（应用化学专业论文）双核铁（Ⅲ）配合物的合成及对DNA与磷酸二酯的裂解性能研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 人工核酸酶在新型限制性酶以及抗癌药物方面有着非常诱人的前景，开发具有高效 水解核酸的人工合成试剂是当前科研领域研究的热点。近二十年来，已经开发了许多合 成的金属核酸酶，但是它们对于d n a 的水解活性依然很低。如何提高这些金属酶的活 性是一个很大的挑战，本论文工作主要集中于通过对配体进行修饰来提高金属配合物对 于d n a 以及磷酸二酯的裂解活性。 首先，设计并合成了带有吖啶嵌入剂的金属配合物f e 2 i - 4 , ，d n a 裂解活性研究表明， 与不带有吖啶嵌入剂的母体金属配合物f e 2 l 。相比，新的配合物能够导致1 4 倍的速率提 升。吖啶嵌入剂与d 咐a 之间的相互作用通过紫外吸收滴定、圆二色光谱、粘度实验以 及d n a 热变性实验获得证实。水解机理通过酶连接实验、活性氧物种淬灭实验以及无 氧条件下的裂解实验证实。 在自然界中，核酸酶具有很高的活性，其活性来源除了活性中心金属离子的催化作 用外。在会属中心周嗣氨基酸支链上的功能基团也扮演了熏要的角色。赖氨酸、组氨酸 以及精氨酸上带有的工f 电荷残基被认为能够通过静电效应、氢键以及质子转移来稳定反 应的中间过渡态，从而协助会属离子对底物进行催化。基于该原理，本论文设计并合成 了带有双边氨基以及双边胍基的双核铁配合物f e 2 l c 与f e 2 l d 。d n a 裂解实验表明双边 氨基以及胍基的引入导致了会属配合物裂解活性的极大提升，单独配体以及游离的会属 离子并不能导致d n a 裂解证实了金属离子与氨基胍基之日j 存在着协同作用。紫外滴定 实验表明氨基胍基的引入同时能提升金属配合物同d n a 之间的结合力。 论文还设计合成了一系列带有d n a 结合单元( 双边吖啶、双边芘以及双边蒽) 的 双核铁配合物。d n a 裂解活性研究显示相同条件下，带有双边吖啶的双金属配合物f e 2 l c 具有最高的活性：在p h7 0 以及3 7o c 条件下，裂解速率常数能达到1 2 1 o - ls - 1 ，与 不带有嵌入剂的双核f e ( i i i ) 金属配合物f e 2 l 矗相比，活性能提升1 7 0 倍。同时吸收滴定 实验也显示f c 2 l e 具有最强的d n a 结合能力。 最后，以b n p p 及h p n p 为底物的动力学实验结果进一步证实了双核铁( i i d 配合物 对磷酸二酯有水解活性，氨基以及胍基的引入同样能提升双核铁配合物对磷酸二酯的裂 解活性。 关键词：人工核酸酶；d n a 裂解；双核铁配合物；嵌入剂；磷酸二酯水解 双核铁( i i i ) 配合物的合成及对d n a 与磷酸_ 二酯的裂解性能研究 s y n t h e s i so fd i i r o n ( i l i ) c o m p l e x e sa n dt h e i ra c t i v i t yi nc l e a v a g e o fd n aa n dp h o s p h o d i e s t e r s a b s t r a c t m i m i c k i n gt h ea c t i v i t i e so f n u c l e a s e si sc u r r e n t l ya na t t r a c t i v er e s e a r c ha r e ai nm o l e c u l a r b i o l o g ys i n c ea r t i f i c i a ln u c l e a s e sh a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n sa sn o v e lr e s t r i c t i o nc n z y m e sa n d a n t i e a n c e rt h e r a p e u t i ca g e n t s i nt h ep a s taf e wy e a r s ，v a r i o u ss y n t h e t i cm e t a l l o n u c l e a s e sh a v e b e e nr e p o r t e da sd n a h y d r o l y t i ca g e n t s n e v e r t h e l e s s t h e i ra c t i v i t yi ss t i l lm u c hl o w e rt h a n t h a to ft h ec o r r e s p o n d i n ge l l z y m e s s ot h ed e v e l o p m e n to fs y n t h e t i ca g e n t st oc l e a v ed n a w i t hh i g he f f i c i e n c yi saf a s c i n a t i n gc h