（生物化学与分子生物学专业论文）超嗜热菌亮氨酰trna合成酶的高表达和一步纯化氨基酰trna合成酶复合物结构和功能的研究.pdf

中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 2 ) 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验数 据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：了羹参 日期：) 钟6 年6 月f 日 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使用学位论 文的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电子文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；生科院可以公布论文的全部或部分内容，可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：丝导师签名日期：妥壹j 史盈壹控降生塑垡璺墨! 里照生盐茎堑毙盥盥篮垂 一一! 童基 超嗜热菌亮氨酰t r n a 合成酶的高表达和一步纯化 氨基酰t r n a 合成酶复食物结构和功能的研究 凌麓( 生耨 琶学与分子生鞠掌专翌) 导师；王慝多研究爨 搁要： 超嵴热菌洲玎馘日c o 肛“5 ) 亮氨酰，t r n a 合成酶，d p - l c u r s ，是已知唯一 的杂合二体亮氨瀚一i r n a 合减酶。它琶禽a 和两个弧簇，分子聚分踊爱7 4 0 k d 。翮3 3 。5k d a 。缡鹨巍妲基的蒸凶被克隆进入p s b e t - b 载体，荠褒其序列翦 添加编码6 个组氨酸的寡核营酸 段。p s b e t - b 载体含有编码稀有的大肠杆菌 r 胁幽p r 础 新c d l i ) t r n a “( a g a a g g )a r g u 基因，该撼因有助于含有高频率 a g 山a g g 密码予晌部。l e u r s 在五c o l i 中大量表达。编码p 旺纂的基戳被克醚 遴入p e t - 1 5 b 载体。两令垂篷质精被荚转诧进入鬟c o l ib l 2 1 一c o d o n p t u sp e 3 ) 簿株，进嘲表达耩冈产e 部一l e u r s 。该酶的娃q e 基n 一端带r 自 6 个组氨酸，利用 n i n t a 亲和层析纯化，从2 5 0 毫 培养驰中得到7 毫克纯化的邮。l e u r s 。n “ 编的纽氨酸对酶的氮幕酰化活力没有影响。 入藏囊亮氮髓一t r n a 台减添( h c l e u r s ) 楚一拿多合成戆复合耪( a a r s 复 合物) 的缀成成分，这与以游离形式存夺的原核和低等奥核7 i i 物的亮氨醮- t r n a 合成酶( l c u r s ) ，白息著不同。在本实验室已经纯化了h c l c u r s 的皋础 j ，本 史国盘茔隧垒堑垡篷鱼纽鱼塞物学研戴盟监监塞 一一 盘篮 文作者避步研究了它的性质。由于h c l e u r s 和原核及低等真核生物f | ：】k u r s 稳范具有突出静c 一未端延摔获羧，嗣瑙殛虫表达系统，纯仡了跤失c 来端延缔 默段戆突变酶( a c h c l e u r s ) ，测定- g a c h c l e u r s 秘h c l c u r s 埘a t p ，宠氧酸 羊ut r n a 的动力学常数，热稳定性，以及在2 9 3 t 细胞中的定位，证明了这两种 酶的上述性质都没有显蒋蓐异。进一步的体内和体外实验证明，h c l e u r s 的c 末端延伸虢段凳浚酶和a a r s 爱合物中另碱分一入艟艨精氨黼，t r n a 合成酶 ( h c a r g r s ) 稠强 乍明熟位点，题令黪鳃相互 乍翅莰透过h c l e u r sf | 勺c 本端延 仲肽段刺h c a r g r s 的n * 术端延伸胀段j 行。 高等真核生物的氨i _ l l ；酰一t r n a 合成酶复台物( a a r s 复合物) 的功能日1 j 】 还知之越少。p 4 3 ，p 3 8 荆p 1 8 是a a r s 复合物的重要结构蛋f t 质，纯化了这三 种焦矗臻，琴 究了它们对h c l e u r s , ；i i a c h c l e u r s ，h c a r g r s 和n 一束端懿誊挚获段 缺失熊人腿质糖氨酰- t r n a 合成酶( a n h c a r g r s ) ，以及不同种麒柬源的l e u r s 的活力影响，第一次证 婀厂这j 种车 l f 助隧【子对a a r s 的活力具有促进作用，这 种促进作用勺延伸的术端肽段没有必然火系，鼍种崮予对i e u r s 的促进作刚还 共有静弼争一性。结合以盼的灾验缮粜，对a a r s 复合戆影躐黔缘嘲鞠行使静 功进行了探讨。 