（生物化学与分子生物学专业论文）磁性复合微粒在mrna纯化中的应用.pdf

摘要 磁性复合微粒是由高分子或无机材料与磁性超细粉末( 如铁的氧化物、铁、 钴、镍等金属) 构成的具有超顺磁性的胶态材料磁性复合微粒可在外加磁场中 被快速分离，反复操作无磁记忆性此外，通过物理吸附或其表面功能基团( 如 羧基、羟基、氨基等) 的作用，可将抗体、酶、核酸、小分子探针及药物等分子 固定在其表面基于磁性复合微粒的超顺磁性以及表面生物分子可修饰的特点， 磁性复合微粒已被广泛用于细胞学、免疫学、分子生物学、临床诊断与治疗等研 究领域 生物样品中m r n a 的分离纯化是分子生物学研究的前提和关键环节以磁 性复合微粒为载体的m r n a 纯化方法高效、快捷，获得的m r n a 分子完整国外 已有相关产品，但售价昂贵，难以普及，国内在此方面的研究与开发还较为落后 本研究以不同组成的微米级磁性复合微粒为材料，将础娴通过共价作用或链 亲和素生物素的相互作用固定在磁性复合微粒的表面，并以此为载体开展了从不 同动、植物组织中纯化m 】盼渔的研究。 将表面硅烷化含氨基末端的磁性f e 3 0 4 微粒以苯二异硫氰酸酯活化，进而 将氨基标记的曲颤哟共价偶联在其表面，并系统开展了从不同动、植物组织 总r n a 中提取m r n a 的研究结果表明：1n a g 磁性复合微粒可偶联氨基标记 o l i g o ( d t ) m 的量在0 8 5n m o l , - 0 9 - - i o l 之间从1 ( 3 0 # 8 大鼠肝脏，肾脏、脾脏总 r n a 中可分别提取得到2 2 6 , u g 、2 4 5 u g 、1 7 7 9 9 的m r n a ；从1 0 0 m g 首蓿草、 小叶女贞的总r n a 中可分别提取得到0 9 3u g 、1 5 8 , u g 的m r n a 。得到的m r n a 在2 6 0 n m 和2 8 0 n m 的吸光度值的比值( o 蝴d 瑚) 在1 8 - 2 0 之间，表明 m r n a 具有较高的纯度。琼脂糖凝胶电泳结果显示，m r n a 呈清晰慧尾片状条带 以大鼠肝中提取的m r n a 为模板，对b a c t i n 基因的逆转录聚合酶链式反应可得 到分子量为2 4 0b p 的目的d n a 片段。表明纯化的m r n a 分子完整，提取过程 中未降解。对表面偶联有o g o ( d r ) 2 0 的磁性复合微粒进行6 个月的跟踪实验，数 据显示，磁性复合微粒可高效稳定地用于m r n a 分离纯化 本研究还开展了以偶联有o g o ( d r 的氨基末端硅烷化磁性复合微粒直接 从动物组织中提取m r n a 的初步研究此外，通过链亲和素生物素系统将 础g o ( c r i 讼固定在金磁微粒表面，对总r n a 中提取m r n a 的条件进行了探索， 并得到了初步的结果 关键词：磁性复合微粒 o g o ( o r ) 2 0m r n a 纯化 a b s t r a c t s u p e r p a r a m a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e sa i ec o m p o s e do ff e r r o f l u i d ( s u c ha si r o n o x i d e , f c , c o , n in a n o p a r t i c l e s ) a n di n o r g a n i a o r g a n i cm a t e r i a l s a n t i b o d i e a , e n z y m e , , n u c l e i ca c i d s o l i g o n u c l e o t i d e s , m o l e c u l a rp r o b e s 甜m e d i c i n e b ei m m o b i l i z e do n m a g n e t i cp a r t i c l es u r f a c eb yp h y s i c a la d s o r p t i o no rc o v a l e n f l yi n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e f u n c t i o n a l g r o u p s ( s u c ha 8a m i n o , c a d , o x y l , t h i 0 1 ) o nm a g n e t i cp a r t i c l e sa n d b i o m o l e c u l e s b a s e do i lt h ea d v a n t a g e so fm a g n e t i cs e p a r a t i o na n dt h ei m m o b i l i z a t i o n o fb i o m o l e c u l e s , m a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e sh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nt h ef i e l do f c e l ls o r t i n g , e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n , i m m t m o s s a y , d r u gd e l i v e r ya n db i o m o l e c u l e p u r i f i c a t i o n 。 