a l l e n g e an e w d i f e ( 1 1 1 ) c o m p l e x ( f e 2 l b ) ，l i n k i n gaa c r i d i n eg r o u pa sd n a - i n t e r c a l a t o r , h a s b e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da sh y d r o l y t i cc l e a v i n ga g e n to fd n a c o m p a r e dw i t hf e 2 l a ( w i t h o u ta c r i d i n eg r o u p ) ，f e 2 l bh a sl e dt oa1 4 一f o l di n c r e a s eo ft h ec l e a v a g ee f f i c i e n c yo f p l a s m i dd n a a sar e s u l to ft h eb i n d i n gi n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n da c r i d i n em o i e t y t h e i n t e r a c t i o nh a sb e e nd e f n o n s t x a t e d b yu v - v i s i b l ea _ b s o r p t i o 玛c ds p e c t r a , v i s c i d i t y e x p e r i m e n ta n dt h e r m a ld e n a t u r a t i o ns t u d i e s t h eh y d r o l y t i cm e c h a n i s mi ss u p p o r t e db yt h e e v i d e n c ef r o mt 4d n a l i g a s ea s s a y ，r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) q u e n c h i n ge x p e r i m e n t a n dd n a c l e a v a g ee z p e r i m e n tu n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n i nn a t u r e ，t h eh i g hr e a c t i v i t yo fn u c l e a s e si sa t t r i b u t e dt ot h ec o o p e r a t i o no ft h ep r o t h e t i c m e t a li r o n sw i t hs e v e r a lf u n c t i o n a lg r o u p so ft h ea m i n oa c i ds i d ec h a i n sp r e s e n ti nt h ea c t i v e s i t e t h ep o s i t i v e l yc h a r g e dr e s i d u e so fl y s i n e ，a r g i n i n ea n dh i s t i d i n ea r et h o u g h tt os t a b i l i z e p h o s p h o r a n e l i k et r a n s i t i o ns t a t e sb ye l e c t r o n s t a t i ci n t e r a c t i o n s ，h y d r o g e nb o n d i n ga n d o r p r o t o nt r a n s f e r s e v e r a le x a m p l e so fs y n t h e t i cs y s t e m sh a v eb e e nr e p o r t e db a s e do nt h e s e f u n c t i o n s d r a m a t i c a l l ye n h a n c e da c t i v i t yw a so b s e r v e df o rt h es y s t e m sc o n t a i n i n gh y & o g e n b o n d i n gd o n o r s b a s e do nl a ，w er e c e n t l yp r e p a r e dt w on o v e ld i n u c l e a t i n gl i g a n d sl ca n dl d w i t hb i s a m m o n i u ma n db i s g u a n i d i n i u mg r o u p