关键词：氨基酰一t r n a 合成酶( a a r s ) ， 6 一l e u r s ，a r g u ，氟瑟酰一i r n a 合成 簿复合黝，亮氨虢一t r n a 合或黪，精氨酝t r n a 合城酶，琵虫袭这系统，末端 结搬域，p 4 3 + p 3 8 ，p 1 8 ，a r c l p 主国登鲎睦圭堑垡生量塑照生堑堂盟篷盟谴迨垂 遗基 h i g h l e v e le x p r e s s i o na n ds i n g l e s t e pp u r i f i c a t i o no fl e u c y l t r n a s y n t h e t a s ef r o ma q u i f e xa e o l i c u s t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fa m i n o a c y l 一t r n as y n t h e t a s ec o m p l e x c h e nl i n g ( b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o re n - d u ow a n g a b s t r a c t ： a a e o l i c u sl e u c y l t r n as y n t h e t a s ei st h eo n l yk n o w nh e t e r o d i m e r i cl e u r s ， c o n s i s t i n go ft w os u b u n i t sw i t hm o l e c u l a rm a s s e so f7 4 0 k d aa n d3 3 5 k d a ，a n d n a m e d 旺8 一l e u r s + t h eg e n ee n c o d i n g 娃s u b u n l tw a sc l o n e di n t op s b e t - bv e c t o r , s y n t h e t i co l i g o n u c l e o t i d ee n c o d i n gs i xh i s t i d i n er e s i d u e sw a sa l s o i n s e r t e di nf r o n t o fas u b u n i t p s b e t - bv e c t o rc o n t a i n i n ga r g ug e n e ，w h i c he n c o d e sar a r eec o i l t r n a m g ( a g a a g g ) ，t h ea r g ug e n eh e l p sa a e o 矗c u sl e u r s ，w h i c h c o n t a i n s a g a a g gc o d o n si ne x c e p t i o n a l l yh i g hf f e q u e n c 弘e x p r e s sw e l li ne - c o l i t h e g e n ee n c o d i n gbs u b u n i tw a si n s e r t e di n t op e t - 1 5 bv e c t o r ec o l ib l 2 1 - c o d o n p l u s ( d e 3 ) c e l l sw e r et r a n s t b r m e d w i t ht h et w or e c o m b i n a n tp l a s m i d st op r o d u c e c 【一l e u r sw i t hah i s 6t a ga tt h en - t e r m i n u so fc cs u b u n i t + t h ee n z y m ew a sp u r i f i e d b ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yo nn i n t as u p e r f l o w a b o u t7m gp u r i f i e dc c b _ l e u r s w a so b t a i n e df r o m2 5 0m lc u l t u r e t h eh i s 6 一t a ga tt h en - t e r m i n u sd i dn o ta f f e c tt h e a m i n o a c y l a t i o na c t i v i t yo ft h ee n z y m e 。 