m r n a p l a y s 皿i m p o r t a n tm l ei ng e n ea n a l y s i s , c o u p l e dw i t ho l i g o ( d t ) , m a g n e t i cp a r t i c l e sh a v eb e e np r o v e da sai d e a lc a r r i e ri np u r i f i c a t i o no fn r n a t h e m e t h o d h 越a d v a n t a g e ss u c h 舔r a p i dp 疵函m a n c c ，e a s yo p e r a t i o n , g o o d r e p r o d u c i b i l i t ya n dh i g hp u r i t yo fm r n ao b t a i n e dw i t ht h i sm e t h o d t h em r n a p u r i f i c a t i o nk i t su s i n gm a g n e t i cp a r t i c l e sh a v eb e e nc o m m e r c i a l i z e di nu s a , g e r m a n y , e t c h o w e v e r , t h e s ep r o d u c t sa i em u c he x p e n s i v ec o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a lm e t h o d u s i n gc o l u m no o u p l e dw i t ho u g o ( d t hh e r e i n , 啪d e v c l o p e d - m r n ai s o l a t i o n m e t h o dw i t hd i f f c r e mk i n d so fm a g n e t i cp a r t i c l e s ：t h ed e t a i l so fi m m o b i l i z a t i o n o l i g o ( , r r o np a r t i c l e 蜘f h o c t h ep r o c e s sa n dr e s u l t sf o rm r n ap u r i f i c a t i o nf r o m a n i m a lt i s s u e sa n d p l a n tt i s s u e sa l ed e s c n b c d s i l a 】血c dm a g n e t i cp a r t i c l e sw i t h 岫g r o u p so nt h e i rs u r f a c ew c g ea c t i v a t e db y 1 , 4 - p h e n y l e n ed i i m t h i o c y a n a t c ( f d i t c ) a n dt h en l - 1 2 - 1 a b e l e do l i g o ( d t ) 2 0w c i g ： o m i g o ( d 毗固定在金磁微粒表面，对总r n a 中提取m r n a 的条件进行了探索， 并得到了初步韵结果 关键词：磁性复合微粒o h g o ( m r n a 纯化 a b s t r a c t s u p e r p a r a m a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e sa i ec o m p o s e do ff e r r o f l u i d ( s u c ha si r o n o x i d e , f e , c o , n in a n o p a r t i c l c s ) a n dm o r g a n i c o r s a n i cm a t e r i a l s a n t i b o d i e s , c n z y m c s , n u c l e i ca c i d s o l i g o n u c l c o t i d c s , m o l e c u l a rp r o b c s 甜m c d i c i n cg i nb ei m m o b i l