均为本 室保存。 2 4 实验方法 2 4 1 菌株的活化 配制y p d 固体培养基,待培养基凝固后,用镊子夹住浸泡过菌液的滤纸, 放到固体培养基表面。然后滴一滴清水浸润滤纸,静置几分钟。接着把滤纸丢弃, 再用接种环把清水按一定规则划线。最后把平板放在3 0 c 恒温培养箱培养2 天 以上,直至出现明显的单菌落。 2 4 2 菌株的鉴定 2 4 2 1 酵母菌株基因组d n a 的提取 1 挑单菌落至1 0 m l 新鲜y p d 培养液中,3 0 c ,2 0 0 r p m ,过夜培养至饱和; 2 4 0 ( ) 0 r p m 离心收集细胞,然后用冷的、等体积的无菌蒸馏水洗涤; 3 将细胞沉淀在2 0 0 9 l 酵母基因组提取裂解缓冲液中重悬浮,然后加入约0 3 9 玻璃珠和2 0 0 t l 的1 :1 苯酚:氯仿混和液; 4 漩涡摇匀1 - 2 m i n ; 5 加入2 0 0 9 l 的t e 缓冲液,倒置混合6 1 0 次。注意:从这步开始漩涡摇匀可 能会剪切d n a ; 6 1 3 0 0 0 r p m 离心5 m i r a 7 将上层的水相转移到干净的微量离心管中; 8 加入1 体积( 4 0 0 p 1 ) 氯仿,颠倒混匀; 9 同第6 步离心; 1 2 f 1 山大学硕十学位论文 1 0 将上层的水相转移到新的微量离心管中; 1 1 加l m l 乙醇,翻转混匀,室温放置1 0 m i n ; 1 2 1 3 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ; 1 3 弃上清液,用l m l 的7 0 乙醇洗涤沉淀; 1 4 完全弃去上清液,并将沉淀在室温下干燥; 1 5 在4 0 0 # 1 含有最后浓度为2 t g m l 的核糖核酸酶的t e 缓冲液中溶解沉淀; 1 6 3 7 温育1 0 m i m 1 7 重复8 1 4 步; 1 8 加入5 吮lt e 溶解d n a 沉淀,2 0 c 保存待用。 1 9 利用o m e g a 胶回收试剂盒回收纯化d n a 。 2 4 2 2p c r 扩增 以上一步提取的酵母基因组d n a 为模板,对酵母菌株进行普通p c r 鉴定, 确认实验菌株的可靠性。 p c r 反应体系: t a k a r al at a q ( 5 u 比i ) 1 0 x l ap c rb u f f e ri i ( m 9 2 + p l u s ) d n t pm i x t u r e ( 各2 5 m m ) 模板d n a s e n s e 引物( 1 0 t m ) a n t i s e n s e 引物( 1 毗m ) 灭菌蒸馏水 p c r 扩增程序: 9 4 。c 预变性4 m i n ,然后9 4 。c 变性4 5 s ,5 5 。c 退火4 5 s ,7 2 。c 延伸4 0 s ,3 4 个 循坏,最后7 2 。c 继续延伸1 0 m i n 。扩增完成以后,取靴l 扩增产物于1 琼脂糖 鄄 l 曙 2 撕轴“ m n “ 呻 皑 撕伽圳 “i 学q ,+ 学世论文 凝腔上样电泳,然后e b 染色1 0 r a i n ,凝胶成像分析结果 2 4 2 3p c r 产物的酶切鉴定 把以r 得到的p c r 产物通过胶回收纯化然后用不同的内切酶在3 7 度水浴锅 中酶切一个小时之后取5 l 于1 琼脂糖凝胶上样屯泳,然后e b 染色1 0 m i n , 凝胶成像分析结果。 2 5 实验结果 2 5 1 菌株的鉴定 2 5 1 1 酵母基因组d n a 的提取 2 5 1 1 1 基因组d n a 电泳图 m a 1b - jc - 1 o 。_ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 蚓2 - 1 一个曲株量田组提取的叱泳幽。a - i3 6 1 的基绀d n a ;b - i :3 6 2 的基w 纽d n a :c - 3 6 3 的垡i 川卅d n am :l k b d n a m a r k e r 。 1 4 f i 9 2 1e l e c t r o p h e r o 口- a mo fg c n o m i c d n aa - ig e n o m i e d n a o f s t r a i n3 6 1 ;b 一1 :g e n o m i c d n a o fs t r a i n3 6 2 ;c - l :g e n o m i c d n a o fs t r a i n 3 6 3 ,m :l k b d n a m a r k e r 由图2 1 可知基因组d n a 大小质量良好,可满足普通p c r 的要求 2 5 i i 2 菌株替换鉴定结果电泳图 5 0 0 b d 2 5 0 b d 1 0 0 b p ma 1a 一2b - 1 2c 1c - 2 漱 凹2 - 2 苗株鉴定结杜j 的电浊凹。