s ，r e s p e c t i v e l y t h e c o r r e s p o n d i n g d i i r o n c o m p l e x e sf e 2 l ca n df e 2 l dw e r eo b t a i n e d t h ed n ac l e a v a g ee x p e r i m e n ti n d i c a t e sam u c h m o r ep r o n o u n c e dd n ac l e a v a g ee f f i c i e n c yf o rt h e i n t r o d u c i n go fb i s a m m o n i u ma n d b i s g u a n i d i n i u mg r o u p s ，a n dt h ec o o p e r a t i v i t i e sb e t w e e nm e t a li o n sa n da m i n o g u a n i d i n e g r o u p sa r ee v i d e n c e db yt h ef a c tt h a tt h e r ei sn os i g n i f i c a n tc l e a v a g ea f t e ri n c u b a t i n gd n a w i t hn o n - m e t a l l a t e dl i g a n d s t h e r e a c t i v i t yo fd n ac l e a v i n gs y s t e m sc a nb ee n h a n c e dw h e nt h e i rs t r u c t u r e sc o m p r i s e g r o u p sw i t hh i g hd n aa f f i n i t y a si n s p i r e db yt h es t r a t e g y ，as e r i e so fd i n u c l e a ri r o n c o m p l e x e se o n j u g a t i n gd o u b l e a c r i d i n e ，d o u b l e p y r e n ea n dd o u b l e a n t h r a c e n em o i e t yw e r e 大连理工大学博七学位论文 s y n t h e s i z e d d n ac l e a v a g ea c t i v i t i e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e dt h r o u g hi n c u b a t i n gd n a i nt h c p r e s e n c em e t a lc o m p l e x e s a tt h es a m ec o n d i t i o n s t h ec o m p l e x ( f e 2 l e ) l i n k e dw i t hd o u b l c a c r i d i n eg r o u p si n t r o d u c e sar e m a r k a b l es c i s s i o no fs u p e r c o i l e dd n aw i t har a t ec o n s t a n to f l 2 l o - 1s - 1a tp s7 ，0a n d3 7o c ，a n dl e a d st oa1 7 0 - f o l di n c l e a o f t h ec l e a v a g ee 瓶c i e n c y w h e nc o m p a r e d 谢mai n t e r c a l a t o rl a c k i n gd i i r o n ( i i i ) c o m p l e x ( f e 2 l a ) f u r t h e r m o r e ，d n a b i n d i n gp r o p e r t ye x p e r i m e n t sw e l ec a r r i e do u tt h r o u g ha b s o r l a t i o nt i t r a t i o na n dr e s u l ts h o w s t h ef e e l eh a sa l s ot h eh i e s td n a 硪i n i t y i no r d e rt ov e r i f yt h ep h o p h o d i e s t e rc l e a v a g ea c t i v i t yo fd i i r o n ( 1 l i ) c o m p l e x e s ，as e r i e so f k i n e t i ce x p e r i m e n t su s i n gb n p