i z e d0 1 1 m a g n e t i cp a r t i c l es u f f a c cb yp h y s i c a la d s o l p t i o no fc o v a l e n f l yi n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e f u n c t i o n a lg r o u p s ( s u c h8 sm o , c a r b o x y l , t h i o d0 1 1m a g n e t i cp a r t i c l e sa n d b i o m o l e c u l e s b a s e d0 1 1t h ea d v a n t a g e so fm a g n e t i cs e p a r a t i o na n d t h ei m m o b i l i z a t i o n o fb i o m o l e c u l e s , m a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e sh a v eb c c nw i d e l ya p p f i e di nt h e 血埘o f c e l ls o r t i n g e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n , i m m u a o s s a y , d r u gd c h v c r ya n db i o m o l c c u l c p u r i f i c a t i o n - 。 m r n ap l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ng c n ea n a l y s i s , c o u p l e dw i t ho l i g o ( d t ) 2 e , m a g n e t i cp a r t i c l e sh a v eb c c np r o v e da sai d e a lc a i i i 盯i np u r i f i c a t i o no fm r n a t h e m e t h o dh a sa d v a n t a g e ss u c ha sr a p i d p e r f o r m a n c e , e a s yo p e r a t i o n , g o o d r e p r o d u c i b i l i t ya n dh i g up u r i t yo fm r n a o b t a i n c dw i t ht h i sm c t h o d t h em r n a p u r i f i c a t i o nk i t su s i n gm a g n e t i cp a r t i c l e s h a v eb c c nc o m m c r c i a l i z c di nu s a , g e r m a n y , e t c h o w e v c x , t h e s ep r o d u c t s 批m u c he x p e n s i v ec o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a lm e t h o d u s i n gc o l u m nc o u p l e dw i t ho t i g o ( , r r hh e r e i n , w ed c v c l o p c dem r n a i s o l a t i o n m e t h o dw i t hd i f f c r c mk i n d so fm a g n e t i cp a r t i c l e s ：t h cd e t a i l so fi m m o b i l i z a t i o n o l i g o ( d 3 3 2 00 1 1p a r t i c l es u r f a c c , t h ep r o c e s sa n dr e s u l t sf o rm r n ap u r i f i c a t i o nf r o m a n i m a lt i s s u e sa n d p l a n tt i s a n c sa l ed e s c r i b e d s i l a n i z c dm a g n e t i cp a n i c l e sw i t h 堋2g r o u p s0 1 1t h e i rs u r f a c ew c 他m ：t i v a w , db y 1 , 4 - p h e n y l c n ed i i s o t h i o c y a n a t e0 d r r c ) a n d t h en h 2 - l a b e l e do l i g o ( d t 抽w c 豫 i m m o b d i z e do nm a g n e t i cp a r t i c l es u r f a c e e s i n ga n o t h e ri s o t h i o c y a n a t eg r o u pi n p d l t c t h ei m m o b i l i z a t i o nc a p a b i l i t yo fn h 2 - 1 a b e l e do t i g o ( d t ) 2 0w a si nt h er a n g eo f 0 8 5 n m o l - 0 9 n m o l p e r m i l i g r a m o f m a g n e t i c c o m p o s i t e p a r t i c l e s t h e t o t a l r n a w a s f i r s t l yi s o l a t e df r o ml i v e r , k i d n e ya n ds p l e e no fr a tu s i n gt r a d i t i o n a lm e t h o d , t h e nt h e m a g n e t i cp a r t c l e sl a b e l l e dw i t ho l i g o ( d t ) 2 0w a su s e dt oi s o l a t em r n a 2 2 6 飕( 1 i v e r ) , 2 4 5 腭( k i d n e y ) ，1 7 7 腭( s p l e e n ) o fm r n a w a so b t a i n e d 蛔1 0 0 旭t o t a lr n a s e p a r a t e l yu s i n gm a g n e t i cp a r t i c l e s ；i nt h es a m el c l p0 9 3 飑( t r i f o l i u mr e p e n s ) 、 1 5 8 卢g ( q u i h o u i c a r r ) o fm r n a w a sa l s oo b t a i n e df r o m1 0 0 弘gt o t a lr n ao fp l a n t s r e s p e c t i v e l y a l lo ft h er a t i o so fo d 2 一o d 2 ma r c ：b e t w e e n1 8a n d2 o a n dt h ea g a r o s e e l e c t r o p h o r e s i sr e s u l ts h o w st h a tt h em r n a i sm e a lt h em r n af t o mr a tl i v e rw a s u s e da s 钯m p f o r a m p l i f i c a t i o no fb - a c t i ng e n ev i a 犯嘴t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s e c h a i nm 瞄k 腼0 r r - p c r ) a n dt h ea g a r 0 6 t e l e c t r o p h o r e s i sr e s u l ts h o w st h a tt h et a r g e t d n am o l e c u l ew i t h2 4 0 却w a ss y n t h e s i z e du s i n gp u r i f i e dm l m a , w i l i c hi n d i c a t c d t h a tt h em r n a p u r i f i e di si n t e g r i t y t h em r n ai s o l a t i o nf r o ma n i m a lt i s s u ed i r e c t l ya n dp u r i f i c a t i o no fm r n af i o m t o t a lr n au s i n gs t r e p t a v i d i nc o a t e dm a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e s ( g o l d m a g ) w c ：i 潞 a l s od i s c u s s e di nt h i st h e s i s 一 k e y w o r d s ： m a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e so x i s o ( , n h m r n a p u r i f i c a t i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：士：f 量 指导教师签名 工口。