1 史国型芏隆生垫垡堂墨塑丝生堑茎盟嵬驻壤造塞一一盘垦 h u m a nc y t o s o l i cl e u c y l * t r n as y n t h e t a s e ( h c l e u r s ) i so n ec o m p o n e n to fa m a c r o m o l e c u l a ra m i n o a c y l t r n as y n t h e t a s ec o m p l e x ( a a r sc o m p l e x ) t h i si s u n l i k ep r o k a r y o t i ca n dl o w e re u k a r y o t i cl e u r s st h a te x i s ta sf l e es o l u b l ee n z y m e s 。 h c l e u r sh a sb e e np u r i f i e di no u rl a b o r a t o r yb e f o r e ，a n ds e v e r a lc h a r a c t e r so fi t h a v eb e e nd e t e r m i n e d s i n c eh c l e u r sh a sal o n gc - t e r m i n a le x t e n s i o nt h a ti sa b s e n t f r o mb a c t e r i a la n dy e a s tl e u r s s ，ac - t e r m i n a l8 9 一a m i n oa c i dt r u n c a t e dh u m a n c y t o s o l i cl e u c y l - t r n as y n t h e t a s e ( a c h c l e u r s ) w a sh e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s e di na b a c u l o v i r u ss y s t e ma n dp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t y i tw a sf o u n dt h a tt h ek i n e t i c 羁s 睡n so fk 王嚣u 获sa n da c h c l e u r s 如fa t p , l e u c i n ea n dt r n a 山j 箍t h ea t p p p i e x c h a n g ea n dt r n al e u c y l a t i o nr e a c t i o n sw e r es i m i l a r t h et w oe n z y m e s a l s oh a v e s i m i l a rt h e r m a ls t a b i l i t i e sa n di d e n t i c a ls u b c e l l u l a r1 0 c a l i z a t i o n si n2 9 3t c e l l s n v i l oa n d nv i t r oe x p e r i m e n t s ，h o w e v e r ，s h o wt h a tt h ec t e r m i n a le x t e n s i o no f h u m a nc y t o s o l i cl e u c y l - t r n as y n t h e t a s ei si n d i s p e n s a b l ef o ri t si n t e r a c t i o nw i t ht h e n - t e r m i n a lo fh u m a nc y t o s o l i c a r g i n y l - t r n as y n t h e t a s e ( h c a r g r s ) i n t h e m a c r o m o l e c u l a rc o m p l e x o u rr e s u l t sa l s oi n d i c a t et h a tt h et w om o l e c u l e si n t e r a c t w i t he a c ho t h e ro n l yt h r o u g ht h e i ra p p e n d e dp e p t i d e s 。 t h ef u n c t i o n so fa m i n o a c y l t r n as y n t h e t a s ec o m p l e x ( a a r sc o m p l e x ) a r el i t t l e k n o w nu n t i l ln o w * , p 4 3 ，p 3 8a n dp18a r et h et h r e ei m p o r t a n ts t r u c t u r a lp r o t e i n si n a a r sc o m p l e x h e r e i n ，t h et h r e ep r o t e i n sw e r ep u r i f i e d ，a n dt h e i ri m p a c t so nt h e a m i n o a c y l a t i o