a _ 13 6 3 帕p c r 产物;a 23 6 3 的p c r r 砑经e c o r l 酶切; b 1 :3 6 2 的p c r 产物;b 23 6 2 的p c r 产物经e c o r i 酶切;c ,l :3 6 1 的p c r 产物:c - 2 3 6 1 的p c r 广l 物经e c o r i 酯切m :d l 2 0 0 0d n a m a r k e r 。 f i 9 2 - 2 e l e c t r o p h e r o g e a mo f p c rp r o d u c ta n de n z y m ed i g e s t i o n a 。1 :p c r p r o d u c t o fs t r a i n 3 6 3 ; a 2p c rp r o d u c lo fs t r a h a3 6 3a f t e re c o p dd i g e s t i o n ;1 3 - 1 :p c rp r o d u c to fs t r a i n3 6 2 ;b 一2 :p c r p r o d u c to fs t r a i n3 6 2a f t e r e c o r id i g e s t i o n t 2 - 1 :p c rp r o d u c t o fs t r a i n3 6 1 ,( 2 - 2 :p c rp r o d u c t o f s t r a i n3 6 1a f t e r e c o r ld i g e s t i o n m :d l 2 0 。一p l u s d n a m a r k e r 川物p c r 产生的条带大小大概在3 0 0 b p 卉,从同中观察大小与预期吻台 秽黪 f ,山大学硕十学位论文 以酿酒酵母为模板产生的p c r 产物中间有一个e c o r l 的限制性内切酶位点,而 以奇异酵母为模板产生的p c r 产物中没有这样一个酶切位点。可以推断,杂合 子3 6 3 因为同时具有酿酒酵母和奇异酵母的模板,所以当酶切的时候,酿酒酵母 的模板产生的p c r 产物被切开形成两条2 0 0 b p 和1 0 0 b p 的带;而奇异酵母模板 产生的p c r 产物没被切开形成一条3 0 0 b p 左右的带,总共有三条带;而酿酒酵 母有两条带;奇异酵母只有一条带。从e c o r i 酶切鉴定的图中可以知道,结果与 预期吻合,三个菌株均为我们实验所需的菌株。 2 6 讨论 2 6 1 菌种的鉴定 本章节主要进行实验前菌株的鉴定工作。从的三个菌株以滤纸的形式寄送到 本实验室,为保证菌株在保存过程中和划板分离单菌落时没有发生突变和实验的 正确性,每个菌株随机挑选了2 个克隆进行鉴定,本室保存的酿酒酵母和奇异酵 母分型的引物,以相应菌株的基因组d n a 为模版,对其进行p c r 和酶切鉴定。 凝胶成像观察后与预期结果一致,表明实验材料可靠。 1 6 | l 山大学硕十学位论文 第三章酵母核小体的测序与数据分析 3 1 研究目标 对测序后的核小体数据进行分析,用过不同菌株不同位点的核小体的差异来 确定到底是哪种因素在核小体的形成中起决定作用。 3 2 主要数据和软件 3 2 1 主要数据和其来源 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 菌株y 5 5 全基因组序列和奇异酵母 ( s a c c h a r o m y c e sp a r a d o x u s ) 菌株n 1 7 全基因族序列下载自斯坦福大学的网站 ( f t p :g e n o m e f t p s t a n f o r d e d u p u b y e a s t s e q u e n c e f u n g a l g e n o m e s ) 。三 个菌株核小体的测序结果分别命名为x x x , x x x ,x x x ,x x x ,x x x ,x x x ,x x x 。系本人提 取核小体后,送往华大基因测序返回结果。 3 2 2 数据分析中所使用到的软件 3 2 2 1s o a p s o a p 是华大基因生物信息中心核心技术开发团队自主开发的基因组序列分 析的软件包,它可以高效地处理第二代测序技术产出的巨大数量的短序列,并完 成其参考序列的定位上,短序列的组装以及序列差异分析等。本实验使用的是 2 1 9 版本,由其官方网页下载( h t t p :s o a p g e n o m i c s o r g c n ) 。 1 7 f f l 山大学硕十学位论文 3 2 2 2m a u v e m a u v e 是一款用于多物种全基因序列比对的软件。它由威斯康辛大学开发 的,可以找出多个不同基因组的同源区并给出相似性的数值。本实验使用的版本 是2 3 o ,由其官方网页下载( h t t p :g e l a h a b s w i s c e d u m a u v e ) 其他结果如无特别注明,均为本人编写程序运行后得出的结果。 3 3 分析方法 3 3 1 核小体序列的大规模测序 三个菌株的核小体由本室陈智冬硕士提取后,在干冰的保存下送往华大基因 深圳公司,运甩i l l u m i n a 测序仪进行p a i re n d 的大规模测序。