pa n dh p n pa ss u b s t r a t e sw e r ec a r r i e do u t t h er e s u l t ss h o w t h ei n t r o d u c t i o no fa m m o n i u ma n dg u a d i n i u mg r o u p sc a ne n h a n c et h ea c t i v i t yo fd i i r o n ( i i d c o m p l e xt o w a r dp h o s p h o d i e s t e rc l e a v a g e k e yw o r d s ：a r t i f i c i a ln u c l e a s e s ；d n ac l e a v a g e ；d i i r o n ( i l i ) c o m p l e x ；i n t e r c a l a t o r ； p h o s p h o d i e s t e rh y d r o l y s i s i i i 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：陋日期：五删 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名： 导师签名： 辑) ! ：垒堡 垒斑 砑丑年旦月丛日 大连理工大学博士学位论文 1 文献综述 核酸是遗传信息的携带者和基因表达的物质基础。它在生物的生长、发育、繁殖等 正常生命活动中起着十分重要的作用。核酸结构的变化与生命的异常情况密切相关，如 遗传性疾病、肿瘤的发生、放射损伤等疾病的发生都是核酸结构变化的结果。目前，对 核酸的研究已成为现代分子生物学、医学和化学生物学的重要课题，同时在基因以及生 物技术领域的一些令人瞩目的成就已经迫使人们寻求有效的工具去操控核酸。 然而，在生理条件及非酶存在下，核酸具有超常的稳定性。在2 5o c ，p h = 7 的条 件下，r n a 的半衰期被估计大约是1 1 0 年，而d n a 的半衰期能达到百亿年，比地球自 身的年龄还要长i l “正是这样的稳定性确保了基因信息的保存，但是基因的表达和复 制、d n a 的损伤修复以及外来d n a 的消除都要涉及到磷酸酯的断裂，高的稳定性使得 对于d n a 的操控变得相当困难。在体内，这些问题依赖于水解酶、核酸酶以及拓扑酶 这些能有效地裂解d n a 的酶来解决。这些酶的活性中心主要是c “i i ) ，m g ( i i ) 和z n ( i i ) ， 它们在健化体系中扮演了一个不可或缺的角色。研究发现。移去金属酶中的金属离子会 导致酶失活，用其他金属离子取代酶中原有的金属离子也会引起酶的活性下降甚至丧失 4 - 7 。 能够裂解核酸的合成试剂，即人工核酸酶由于其具有重要的应用前景而受到科学家 的极大关注。一方面，入工水解催化莉可以作为生物模型系统去阐述相应的限制性酶以 及核酸酶的酶切机理；另一方面，人工核酸酶能够用做探测d n a 结构的探针，在分子生 物学领域能够作为常规d n a 或者r n a 的限制性试剂，另外在医药领域它还可作为抗癌 和化疗药物。在核酸裂解方面，它们甚至比天然核酸酶更具有优越性，天然核酸酶只具 有4 、6 或8 个碱基的序列选择性，而这远远不能满足对大片断d n a 或r n a 的精确操 控。在理论上，合成的具有高选择性的水解催化试剂是可行的，能转化为化疗药物从而 在分子水平上去阻碍基因表达。 1 1 以d n a 为底物的研究进展 目前所报道的人工核酸酶裂解d n a 的方式主要有两种：水解性断裂以及氧化性断 裂，前者是天然酶断裂d n a 所采取的方式。 双核铁( i i d 配合物的合成及对d n a 与磷酸二酶的裂解性自g 研究 1 1 1d n a 水解性断裂 1 1 1 1d n a 磷氧键水解断裂机理 o r0 h 图1 1 d n a 水解反应示意图 f 嗨1 1r e a c t i o np a t h w a yf o rd n ah y d r o l y s i s 通常认为的关于脱氧核糖核酸磷氧键水解的机理主要是氢氧根离子作为亲核试剂 去进攻磷原子得到一个五配位的磷中间体嘲，接着p - 0 3 键或者p - 0 5 。键f 在酶过程中通常 是前者) 断裂导致d n a 的裂解，并产生了r - o h 以及r o - p 0 3 ( h 2 ) 末端( 图1 1 ) 。其中， 中间体的裂解是决速步骤。 1 1 1 2 自由金属离子及单核金属配合物对d n a 的水解 在二十世纪九十年代，s c h n i e r 等人系统地报道了镧系金属离子对d n a 裂解的一些 动力学参数【9 】不同离子在饱和状态下显示了相似的最大活性( 妊。= o 7 - 1 0 1 0 。4s - l ， 3 7o c ，p h = 7 0 下) 以及不同的d n a 亲和性( 从l a ( m ) 到e u ( 1 1 1 ) i 茎渐增大) 。低的d n a 亲和性意味着d n a 实质性的降解必须保持高的催化剂浓度。