n a c t i v i e so fh c l e u r s ( h u m a nc y t o s o l i cl e u r s ) ，a c h c l e u r s ( c t e r r a i n a lt r u n c a t e dh c l e u r s ) ，h c a r g r s ( h u m a nc y t o s o l i ca r g r s ) ，a n h c a r g r s f n t e r m i n a lt r u n c a t e dh c a j - g r s ) a n dl e u r s sf r o my e a s t ，叠c o l ta n d a ，a e o l i c u s 4 生基盘囊瞳圭盟也生墨麴救生垫芏娥窟堑谴盘缝童 盔熊 w e r ed e t e c t e d i tw a sp r o v e df o rt h ef i r s tt i m et h a tt h et h r e ea u x i l i a r yf a c t o r s i m p r o v et h ea c t i v i e so fa a r s ，w i t ho rw i t h o u tt h et e r m i n a le x t e n s i o np e p t i d e so f a a r s t h r e ef a c t o r so n l ym o d u l a t et h ea c t i v i t yo fl e u r sf r o mh u m a n ，n o tl e u r s s f r o my e a s t ec o i lo ra a e o l i c u s i tw a sp r o p o s e dt h a to n eo ft h er e a s o n sf o ra a r s c o m p l e xf o r m a t i o ni st of a c i l i t a t et h ea m i n o a c y l a t i o n o ft r n a c o m b i n e dw i t ho t h e r e x p e r i m e n tr e s u l t s ，t h ep o s s i b l ef u n c t i o n s o fa a r sc o m p l e xw e r ed i s c u s s e d t k e yw o r d s ：a m i n o a c y l - t r n as y n t h e t a s e ，d f ；一l e u r s ，a r g u , a m i n o a c y l t r n a s y n t h e t a s ec o m p l e x ，l e u c y l t r n as y n t h e t a s e ，a r g i n y l t r n as y n l h e t a s e ，b a c t o b a c b a c u l o v i r u se x p r e s s i o ns y s t e m ，t e r m i n a le x t e n s i o nd o m a i n ，p 4 3 ，p 3 8 ，p 1 8 ，a r c l p 主旦登生堕生塑韭鲎兰垫照生堑堂嫩宝盟谴盘途圭 一 盎羼 第一部分超嗜热菌a q u i f e xa e o l i c u s 亮氨酰- t r n a 合成酶的离 表达和纯化 亵要；超嗜热蘧掣掣秽汝g 菇翎s ) 亮氨溅一t r n a 套成酶，程一l e u r s ，是已熟暌 一的杂合亮氨酰一t r n a 合成酶。它包台0 【和b 两个亚基，分了懿分别是7 4 。0k d a 和3 3 5k d a 。编码c l 诚基的基凼被克隧进入p s b e t - b 载体，并在其序列阿添加 编码6 个组氨酸韵寡核苷酸片段。p s b e t - b 载体俞有编码稀有的大肠杼黼 ( e s c h e r i c h i ac o l i ) l 醛a 趣( a g 鼬a g g ) 静a r g u 基嗣，该基透有韵于含有高频率 a g a a g g 謇码。r 的。【b l c u r s 在ec o l ir f l 大最表达。编码业基的基闲被克隆 进入p e t - 1 5 b 裁体。两个重组质粒被基转化进入ec o l ib l 2 1 - c o d o n p l u s ( d e 3 ) 菌株，进而表返基冈产生仅b l e u r s 。该酶的吼亚基n 一湍带有6 个组氨酸，利用 n i n t a 亲和层拆魏纯，飙2 5 0 毫舞靖筹墓中褥至l7 藏克纯纯豹a 一l e u r s 。n - 端的缉氨酸对酶的氨綦酰化活力没台影响。 关键诩：d 3 一l e u r s ，a r g u ，商表达 1 引蠢 氨基酰t r n a 合成酶( a a r s ) 是类占老的蛋自质，参与生物体遗传密码 的解码过稃【l 】。