3 6 1 和3 6 2 混合 后再将样品分成两份进行独立测序,3 6 3 作为一份样品独立测序。测序结果以文 本的格式返还。 3 3 2 测序结果的定位( m a p p i n g ) 使用华大基因生物信息学小组开发的s o a p 软件对返还的文本进行处理。由 于是p a i re n d 测序,所以每个样品返回的是两个文件,三个样品总共返回的是 六个文件。 先用s o a p 将参照的基因组序列处理成其可识别的格式,相应命令为: 2 b w t b uil d e r y 5 5 一g e n o m e f a s t a 2 b w t b u il d e r n 1 7 一g e n o m e f a s t a 1 8 f ,山大学硕十学位论文 之后以每个样品返还的两个文件一个为a ,一个为b ,以处理后的y 5 5 和n 1 7 混合在一起的基因组作为参照来定位得到的测序结果。其命令如下: s o a p a 一b 一d 一0 一2 一i l l 一x 一r 因为酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 和奇异酵母( s a c c h a r o m y c e s p a r a d o x u s ) 的基因组有9 0 的相似性,这就意味着两个基因组有9 0 的区域是相 同的。因为s o l e x a 测序每个读长比较短,大概只有1 3 5 - 1 7 5 b p 。所以很多的r e a d s 对应的区域在两个基因组之间是没有差别的。而我们为了节省测序成本将两个菌 株3 6 1 和3 6 2 混合测序,这就不可避免地出现一个r e a d s 可以同时定位到奇异酵 母和酿酒酵母的基因组上面的情况。对这种情况,我们采取的策略是舍弃这些 r e a d s 并且将相应的基因组区域在我们统计每个位点的相对频数的时候进行屏 蔽,以免造成影响。为了将这些r e a d s 舍弃掉,我们将y 5 5 和n 1 7 的基因组混合 在一起,再运行以上定位程序,一r 的参数取为0 。一r 代表当一个片段能定位到 基因组上面多段区域的时候是不输出( 0 ) ,输出并显示其中一个位点( 1 ) 还是 所有能定位到的位点都显示( 2 ) 。而将一r 取为0 ,也即是不输出这种能定位到多 个基因位点的序列。而为了将这些r e a d s 对应的区域在后面统计相对频数的时候 屏蔽,我们要再运行上面的一次定位程序,此时一r 的参数取为2 。 3 3 3 全基因族核小体覆盖的相对频数的计算 3 3 3 1 每个位点核小体绝对频数的计算 以r = o 输出的三个文件为输入文件计算每个位点核小体的绝对频数。对于每 个位点的核小体频率,我们这样定义:当一个读长( r e a d s ) 能定位到某一基因 组区段的时候,这区段的所有位点的频率加一。首先从s o a p 处理产生的文件中 提取每个r e a d s 在基因组上面对应的位置信息并输出到一个文件。接着编写程序 1 9 巾山大学硕十学位论文 统计每个位点被多少个r e a d s 经过,当我们统计了所有的r e a d s 定位信息后,我 们就可以给出全基因组每个位点各自被多少个r e a d s 覆盖并给出各个位点的打 分,这些打分就是核小体的绝对频数。 3 j j 2 能被同一片段定位到的基因组片段的屏蔽 因为我
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 2025江苏省规划设计院社招考前自测高频考点模拟试题含答案详解
- 2025安徽宿州萧县中医院面向应届毕业生校园招聘10人模拟试卷附答案详解
- 2025江苏常州经济开发区社会保障和卫生健康局下属事业单位招聘卫技人员14人考前自测高频考点模拟试题及答案详解(考点梳理)
- 2025金华市天禾实业有限公司招聘2人考前自测高频考点模拟试题完整参考答案详解
- 2025年福建省龙岩金叶复烤有限责任公司招聘5人考前自测高频考点模拟试题及答案详解(各地真题)
- 2025年交通银行春季招聘考前自测高频考点模拟试题带答案详解
- 2025湖南岳阳市平江县中医医院公开招聘急诊科护士模拟试卷附答案详解(典型题)
- 2025广西柳州市柳江中学参加广西师范大学研究生毕业生春季专场双选会11人模拟试卷及1套参考答案详解
- 2025年河北沧州任丘园区产业发展集团有限公司招聘工作人员10名模拟试卷及答案详解(必刷)
- 2025年大连金普新区卫生系统招聘事业编制工作人员164人模拟试卷及答案详解(全优)
- 核电运营数字化转型探索-中核集团 核电运行研究(上海)有限公司 2025
- Unit2RainorShine词汇与语法特训鲁教版七年级英语上册
- 学堂在线 如何写好科研论文 章节测试答案
- 旅馆顾客财物管理制度
- 交通设施韧性提升-洞察及研究
- CJ/T 340-2016绿化种植土壤
- 购车没过户协议书
- 转让店铺欠款协议书
- 2024年黑龙江省《宪法知识竞赛必刷100题》考试题库【研优卷】
- 《建筑电气安装》课件
- 《山东省房屋市政施工安全监督要点》及《安全监督“二十要”》2025
评论
0/150
提交评论