相比之下，t m ( i i i ) , y b ( i i i ) 以及l u ( i i i ) t i p 使在较低的浓度下仍具有可观的反应活性，主要在于它们与d n a 有着非 常大的结合常数。在高浓度下，其反应活性反而下降，原因是由于莫自身分子的聚集导 致了活性物种形成得更少。 在所有镧系金属离子中，铈是比较特殊的，由于它必须达到一个稳定的四价氧化态 才能导致活性的产生。c e ( ) 比c e ( i i i ) 的活性要高很多，在o h7 0 以及5 0o c 下，水解 2 大连理工大学博士学位论文 二核苷酸的半衰期能够达到3 6h ，比自发水解提高了十一个数量级，其效率是其它镧系 金属离子的2 0 倍到1 0 0 0 倍，而且能够导致d n a 的双链裂解【l 。k o m i y a m a 等将这种 超凡的有效性归因于四价离子的拉电子效应【l ”。同时，c e ( i v ) 与p r ( i i i ) 混合后其活性能 够得到进一步提升”“。 对于生物系统来说，游离镧系余属离子具有很高的毒性，解决的唯一方法是同合适 配体形成稳定的配合物，稳定的配合物可以通过n 杂冠醚、席夫碱以及多胺多羧酸衍生 物络合相应的金属离子而获得( 图1 2 ) lj 3 】。但是仍然存在困难：首先是镧系金属离子使得 外配体的交换能力非常弱：另外催化活性的产生需要不饱和的配位点来容纳水以及底物 1 4 - 1 6 。在许多情况下，形成的配合物通常比单纯的金属离子的活性还低，主要是因为形 成配合物后正净电荷减少以及配位点的饱和导致的，而中性配体比如冠醚以及n 杂冠， 虽然它们配位能力不强，但对于保持金属离子的活性是一个比较好的选择【l 6 j 。 y 。y c h z c o n f i r 图1 2 用于络合镧系金属离子的配体 f i g 1 2t h em e t a l l i cl i g a n d sf o rl a n t h a n i d ei o n s 除镧系金属离子之外，其它游离态的金属离子很少能够使d n a 水解，但一些基于 过渡金属离子的配合物显示了核酸的水解活性。1 9 9 6 年，d i x o n 等人报道以t a m e n ( 图 1 3 ) 作为配体的三价钴配合物在p h7 6 以及3 7o c 下裂解质粒d n a 的速率常数为5 1 0 - 5s - , t m ，但所需要的配合物的浓度需要高达1m m ，显示了金属催化剂与底物之间的 结合力并不强，由于闭环的d n a 能够被连接酶连接证实它的机理是水解裂解，同时这 个化合物也显示了它对单链d n a 有着裂解活性。 另外几个c u 配合物也显示了催化d n a 水解的性能，b u r s t y n 等首次在1 9 9 6 年报道 了一例以t a c n 作为配体的c u 配合物( 图1 3 ) ，在p h7 8 和5 0o c 条件下，2 5 州的配 合物水解d n a 的速率常数为1 5x1o _ 5s - 1 【1 8 】。在高浓度下，反应活性反而减少意味着可 能形成没有活性的二聚体。化合物也显示了它能够对d n a 产生单链裂解，在无氧条件 下其活性降低3 0 ，显示伴随着水解裂解的同时还有氧化裂解【l 。此后，f u i i i 等人报 双核铁o i i ) 配合物的合成及对d n a 与磷酸二酯的裂解性能研究 h 2 n 、 n h ， “越艇h o 一套n h ： n h ，2 t a c h n e a r n i n e 图1 3 形成单核配合物后对d n a 有裂解活性的多胺配体 f i g 1 3s t r u c t u r e so f s o m e p o l y a m i d e l i g a n d su s e d f o r t h e f o r m a t i o n o f m o n o n u c l e a r c o m p l e x e s a c t i v ei nd n a c l e a v a g e 道了t a c h c u 配合物在氧存在条件下能够催化d n a 裂解( 图1 3 ) t 2 0 l ，饱和动力学实验 得到的。值与忍值分别为1 2 l o 。s - 1 ，1 3 1 0 4 m 。1 。相当于7 5 洲条件下裂解d n a 的半衰期是2 0 分钟，另外几个以大环和线性三胺为配体的c u 配合物并没有显示活性。 基于这些测试表明：一个有着比较强的d n a 亲和力的体系比如t a c h c u 配合物作为 催化剂有可能对底物的裂解产生更高的活性。c o w a n 等人的研究显示天然的氨基糖环的 c u 配合物如n e a m i n e 对d n a 显示了非常有效的裂解活性( 图1 3 ) 瞄1 ，2 2 j ，饱和动力学常 数。为1 2 1 0 4 f 1 ，局值为2 4x1 0 5 m - 。高的d n a 亲和性归因于糖环上氨基的正 电荷能够与d n a 紧密结合，这使该体系在低浓度下有着非常有效的活性( 2 5 州下，半 衰期约为2 6m i n ) ，水解机理被无氧实验以及酶成功的连接证实。