乍物体中散含有2 0 种a a r s ，与2 0 种氨纂酸一对应。在 蛋自质t 物会成过程中，它嚣l 篷伲氢蒸酸弓其对应t r n a 之阚的酝偬及应，臻 1 0 主国塑茔睦生些岱生当麴照生盐堂嫩塞盟蠖盘逢圭 鱼蒇 而确保了从m r n a 到虽白质翻译过程的高度精确性。根据保守序列和特征性结 构花式的不问，2 0 种a a r s 可以被分戚两大类，各包括1 0 种a a r s 。第1 类a a r s 整诧活性中心是一拿国。锄缝穆缓簸豹r o s s m a n n 挢叠结孛鼋躐，它楚棱营类底 物的结合部位，它具有两段保守序列h i g h 秘k m s k s ，一般氨基酰化的部位 在t r n a3 ，术端腺苷酸的核糖的2 位羟基上；第1 i 类a a r s 的催化结构域幽7 股反平行b 折疆组成，极少保守序列，氨基酰化的部位存t r n a3 术端腺苷酸 麴核糖的3 位羟基上。 a a r s 催化鲍氯基醮位反废分两步完成。楚一步：氯基酸的活化反应，氮 基酸攻击a t p 的a 磷酸基团，产生被活化的巾问体氨基酰- 腺苷酸和焦磷酸。 a r g r s ，g l n r s 和g l u r s 的第一步反应需要t r n a 的参与，其他a a r s 的第一步 反应不需要t r n a 。第_ 步：t r n a 的氨基醚化反应，氨基陵被转移到t r n a 款3 ，末端艨黄酸鳃核糖瓣羟麓上，产生氨墓酝，t r n a 蠲a m p 。a a r s 嚣 乞t r n a 氨基酰化的分步反应如下： a a r s + 氨撼酸+ 斛p a a r s 氨綦酸一a m p + 焦磷酸 a a r s 氨綦酸一a m p + t r n a - - - 氨鏊醮一t r n a + a m p + a a r s( 2 ) 亮氨酰t r n a 合成酶( l c u r s ，e c6 1 1 4 ) 属丁篇一类a a r s ，捌有特征忭 翘h i g h ，k m s k s 和r o s s m a n n 折叠净列f 2 。绝大部分弼l e u r s 都惩单疆舔， 抠是来源于超嚷热篷( a q u i f e x a e o l i c u s ) 鲍l e u r s 禽套c c 稠爆拿亚纂，定义为 生基盟蓥堕生堑热差生鱼照生堑鲎赞寇盟谴造圭 一 遣基 n b l e u r s ，两个亚基分别含有6 3 4 和2 8 9 个氨潺酸残撼，是目l j 唯已知的双 亚基l e u r s ( 国1 ) 【3 。7 】。超嚼热菌彳a e o l i c u s 是静及其吉老并且檄其耐热 豹缨菌，它戆全基| 盍| 缓在1 9 9 8 每被解崮【习，其中l e u r s 的双亚基结构簸是比 较4 i 同来源的l e u r s 的同源序列过与该超嗜热菌的全基出组同源序列知道的。 a 6 l e u r s 的特殊的四级结构使它成为一个重要而且有效地研究a a r s 进化的对 象。 8 0 。s 。s 。m 。a n n 8 d i t i 。n 。g r o 。s 。s m a d o m a1 dn “；i i i i i ；c 。d 。o ：。一：怒4 1f o 土d - n f on 盖m maino 擐a 1 “ 霹i 菇匿丁一翟鬟黧鍪l 瀚：二l一霪鬟熏鋈嚣靼霹嚣 ：= = 二l = = = ：二 z n ；lz j n 2 hiss 吨：鲤重篓錾 二强慧霍鍪黝二 羹囹 aquirexa e o l j c u z ”s u b u n i t 浚圈黧撼琴嚣：。：二一一j 二二： f i g u r e1 t h ed o m a i ns t r u c t u r eo f a q u i f e x a e o l i c u sl e u r sa n dt h e r m u s t h e r m o p h i l u sl e u r s 。 t h ei n d i c a t e ds e c o n d a r ys t r u c t u r ee l e m e n t sa r ef r o mt h ec r y s t a ls t r u c t u r e o f t h e r m u st h e r m o p h i l u sl e u r s 【8 】 本实验审曾经把分别含有邮l e u r s 的0 【和即f 琏序列的质料共i 刊转化进入 人肠朴菌t g i 细胞，表达纯化后获得邴l e u r s 。这种方法与n 本人的取、f f 璀 分翻表达1 9 】瑶体外重蚓褥到令戆的方法相吃，囱i 琵多优点。偿是 了j 然存在摹毽 豪达量z i 够赢的缺点，另外纯化步骤也比较多晦7 】。我们注意到娃- l e u r s 昀 罐因中含有大肠杆菌巾稀有的梢氨酸密码子a g a a g g ，这j 能是基砷：人肠 士国盟生瞳生堑垡芏鱼塑堕垒堑生盟窒堑监监盘 遗垦 杆菌中表达量不够高的原因。质粒p s b e t _ b 【1 0 拥有t 7r n a 聚合酶启动子，并 且有一个a r g u 基因，编码人肠杆菌t r n a a r g ( a g a a g g ) ，a r g u 基因的引入据 报道对于真核蛋白质在大肠杆菌中的表达有促进作用【1 1 - 1 4 。