1 年舌月 e t 7 庐 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名：亍博 2 。 年6 月f 日 第一章文献综述 1 磁性复合微粒的研究现状 i 1 磁性复合微粒的概念及组成 磁性复合微粒是2 0 世纪7 0 年代末发展起来并被广泛用于生物医学领域的 纳微米复合粒子，是由高分子或无机材料与磁性超细粉末构成的胶态材料其中， 磁性物质包括铁，铁氧化物、钴、镍、正铁酸盐等，当其粒径达到一个临介尺度 ( 1 5 衄以下) 时会表现出超顺磁性( s u p c r p a r a m a g n c t i c ) 的特性作为基体的高分 子材料包括合成高分子( 如苯乙烯共聚物、聚酯类、聚酰胺类) 和天然高分子( 如 明胶、纤维素、蛋白和各种聚糖等) 无机材料主要包括二氧化硅( s i 0 2 ) ，金 属等1 1 _ q 纳微米级的磁性复合微粒具有较高的比表面积表现出较强的吸附能力磁 性复合微粒表面也可通过共聚、表面修饰等赋予不同的活性基团，如- - - c o o h 、 n h 2 、o h 、鲫l 等由此可通过物理吸附、共价作用等将抗体、酶、核 酸及寡核苷酸等生物活性物质偶联在其表面表面固定有链亲和素的磁性复合微 粒还可与生物素标记的生物分子特异结合而将其固定在磁性微粒表面逶常情况 下，磁性复合微粒通过热运动保持胶体的稳定性，在外加磁场作用下。磁性粒子 的超顺磁性可保证其既可被快速分离，本身又不会被永久磁化因此，偶联有生 物分子的磁性复合微粒在环境监测、酶的固定化、靶向给药、免疫分析、细胞分 离、核酸分离纯化等方面已经得到广泛的应用 根据磁性复合微粒的组成可将其分为有机无机磁性复合微粒。无机无机 磁性复合微粒两大类 1 有机无机磁性复合微粒：以磁性材料和天然高分子，有机合成高分子等组 成的磁性复合材料应用较多的高分子物质包括葡聚糖、聚苯乙烯、壳聚糖，聚 乙二醇、环糊精、多肽、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯等核壳结构的有机无机 磁性复合微粒常将高分子包覆在磁性粒子表面，具有光滑、可修饰表面( 图1 ( a ， b ) ) 慨日所示，方便生物分子偶联，可降低表面非特异性吸附；而葡聚糖、壳聚 糖( 图l c ) 忉、淀粉等天然高分子组成的磁性复合微粒则具有生物相容性和可降 解性，更适合体内药物输送等应用 图l 磁性聚苯乙烯微粒( 1 ) ，磁性聚甲基丙烯酸甲酯微粒( b ) 磁性壳聚糖微粒 扫描电镜照片 z 无机无机磁性复合微粒：无机无机磁性复合微粒是铁、铁氧化物、钴、镍等 与其它金属或无机物组成的微粒核壳结构的无机无机磁性复合微粒表面可为金 ( 图2 a ) 旧、二氧化硅( 图幼) 1 9 1 、量子点等近年来，新型无机无机磁性复合 微粒的合成研究受到了越来越多科学家的关注，如e l k i n s 等f l 哪、c n c n 等【1 1 】用还 原的方法合成粒径大小可调的f c p t 纳米微粒，t o n g 等【1 2 l 合成了p t ? - f c 2 0 s 纳米 微粒，由于n 、n i 等材料的复合，材料的磁学性质得到了改善但这类材科在生 物医学应用研究中的报道尚少c u i 掣廿l 合成了核壳结构和组装结构的f e d 0 4 a u 磁性复合微粒，其内层f e a o + 具有超顺磁性，外层a n 及胶体金粒子具有良好的抗 体固定化能力，已在磁酶免疫检测中得到应用l 川 2 圈2r 3 0 h 金磁微粒( i ) 及$ i f e 2 0 3 磁性微粒( 惆描电镜照片 1 2 磁性复合微粒的应用 1 2 1 生物分子检测 磁性复合微粒可通过表面包被的特异性抗体或核酸探针，与含有相应抗原或 靶片断的物质特异性结合形成复合物【1 5 】，在磁场作用下，这种复合物可与其它组 分分离，在进一步引入报告信号基团( 如显色、荧光、化学发光等) 后，可用于 生物分子的检测磁性复合微粒与抗体或核酸探针可通过吸附与共价结合两种形 式，吸附结合依靠微粒表面对抗体或核酸探针的非特异吸附力，而共价结合依靠 微粒表面的活性基团与抗体或核酸探针分子中功能基团的共价反应由于磁性复 合微粒超强富集和快速分离能力、较高的比表面积以及表面结合生物分子对相应 靶物质的识别作用，已在分析检测中得到广泛的应用如基于抗体抗原的e j 晦a 检测，与传统的以酶标板为载体的e i j s a 相比具有更高的检溺灵敏度，操作更为 简单；对蛋白质和小分子药物的检测还可结合荧光免疫、光纤传感，磁分离及流 动注射等技术实施进行i 坷。n m 等人【明利用磁性复合微粒和胶体金对d n a 韵 放大作用建立了蛋白质的超灵敏检测方法，该法在磁性复合微粒上固定针对前列 腺特冥性抗原( p s a ) 靶物的特异性抗体，在标记有寡核苷酸探针的胶体金上同 时固定有针对p s a 抗体的二抗标记探针的胶体金、p s a 靶物与磁性复合微粒反 应结合后从溶液中分离出来后，与p s a 结合的胶体金表面带有的大量寡核苷酸搽 针使整个检测体系的灵敏度得到了放大f a n 等人1 1 q 建立了磁性微粒介导的化学 发光免疫检漏。在磁性微粒上固定抗体，与待铡物中的抗原结合。