国内杨频教授课题组 采用c l l ( i 聃组氨酸体系同样对d n a 产生了水解田l ，在p h6 0 以及3 7o c 下，lr a m 浓 度的该体系裂解质粒d n a 的反应速率常数能达到0 7 6h - 1 。 1 1 1 3 双金属配合物 天然核酸酶其超凡的催化有效性常常依赖于两个或多个金属离予的协同作用，在已 经获得的蛋白x 单晶衍射结果显示：活性中心位点存在多个金属离子，彼此之间的距 离非常近。这从另一个侧面反映出：相应地设计人工核酸酶时金属离子之间的空间位置 是至关重要的，它可以确保同底物之间有着多重的联系，以及能够发挥金属离子对磷酸 酯水解作用的优势( 路易斯酸活化、亲核活化以及离去基团活化) 。基于这些原因，近年 来对人工核酸酶的设计与研究主要集中于双核以及多核金属配合物【2 4 j 。 4 管p 大连理工大学博士学位论文 a b 图1 4 已经报道的用于络合镧系金属离子的双核配体 f i & 1 4b i m e t a u i cl i g a n d sf o rl a n t h a n i d ei o n sr e p o 恤ab ys c h n e i d e r ( a ) a n dz h u ( b ) 1 9 9 6 年，s c h n e i d e r 等人合成了一个具有三十个原子组成的氮杂冠的大环配体f 图 1 4a ) ，该配体能鳌合两个e u ( i i i ) 或p “i i i ) 形成相应的双金属配合物【2 5 1 。在p h7 o 和3 7 o c 条件下，p r ( i i i ) 配合物能够提升d n a 裂解( 。= 1 8 l o - 4 s - l ，忍= 3 0 1 0 3 m - 1 ) 然而。该配合物的活性与金属离子相比仅仅只有两倍的提势。相比之下，由朱等人摄道 的含有大环席夫碱的双核e r ( 1 l i ) 配合物具有更高的活性( 图i 4b ) ，在p h7 0 和3 7o c 下 降解超螺旋d n a 的速率常数能达到1 0 l o 刁s - 1 2 0 1 ，而不足之处在于：由于与底物之间 的结合能力弱( 墨= 1 0 xl 矿m 。1 ) ，导致d n a 的快速裂解依赖于高的催化剂浓度。 图1 5 由q u e 等报道的用于络合c e 离子的双核配体 f i g 1 jb i m e l a l l i el i g a n d sf o rc ei o nr e p o n e db yq u e 2 0 0 1 年，q u e 等人报道了一个双铈配合物( 图1 5 ) ，在p h8 0 和3 7o c 下，1 0 灿l 的c e 2 ( m ( n 吣裂解质粒d n a 的速率是1 4 1 旷s _ 1 ，相当于1 4h 的半衰期口刀，同时该 配合物能对d n a 产生双链的裂解并且具有立体选择性( 超过9 0 的裂解发生于i - 0 3 端) 。 双核铁0 i i ) 配合物的合成及对d n a 与磷酸二酯的裂解性能研究 h md t p b 图1 6 已经报道用于水解d n a 的双核铁( i i i ) 配体 f i g 1 6b i m e t a l l i cl i g a n d sf o rf e ( m ) r e p o r t e db ys c h n a i t ha n dq u e ( h p t b ) , a n dl i u ( d t p b ) f e ( 1 1 1 ) 存在于某些磷酸酶中，然而它很少被应用于人工核酸酶。迄今为止为数不多 的关于三价铁的配合物都是双核的，而且都是以水解方式对d n a 进行的裂解 2 s - s o l 。其 中活性较高的两例配合物的配体都是苯并咪唑的衍生物( 图1 6 ) ，分别是h t p b 以及 d t p b ，q u e 等人在1 9 9 4 年报道了第一例双核铁( i i i ) 配合物，并显示其具有相当高的活 性i s 0 1 ，仅1 0i i m 配合物在p h8 0 和2 5o c 下，超螺旋形式的d n a 立即被完全裂解，裂 解程度依赖于配合物的浓度，但并不随反应时间的增加而增加，产生的d n a 片断与水 解裂解的片断一致，裂解产物线性d n a 能够通过酶连接显示了仅有p 0 3 键裂解的产物 形成，高立体选择性也被3 及5 标记实验证实。但是仍然存在不足，此催化剂裂解d n a 需要氧化条件，必须有h 2 0 2 或者0 2 以及还原剂( 二硫苏糖醇或者抗坏血酸) 存在。t e c i l l a 等人认为金属离子通过键合过氧化氢作为亲核试剂，从而对磷酸二酯键产生了异乎寻常 的裂解活性。由刘长林教授等人报道的第二例双核三价铁配合物f e 2 ( d t p b ) 同样具有非 常高的活性 2 9 1 ，在1 0 0 m 浓度以及p h8 0 和3 7o c 条件下，裂解超螺旋d n a 的速率 常数高达2 1 1 0 - 3f 1 ，相当于半衰期为五分钟，而且裂解反应并不依赖于氧气存在， 线性d n a 同样能用连接酶连接，证实了p - 0 3 键的断裂以及水解机理的发生。