冈此，我们构建 了重组质粒，将编码0 l 和b 亚基的基因分别克隆进入p s b e t - b 和p e t - 1 5 b 载体， 并在c 【业基序列的5 端引入编码6 个组氨酸残基的d n a 序列，在大肠杆菌中高 表达了n 端带有组氨酸纯化标签的郇l e u r s ( h i s 6 邮l e u r s ) ，并用一步亲和 层析纯化了该酶。 2 材料和方法 2 1 试剂，菌株和质粒 除非另外指出，所有的化学试剂都购自美国s i g m a 公司( s i g m a a l d r i c h ) 。 激酶，连接酶和限制性内切酶购自h 本t a k a r a 公司。w h a t m a n3 舞滤纸购自德 国w h a t m a n 公司。质粒p b c p 3 7 8 - r s a 和p s m l l 0 4 1 r s b 由我们实验室以前构建 f f 6 l 。p s b e t - b 质粒山法幽g a n g l o f f 博士( i m b c ，c n r s ) 馈赠。，p e t - 1 5 b 质 粒购白德睦n o v a g e n 公司( b i o s c i c n c e s ) 。a a e o l i c u st r n a l “( g a g ) ( 1 2 0 0 p m o i o d ) 我们实验室按李勇的方法纯化 1 5 。用于带有h i s 标签蛋白质 亲和层析的n i - n t as u p e r f l o w 从德幽q i a g e n 公司购买。 2 2 质粒p s b e t h 6 一l r s a 和p e t - 1 5 b r s b 的构建 用限制性内切酶n d e l 和b a m h l 从质粒p b c p 3 7 8 - l r s a 上切下编码n 6 一l e u r s 主国登生瞳生堑些生鱼鱼壁垒塑主盟筮盟监迨童盘基 的n 亚基的序列，并插入质粒p s b e t - b 卜- 的相应位点，生成质粒p s b e t - l r s a ( 图 n 拈i i 珠l 恤l 弛h 面l b ha h a hh 赫 c a cc a t ( a c ( a tc 。 tg c cg c g ( ；c c ( aj g t g g t ag t gg t a g t ac g gc 6 ( c g g g t a t o l i 和n u c k o t h h # w i d t0 ：* i s i t e sa m i l l i i f l l i l l f i g u r e2 s c h e m a t i cc o n s t r u c t i o no fp s b e t h 6 - i r s aa n dp e t - 1 5 b - r s b 1 4 主旦登堂堕生些盟茔生塑照生盐鲎擞盎盟谴= 塑造圭 一遣照 2 ) 。然后将编码6 个组氨酸残基和3 个丙氨酸残基的寡核苷酸序列插入 d s b e t - i r s 口的m 订位点，生成质粒p s b e t h 6 + r s a ( 翻2 ) 。这两段寡核苷酸序 列是：o l i g o1 ，5 - t a t gc a tc a c c a tc a cc a t c a tg c c g c g g c cc a - 3 ( 编 码m e t ( h i s ) s ( 烈a ) 3 h i s ) 期互补序列o l i g o2 ，5 - t a t g g g cc g c g g ca t ga t g g t ga t gg t ga t gc a 3 ( n d e l 位点用下划线标山1 。 p s m l l 0 4 1 r s b 质粒上编码仔业基的序列被n c o i 和x h o l 切出，并连接到 d e t - 1 5 b 矮粒上鞠相应谴点，生成瘊翘p e t - 1 5 b 一r s b ( 图2 ) 。 2 3h i s 6 一d b l e u r s 基因的表达 质粒p s b e t h 6 。l r s a 和p e t - 1 5 b l r s b 被共转化进入大肠朴茼b l 2 1 一c o d o n p l u s ( d e 3 ) 藩株。撬取荦克隆过夜培养，西分之。转搂翻2 5 0m l 含有1 0 0b t g m l 氨苄青霉素期6 0p t g j m l 卡那霉素鲍l b 培养基，在3 0 0r p m ，3 7 。c 墙莽至对数 中期( o d 6 0 0 。= 0 6 ) ，加入i p t g 至终浓度为0 5m m ，继续培养4 小时。1 5 0 0g 离心2 0 分钟收集细菌，并用缓冲液a ( 1 0m m 咪吣，3 0 0m mn a c i ，5 0m m n a i l 2 p 0 4 ，1 0 潲，0 5m m 苯甲鏊磺酰氟( p m s f ) p h8 。o ) 冲洗两次。 2 4h i s 6 一a p l e u r s 的纯化 从2 5 0 m 1 培养基巾得到的1 克曲体悬浮于1 0 m l 缓冲液a 中，超声波破菌。 