加入胶体金标 记的二抗，形成抗体一抗原一抗体的夹心复合物后，将标记在磁性微粒上的金在酸 性条件下氧化形成a d 利用a u ，催化的鲁米诺发光系统检测人i g g ，其灵敏度 可达1 盯垃m f u c n l v s 等人i 嘲建立了以磁性复合微粒为载体的d n a 检测方法 该方法首先在磁性复合微粒表面固定特异的d n a 探针，再将磁性微粒加入待检 测样品混合物中进行杂交反应，通过磁性分离筛选出目的d n a 。最后利用磁性微 粒表面的d n a 为模板进行p c r 扩增，分析产物应用该方法最低可检测到1 0 1 8 g m l ( 即每毫升含2 分子c d n a ) h c v 的d n a , 具有极高的灵敏度( 如图3 所 示) 图3 应用磁性复合微粒进； 亍d n a 检测 1 2 2 靶向给药及治疗 口服或静脉注射的药物通过全身血液循环使正常组织和器官受到一定的毒副 作用，同时，药物在病患部位的有效浓度有时也不能得到保证靶向给药，尤其 是恶性肿瘤靶向药物治疗已成为科学家研究热点磁靶向给药的特点是在磁场作 用下，药物能够克服在体内运输过程中遇到的各种生理屏障，到达靶向位点良 好的药物靶向治疗有助于增奴病灶郝位药物浓度，减少药物用量。降低不良反应。 具有良好的应用前景 i - i 觚e l i 等人例在由金属铁和活性炭组成的磁性复合微粒( m a g n e t i ct a r g e t e d c a 嘲，m r q 上标定p 放射铼皿c ) 一1 8 8 ，并将其有效递送肿瘤靶向部位这样， r e - m t c 能集中对肿瘤部位辐射治疗，减小了对周围组织和器官的辐射二氯苯 二磺酰钠是一种抗炎和止痛药，能用来治疗关节炎由于生理半衰期短，需要持 续频繁的注射以维持其治疗效果同时这种药物具有很强的副作用，如胃溃疡、 肠胃出血、过敏性反应等s a r a v a n a n 等人1 2 1 】制备了用于治疗关节炎的二氯苯二磺 酰钠凝胶磁性微粒，可达到靶向和缓释的效果，实验表明其药物释放时问超过1 8 天采用超声波能加快药物的释放 l u b b e 等人阎研究了大鼠和裸小鼠对空白和载药磁性纳米粒子的耐受性 以及载药磁性纳米粒子的药效结果显示，实验条件下，动物对不同浓度的空白 及载药磁性纳米粒子均未表现出任何毒副作用，只是在非常高的剂量下，动物在 1 - 2 天内表现出嗜睡将其用于抑制的肾癌和结肠癌模型，载药纳米粒子能使肿 瘤得到较为完全的缓解f e r x 公司将磁性定位载体( m t c ) 与抗肿瘤药物阿霉素 ( d o x ) 复合得到l 一2 p m 药物载体，利用外加磁场，通过介入方法将其固定到肿 瘤上游动脉分支中，在外加磁场的作用下，h f r c 0 l x 可从毛细血管渗透到目标 组织中达到肿瘤治疗的目的临床i ，期试验表明：在m t c - d 1 ) x 介入进入血管 后，可撤掉外部磁场将其固定在病变部位，m r c 的渗透过程不会损害正常组织 磁性复合微粒具有很好的生物相容性和有效性嘲利用磁性定位载体载阿霉素 ( m t c - d o x ) 进行肿癯治疗如图4 所示p q 。 图4 应用磁性定位载体载阿霉毒( m t c - d o x ) 进行肿瘤治疗 1 2 3 细胞的分离 细胞分离与纯化对细胞形态研究、细胞组成与功能分析等领域具有重要意义 传统细胞分离方法主要有等密度沉降、动力梯度沉降、差式沉降，离心洗提、双 水相分离和流式细胞仪分r ( f a c s ) 等方法。这些方法多基于细胞大小，密度、表 面电荷等物理特征分离。基于磁性复合微粒对细胞分选，主要是将针对细胞表面 特定抗原的单克隆抗体或其他亲和配基通过直接或间接的方法固定在磁性微粒表 面，利用亲和作用将细胞固定在磁性微粒表面在外磁场作用下固定在磁性微 粒表面的细胞发生定向移动，从而实现特定细胞的分离( 如图5 所示嘲) 与流 式细胞仪分选细胞相比，磁性复合微粒分离细胞简单、快速，得率和纯度较高， 成本较低 图5 应用磁性复合微粒分离筛选c d 3 4 阳性细胞 磁性复合微粒分选细胞常用策略有阴性分选和阳性分选两种阳性分选是 指将目的细胞磁性标记后，通过磁性分离直接获得其特点是操作简便，所得目 的细胞纯度高；缺点是磁珠与细胞直接结合，会影响细胞菜些特性另外，还需 对细胞进行解离，以便进行分析和后续培养阴性分选是指将非目的细胞磁性标 记后，通过磁性标记后将其除去而得到目的细胞其特点是磁性微粒不直接与目 的细胞接触。