同时配 合物对d n a 显示了很高的亲和性( 凰= 1 1 0 5m 以) ，分析来源于双金属结构具有高价的 正电荷，与其他双核金属配合物比较显示了两个金属离子之间的p - o 桥键( 来源于外配 体乙酸) 以及易解离的外配体b f 4 一在活性的提升中扮演了关键的角色。一方面它能确保 金属离子之间合适的距离，另外易解离的外配体能为底物提供一个开放的配位点。 6 q q 西q q 大连理工大学博士学位论文 图i ，7z n o i ) 七肽配合物结构( a ) 化学结构，( ”二级结构，( c ) 与d n a 键合的模式 f 皓1 7c h e m i c a ls t r u c t u r e ( a ) ，s e c o n d a r ys t r u c t u r e ( b ) a n dp r o p o s e dm o d eo f b i n d i n g t od n ao f s c r i m i n sz n ( 1 1 ) - h e p t a p e p t i d ec o m p l e x 基于c u ( i o 及z n ( 1 d 双核配合物体系很少能显示高的催化活性【”，3 2 1 。仅有的一个例 外是s e r i m i n 等人报道的一个以七肽为配体的双核z n ( i i ) 配合物p 习( 图1 7a ) ，在生理条 件下，3 6u m 的配合物裂解质粒d n a 的速率常数为1 0 l o 巧s - 1 ，由于存在有几个a 取代的氨基酸，肽键在某种程度上形成折叠的构象使得由t a c n 鳌合的两个z n 离子之 间的距离在6 a 左右，虽然这个距离比双核水解酶中两个金属离子的距离远，但是该体 系比相应的单核类似物的活性提高了2 0 倍，显示了该体系中两个z n 离子的协同作用。 为了证实金属离子之间的协同作用，s c r i m i n 提出了催化剂与d n a 键合的模型( 图1 7 ”， 由于b 型d n a 链中两个相邻的磷酸酯的距离是7a ，七肽可能利用自身的两个大环与 三个相邻的磷酸酯结合，迫使中间的磷酸酯与两个金属离子作用，从而使两个锌离子能 相互协同作用促进d n a 水解。 1 1 1 4d n a 亲和基团的引入 从d n a 氧化裂解试剂的发展来看，一般认为当裂解试剂结构单元中含有高的d n a 亲和基团时，它们的裂解活性能够得到很大提升( 图1 8 ) 【3 伯7 】，同时某种程度上能够提高 其序列选择性，这为我们获得真正意义上的人工核酸酶提供了一个思路。 7 双核铁( i i i ) 配合物的合成及对d n a 与磷酸二酯的裂解性能研究 涮h f i g1 s 带有d n a 亲和基团的氧化裂解体系 f i g ，1 8t h eo x i d a t i v ec l e a v i n ga g e n t sw i t hd n a - a f f i n es u b u n i t 比较容易想到的方法是在催化体系中引入能够提升d n a 亲和性的嵌入剂。但事实 上，有关将嵌入剂连接到金属配合物作为水解试剂的报道相当地少。而且研究显示嵌入 墓团的引入对反应的活性的影响并不总是正面的。举倒来说，上面提到的$ c r i m i n 所报 道的七肽z n 配合物如果在n 端引入吖啶嵌入剂，在低浓度下有着高的活性，但随浓度 升高其反应活性反而降低。 早在1 9 8 7 年。由b a r t o n 及其研究小组报道的第一例人工核酸酶是在一个钉嵌入剂 的基础之上引入两个具有金属离子键合能力的多胺配体( 图1 9a ) i ) ”。当配体与两个z n ( d 或者c d ( i i ) 结合后能够高效地裂解d n a 。在p h8 5 和2 5o c 下，7i t m 催化剂经4h 能 使4 0 的超螺旋d n a 降解( 一级反应速率常数为3 0 l o - 5s - 1 ) ，连接实验证实了水解反 应随机地发生于p - 0 3 t 以及p 0 5 键。然而。这个配合物与金属离子的结合常数非常低， 需要加入大大过量的金属离子才能保证高的活性。 在此之后，b a r t o n 研究小组将能与d n a 形成沟槽键合的铑嵌入剂连接到一个由多 肽络合z n ( 1 i ) 的裂解单元中( 图1 9b ) 【3 9 柏。该体系在p h 6 5 和3 7 。c 下能够提升质粒d n a 裂解( 5 小浓度下的数率常数为2 5x1 0 - 5s - 1 ) ，同时能形成双链d n a 裂解，产物片断分 析显示裂解发生于p 0 3 端，对5 p u p y - p u - p y 3 有一定序列选择性( 裂解发生于p y 位) ， 推测是铑嵌入剂能选择性结合d n a 的结果。研究显示铑嵌入剂对活性提高有十分重要 的作用，如果用其它的铑配合物或者乙踺代替时，体系对d n a 裂解没有反应活性。 