1 0 0 0 0g 离心3 0 分幸中，i ：清嚣于7 5 。c 加热3 0 分铮。1 5 0 0 0 0g 超速离心去除缁 愍磷片翻小塔成分之蜃，上溃，羊拜1 5 m l n i n t a s u p e 越o w 赍质攥动混合3 0 分钟， 1 5 士国型芏堕生堑垡生生塑照生堑生盟壹盟监迨圭盘星 然后装柱使介质自然沉降，用4 0m l 缓冲液a 洗柱，以去除非特异性结合于介 质上的杂质。用2 0 m l 缓冲液b ( 5 0 m m 咪唑，3 0 0 m m n a c l ，5 0 m m n a h 2 p 0 4 1 0 甘油，0 5m mp m s f ，p h8 o ) 洗脱目的蛋白质。含有h i s 6 a b l e u r s 的 成分收集在一起，对2 l 缓冲液c ( 5 m m 磷酸钾缓冲液，p h7 5 ) 透析之后， 用m i c r o s e p ( p a l l ，德国，3 0k d a 分了量截留) 超滤浓缩至6 0 0u l ，与等体 积甘油混合，保存于一2 0 。c 。h i s 6 - 0 【b l e u r s 的表达和纯化过程用s d s p a g e 检 测分析。蛋白质浓度用b r a d f o r d 方法测定【1 6 】。纯化的h i s 6 邮l e u r s 的浓度 也可通过以下公式计算：1 a 2 8 0 - - 1 6 8m g m lh i s 6 ，c c b l e u r s 1 7 。 2 5 酶活性和动力学常数的测定 h i s 6 邙一l e u r s 的氨基酰化活力和动力学常数的测定按照文献进行【1 8 】。2 0 l 反应体系巾含有1 0 0m mt r i s - h c l ，p h7 8 ，3 0m mk c i ，1 2m mm g c l 2 ，4m m a t e0 5m md t t ，5 ma a e o l i c u st r n a l “( g a g ) ，1 0 0 m “c 亮氨酸， o 1 m m lb s a ，2 n mh i s 6 - c l p l e u r s 。反应温度为6 5 。c ，二种底物亮氨酸，a t p 和a a e o l i c u s t r n a l 咖( g a g ) 的浓度在合适的范内变化。反应2 分钟后取1 5 l 滴在w h a t m a n3 撑滤纸上，放置5 秒钟后将纸片投入龠有5m m 亮氨酸的5 三氯乙酸( t c a ) 中，浸泡1 0 分钟，换2 次t c a ，再用9 5 乙醇浸泡两次 烘干纸片。用p p o p o p o p 闪烁液( 1 2 5gp p o ，0 7 5gp o p o p 溶解于2 5l 【_ _ 苯) 进行计数。1 个活力单位定义为在6 5 。c 的标准反应条件下，每分钟催化， 生1 纳摩尔产物所需的酶黾。比活力定义为1 毫克酶的活力单位数。 主圄盘生瞳生堑垡生鱼塑照生垫鲎盟寇盟监造圭壅垦 3 结果和讨论 3 1 得到重组质粒p s b e t h 6 一l r s a 和p e t - 1 5 b - r s b 质粒的构建过程如图2 所示。将编码0 【b l e u r s 的c 【亚皋的序列，用限制性 内切酶n d e l 和b a m h l 从质粒p b c p 3 7 8 - r s a 卜切下，并插入质粒p s b e t - b 上的 相应位点，生成质粒p s b e t - l r s a 。然后将编码6 个组氨酸残基和3 个丙氨酸残 基的寡核苷酸序列插入p s b e t - l r s a 的n d e l 位点，生成质粒p s b e t h 6 一r s a 。将 编码b 业基的序列从p s m l l 0 4 - l r s b 质粒 ：用n c o i 和x h o l 切出，并连接到 p e t - 1 5 b 质粒上的相应位点，生成质粒p e t - 1 5 b 1 r s b ( 图2 ) 。质粒序列经过d n a 测序确认。质粒p s b e t - b 带有a r g u 基幽，编码稀有的大肠杆菌t r n a a r g ( a g a a g g ) ，帮助h i s 6 一c c p l e u r s 在大肠杆菌中有效地翻译。另外，p s b e t - b 和p e t - 1 5 b 都带有很强的t 7r n a 聚合酶肩动子。而且为了避免h i s 6 标签对 目的蛋白质的性质可能产牛影响，一段编码a l a a l a a l a 柔性肽段的核苷酸序列 被插入h i s 6 标签和0 l p l e u r s 的序歹j j 2 _ 问。这样，在大肠杆菌中表达的c c p l e u r s 在n - 术端融合有m e t - ( h i s ) 6 一f a l a ) 3 一h i s 标签，可以很方便地用n i - n t a 亲和层 析纯化。 