细胞所受损害程度低，可分离缺乏针对目的细胞的特异性抗体的样 品，分选后不需解离步骤而直接获得游离的目的细胞；但方法要求对样品中所分 离细胞种类明确，需要有针对所有非目的细胞的单克隆抗体将针对细胞表面抗 原的单克隆抗体包被在磁性微粒表面，与细胞孵育后直接格其分离的方法称为直 接分选当没有直接标记的磁性微粒时可将固定有链亲和素、抗生物素抗体、 抗荧光素抗体、二抗等抗体的磁性微粒与针对细胞表面抗原的一抗结合，再与细 胞孵育或将细胞与其单抗孵育后再与磁珠结合从而分离目的细胞和非目的细 胞的方法称为间接分选 s o n t i 等人陶建立了利用蛋白a j 包被的磁性复合微粒进行细胞分选的方法该 方法通过铁磁流体表面包被蛋黄卵磷脂和蛋白a 制备出功能化的磁性复合微粒， 将此磁性微粒加入鸡红细胞和抗体标记的羊红细胞的混合物，利用磁性微粒表面 7 的蛋白a 与抗体的共价结合来分离羊红细胞实验结果表明，抗体标记的羊红细 胞可被高效的分离出来 c h a t t e r j e i 屉等人硎建立了用血凝素修饰的聚苯乙烯磁性微球和自蛋白磁性 微球分离红细胞的方法修饰有血凝素的磁性微球具有良好的红细胞结合能力 白蛋白磁性微球与合成的聚合物微球相比较更具优势，因为经自蛋白磁性微球分 离后的红细胞能重新注射进入病人的体内 1 2 4 生物医学诊断 磁性复合微粒具有生物相容性和可降解性，无毒副作用，加之在外加磁场中 具有响应性，因而可被用于生物医学诊断领域中 表面偶联有核酸探针的纳米级磁性复合微粒可进入机体细胞核并与核内染色 体组合，因而具有很高的反应特异性闭a v i v i 等1 2 9 采用高强度超声法合成磁性 蛋白质微球，这种磁性复合徽球是由b s a g 覆氧化铁组成用五羰基铁或醋酸铁、 牛血清白蛋白( b s a ) 作反应物，在水或癸烷的溶液中进行高强度的超声振荡进行 合成这种磁性复合微球可在超声检查中作为回波对照剂 目前肿瘤诊断方法主要是建立在组织细胞水平的病理学检测方法，但该方法 只能在肿瘤形成后进行切片分析不能有效的对肿瘤进行早期诊断目前利用 磁性复合微粒进行肿瘤诊断得到了越来越广泛的应用，h a f e i l i 等人嗍用放射性 m 际定磁性靶向载体。采用( a b z 2 d o t a ) 作为螯合荆时，接着螯合铟与磁性微粒 键合，得到的放射磁性微球在血浆中具有较好的稳定性，表明n 标定的磁微球作 为治疗前的诊断工具能保证长期的观察t a k e s h i t a 等通过超顺磁性氧化铁纳米粒 与脂质体的结合对肝癌诊断进行研究，提高了直径3m m 以下的肿瘤检出率1 3 目 前，磁性复合微粒作为磁学共振成像的对照试剂在肿瘤诊断中得到了越来越广泛 应用( 如图6 所示) p 迥s u z u k i 等入网通过向聚乙烯z , - - 醇包被的磁性复合微粒 偶联特异性抗体，再通过静脉注射并靶向定位到裸鼠的肿瘤部位。2 4 , 1 , 时后进行 磁学共振成像检测，百分之五十的肿瘤部位可以明显地观察到指示信号目前美 国f d _ a 已经批准将葡聚糖磁性纳米粒子用于磁共振成像( m r i ) 的新型造影剂【蚓 8 图6 应用磁性复合微粒进行淋巴癌诊断 1 2 5 生物分子的分离纯化 核酸、蛋白质等生物分子物质的分离纯化是生物医学研究中的重要课题将 特异的蛋白质抗体或核酸探针固定在磁性复合微粒上，将微粒与生物样品共同孵 育后，可在磁场作用下分离表面固定有生物分子复合物的磁性复合物【3 毋通过改 变条件可将目的生物分子从磁性复合微粒上洗脱下来利用磁性复合微粒分离纯 化生物分子有以下的优点：较高的胶体稳定性使其更充分地与样品中反应 能较快地达到对需分离物质的结合平衡改变外界条件可方便、快速将生物分子 9 从磁性微粒上洗脱下来 磁性复合微粒已被用于蛋白质、d n a 、m k n a 以及其它生物分子的纯化s m i t h 等人闭利用硅包被的磁性复合微粒成功分离了核酸、多肽等多种生物分子( 如图 7 所示) 图7 应用磁性复合微粒分离纯化生物分子 z h m 等人【研建立了磁性复合捕获系统来筛选和分离，鉴别不同的d n a m r n a 这种磁性复合捕获系统是以偶联有d l 峨探针的硅复合磁性微球为载体，在样品浓 度极低( 1 盯坫m o l l ) 的条件下，仍可检测出只有一个碱基区别的d n a m r n a c h i 锄g 等人闭建立了从细菌细胞中纯化转染质粒d l 峨的磁性复合微粒体系该 体系利用聚乙烯修饰f c 3 0 4 磁性复合微球，将其与细菌细胞反应后提取质粒d n a ， 结果从l m l 的细菌培养液中最多提取出8 1 9m g 的质粒d l 呵a y a n g 等人p g l 利用 磁性壳聚糖复合微球成功进行透明质酸的纯化分离在p h 为6 的条件下1g 磁 性壳聚糖复合微球纯化出3 9r a g 的透明质酸 2 m r n a 分离纯化概述 生物遗传信息通常贮存于d n a 的碱基序列中在真核细胞中，基因组d n a 位于细胞核中的染色体上而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上。是 信使r n a ( m e s s a g er n a ，m r n a ) 将d n a 上控制蛋白质合成的遗传信息携带至 核糖体m r n a 的功能是把d n a 上的遗传信息精确无误地转录下来，由此决定 蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表达过程中的遗传信息传递过程( 如图8 所示) 因此，生物体内的m r n a 是人们研究生物机体遗传信息的重要工具构建c d n a 文库时，分离纯化的m r n a 是必不可少的反应模板，进行印迹杂交、r t - p c r ， 或者核酸酶s 1 和r n a 酶保护实验分析时，m r n a 样品通常比总r n a 产生更好 的结果，因为样品中m r n