8 大连理工大学博士学位论文 l ， r h 2 “、 c g 洲”啬 k 工s 0 2 洲、 l 、嗍： g = g s 图1 9 由b a r t o n 等人报道的基于钌，铑嵌入剂的人工核酸酶 f i g 1 9 a r t i f i c i a ln u c l e a s e s b a s e d o n m t h e n i m n r h o d i u m i n t e r c a l a t o r r e p o r t e d b y b a r t o na n d c o w o r k e r s s c h n e i d e r 研究组将两个萘通过六个碳的烷基链连接到一个氦杂冠醚的配体上，该配 体络合e u ( i i i ) 之后有d n a 裂解活性( 图1 1 0a ) ”6 4 ”，但是结果却令人困惑，由于该体系 与单纯的金属离子相比活性的提升并不是源于与d n a 亲和性的提高，事实上，该体系 对d n a 的亲和性反而下降了。在此之前，n a k a m u r a 以及h a s h i m o t o 通过调查不同镧系 金属离子存在条件下菲啶嵌入剂连接到羟肟酸体系的催化活性，发现嵌入剂与催化基团 之间的连接臂长度对反应活性扮演着不容忽视的角色( 图1 1 0b ) 4 2 ，4 3 1 。 这一结论后来也被t o n e l l a t o 等人证实，该研究组合成了一系列以环己三胺为裂解 基团，以蒽醌为嵌入剂通过不同烷基链连接起来的催化体系( 图1 1 1a ) i 删。在5 曲i 浓度 下，含有8 个碳原子连接基的衍生物具有最高的裂解活性( p h7 以及3 7o c 下，反应速 率常数为4 4 l o 巧r 1 ，饱和动力学结果显示键合常数弱= 1 1 0 4 m - 1 ，与早期报道的葸 9 双核铁( i ) 配合物的合成及对d n a 与磷酸二酯的裂解性能盟究 分h k o 删国 n 7 0 h h 图1 1 0 由s c h n e i d e r 以及n a k m n u r a 报道的带有嵌入剂的镧系金属离子配体 f i g 1 1 0l a n t t w n i d ei o n sl i g a n d sc o n j u g a t e dt oi n t e r c a l a t o rr e p o s e db ys c h n e i d e r ( 毒) a n dn a k a m u m 图1 1 1 ( a ) t o n e l l a t o 等人报道的连有葸醣的z n ( 1 1 ) 配厶物( b ) 计算得到带有最短连接基( 左) 与 最长连接基( 右) 和d n a 的键合模式 f i g 1 i ia n t h r a q u i n o n e z n ( 1 1 ) c o n j u g a t e sd e s c r i b e db y t n n e l l a t o ( a ) a n d e a c u l a t e d m o d e o f d n a b i n d i n go f t h es h o r t e s t ( b ，n = l ，l e f t ) a n dl o n g e s ta n a l o g ( b n5 3 ，r i g h t ) 醌结合d n a 的键合常数一致。相对于没有蒽醌连接的配合物，活性能提升1 5 倍不同 链长的催化体系比较显示活性随链长的增加而增加，最短链长( 4 个碳原子的连接臂) 的 催化剂基本上没有活性，这可能是因为短的连接基导致了水解基团的空间位置不便于对 1 0 大连理工大学博士学位论文 d n a 的磷酸二酯键产生作用。这种解释也被d n a 与水解试剂的分子模型计算结果证实 ( 图1 1 lb ) 。 c 飘i h z n 卜翼k 。h 另外一种区别于嵌入剂，但同样能有效提升d n a 亲和性的方法是在裂解体系中引 入带有正电荷的铵盐或者胍盐。磷酸二酯的负电性能够导致这些正离子的铵盐或者胍盐 对d n a 有很好的亲和性1 4 5 , 4 6 1 。国内陆国元教授课题组将胍基引入到t a c n 衍生物体系 中，由于与d n a 的结合能力增大，其水解活性能提高2 - 3 倍( 图1 1 2 ) ”。s c h n e i d e r 等 将四氮杂环十二烷与三甲基铵通过不同长度的链连接起来，这些配体与钴形成配合物后 在生理条件下对d n a 裂解都显示了饱和动力学【4 7 t ，且最大反应速率常数一致( 2 l 矿 s - 1 ) ，同时该系列配合物对d n a 的键合常数随链长的增加而增加( 从i i 0 3m - 1 到5 5 1 0 3 m 。1 ) ( 图1 1 3 ) 。 r - h ( ( c y c e n ) c o ) a q ) r t ( c h 2 ) 3 - n + ( c h 3 b r = ( c h 2 ) 4 - n + ( c h 3 ) 3 r t ( c h 2 ) 5 - n + ( c h 3 ) 3 r f c h 2 ) 6 - n + ( c h 3 ) 3 r 一( c h 2 ) 6 - n + $ h 3 ) 2 - c f q ) 6 - n + ( c h 3 r t i ( c h 2 ) 6 - n + ( c h 3 ) 2 1 3 - c m r i ( c h 2 ) 6 - n + ( c h 3 ) 2 1 2