3 2h i s 6 - c 【b - l e u r s 的基因表达和蛋白质纯化 质粒p s b e t h 6 一l r s a 和p e t - 1 5 b - r s b 共转化进入人肠朴蔺b l 2 1 - c o d o n p l u s ( d e 3 ) 宿主细胞，n 一端带自h i s 6 标签的“亚摹的摹因被大量表达，大部分蛋白质 是可溶性的( 图3 ，第6 泳道) ，与以前的我们实验室报道的表达量相比柯显著 士国盘生堕生盐垡生生鱼丝垒盐生盟塞堑谴煎塞 遣垦 提高( 图3 ，第3 泳道) 。但是p 亚基的表达量仅稍有提高( 图3 ，第3 ，6 泳道) 。 粗抽液中的h i s 6 一邮- l e u r s 的氨綦酰化活力为1 7 5u m g ，以前的实验中只有4 6 u m g 【6 】。酶的表达量提高了3 倍。从2 5 0m l 培养基中得到1g 湿菌体。通过 一步n i n t as u p e r f l o w 亲和层析纯化，仅需两个小时，就可以得到具有9 0 纯度的7 m g 酶。纯化的a p - l e u r s 的产量是以前的5 6 倍【6 】。与之前的纯化力 法相比，用n i n t a 亲和纯化h i s 6 。【b l e u r s 的方法具有很多优点：只需一步 纯化，节约大量时间，而且刚收率高。纯化的流程在表1 中显示。 f i g u r e3 s d s - p a g ea n a l y s i so fe x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fh i s 6 - 任b - l e u r s t h es d s - p a g ew a sc a r r i e do u to n1o s e p a r a t i n g g e l a n ds t a i n e dw i t h c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u er 2 5 0 l a u e1 ：p r o t e i ns t a n d a r d sw i t hm o l e c u l a rw e i g h t so f9 7 4 ，6 6 2 ，4 3 0a n d3 1 0 k d a ，r e s p e c t i v e l y ；l a n e2 ，b l 2 1 一c o d o n p l u s ( d e 3 ) ； l a n e s3 - 5 ：w h o l c c e l le x t r a c t s o l u b l ea n dh e a t e df r a c t i o n sf r o mb l 2 1 c o d o n p l u s ( d e 3 ) c a r r y i n gp l a s m i d sp b c p 3 7 8 一r s a a n d p s m l l 0 4 - l r s b a f t e r i n d u c t i o n ， r e s p e c t i v e l y ； l a n e6 _ 8 ：w h o l e - c e l le x t r a c t ，s o l u b l ca n dh e a t e df r a c t i o n sf r o mb l 2 1 c o d o n p l u s ( d e 3 ) c a r r y i n gp l a s m i d sp s b e t h 6 一l r s a a n d p e t - 1 5 b 一r s b a f t e r i n d u c t i o n ， r e s p e c t i v e l y ； l a n e9 ：h i s 6 - c 【b - l e u r sp u r i f i e df r o mn i n t ac h r o m a t o g r a p h y t h el o a d i n g a m o u n t s w e r e2 0 b g i n l a n e2 ，3 ，4 ，6 ，a n d7 ，a n d7 5 p g i n l a n e5 ，8 ，a n d9 1 8 主国盘芏医生堑些生兰鱼丝生堑生盟盎堑谴煎圭 盔屋 旦坐! ：! 塑堑型! ! ! ! ! 旦坠娅：堡! 墨 p u r i f i c a t i o nc o n c e n t r a t i o nt o t a lp r o t e i n s p e c i f i ca c t i v i t y t o t a la c t i v i t y r e c o v e r y s t e p s( m g m 1 )( m 曲 ( u n i t s m g ) o( u n i t s ) o( ) 4t h e d e t a i l so fp u r i f i c a t i o na r ed e s c r i b e di nm a t e r i a l sa n dm e t h o d s 6a s s a y sw e r ec a r r i e do u ta t6 5 。cu n d e r d e s c r i b e dc o n