a 纯度可提高1 0 - 3 0 倍 图8 生龠遗传复制的中心法则 真核细胞的m r n a 分子具有5 端帽予( m 7 0 ) 和3 端的p 0 i y ( _ 5 崛巴( 通常 用p o l y ( a ，) 表示) 的特殊结构位于3 端的2 0 - 2 0 0 个腺苷酸组成的p o l y ( ”) 尾为真核m r n a 的提取纯化提供了极为方便的选择性标志即可利用o l i g “d t ) 与p o l y ( a i + ) 互补配对的原理，通过结合在固相在体表面的o l i g o ( d r 漪m r n a 捕获，然后通过清洗、洗脱步骤得到纯度很高的m r n a 以寡聚( d t ) 一纤维素 柱层析柱为最常用的m r n a 方法近年来以磁性复合微粒为载体分离纯化 m r n a 已成为重要的应用方向 2 i 棚g o ( d t ) 一纤维素柱分离纯化m r n a a v i v 和l e d e r i 棚l 最先建立了用o l g o ( d t ) - - 纤维素亲和层析法从大量r n a l l 中分离m r n a 的方法利用m r n a 3 末端含有p o l y ( a t ) r n a 尾巴与固定在纤 维素介质上的短链( 通常长度为1 8 - 3 0 个核苷酸) 删娴形成稳定的r n a - d n a 杂合链的原理来提取纯化m r n a 合成寡聚纤维素柱的工作最先由g i l h a m 开展1 4 由于o h g o ( d t 屿p o l y ( a + ) 只形成有限的d t - a 碱基对。起始层析缓冲液中需加入高浓度盐以稳定核酸双链 不含p o l y ( a ) 的r n a 从介质中洗去后，应用低盐缓冲液去除稳定双链结构，并从 介质中洗脱p o l y ( a + ) r n a g i l h a m 等入研究发现，各种腺苷酸的寡聚物能以温 度依赖的方式从o t i s o ( d t ) - 纤维素柱上洗脱下来p o l y ( a ) r n a 能用o u g o ( d t ) 层析柱选择洗脱，也能分批洗脱柱层析是大量( 大于2 5 u g ) 从哺乳动物细胞提 取纯化p o l y ( a + ) r n a 的较好的方法分批洗脱通常是较好的选择，因为收集的部 分相对较少，能够加快提取过程一般来讲o u g o ( d t ) 柱回收到p o l y ( a * ) r n a 占 r 1 q a 总量的1 一1 0 利用o u g o ( d t ) - - 纤维素亲和层析法分离m r n a 。首先将大量的细胞总r n a 溶液流经寡聚( d d 纤维素柱，在高盐缓冲液的作用下。m r n a 被特异地结合在柱 上当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，m r n a 被洗脱。第 一次洗脱后，将所流出液于6 5 c 加热5m i l l ，冷却至室温后再次上柱，收集流出 液经过两次寡聚( d r ) 纤维柱后，即可得到较高纯度的m r n a 将r n a 溶液 置6 5 c 中温育然后冷却至室温再进行纯化的目的是，其一破坏r n a 的二级结构， 尤其是m r n ap o l y ( a ) 尾处的二级结构，使p o l y ( a * ) 尾充分暴露，从而提高 p o l y ( a + ) r n a 的回收率；另一个目的是能解离m r n a 与r r n a 的结合否则会导 致r r n a 的污染。所以此步骤不能省略纯化的m r n a 在7 0 乙醇中可保存一年 以上( 一7 0 c ) 注意事项：1 整个过程必须防止r n a 酶( r n a s e ) 的污染2 将 r n a 溶液置6 5 c 中温育然后冷却的步骤不能省略3 通常用n a c i 配置十二烷 基肌氨酸钠盐溶液。十二烷基肌氨酸钠盐在1 8 c 以下溶解度下降，会阻碍柱内液 体流动。若室温低于1 8 c 最好用l i c i 替代n a c i 4 寡聚( d r ) 纤维素柱可在 4 c 贮存，反复使用每次使用前应依次用n a o h 、灭菌d d h 2 0 、上样缓冲液洗 柱5 哺乳动物培养细胞能提取的p o l y ( a * ) r n a ，约相当于上柱总r n a 量的 l - 2 。 o u g o ( d t ) - - 纤维素亲和层析法分离m r n a 也有操作过程复杂，费时较长，操 1 2 作过程中r n a 易降解和损失等缺点 2 2 磁性复合微粒分离纯化确m 近年来，以磁性复合微粒为载体分离纯化m r n a 已成为新的研究方向磁性 复合微粒分离技术利用表面固定有o t i g o ( d r ) 及外加磁场实现m r n a 的快速纯化， 避免层析操作过程中潜在样品损失磁性复合微粒通过其表面的功能团与 o l i g o ( d t ) 寡核苷酸探针偶联，在与组织总r n a 反应后，真核细胞m r n a 分子3 端p o l y ( a * ) r n a 的尾巴可通过碱基配对固定在磁性复合微粒表面，在磁场作用下 分离磁性复合微粒- 核酸杂交物的复合体，最后通过