（应用化学专业论文）黑豆皮中花色苷的提取及纯化研究.pdf

摘要 论文题目：黑豆皮中花色苷的提取及纯化研究 学科专业：应用化学 研究生：王少波 指导教师：杜永峰副教授 摘要 签名： 签名： 黑大豆是传统的药食兼用的农产品资源，在全国大部分省、地区均有栽培。而黑豆皮 红色素是以黑豆皮为原料提制的天然色素，其主要成分是花色苷。近几年来，天然无害的 食用色素开发利用成了植物化学和食品科学研究中引人瞩目的课题。黑豆花色苷作为一类 重要的天然有机化合物，除了作为食用色素外，它还对人类的肿瘤、衰老、心血管病等疾 病的预防与治疗有重要的意义。黑豆皮原料易得、价格低廉，能够适应工业化生产的需要， 黑豆花色苷在食品、医药等领域具有很大的应用前景。本文以陕西产黑豆皮为材料，从节 约原材料、降低生产成本及提高产能等方面着手，研究黑豆皮红色素的提取纯化二【艺。主 要研究内容如下： 首先，比较了乙醇热回流提取和超声提取两种方法，通过单因素实验和正交实验，得 到提取黑豆皮花色苷的最佳提取工艺条件为：采用p h2 0 的5 0 乙醇为提取剂、料液比 为l ：5 0 、在5 0 。c 下提取1 2 0 m i n ，一次提取率达到8 6 7 。超声提取黑豆皮花色苷的最 佳工艺条件为：浸提液为p h2 0 的5 0 乙醇溶液，在5 0 。c 下超声提取1 5 m i n ，料液比为 l ：2 5 ( g m l ) 提取次数为一次，提取率可达9 5 2 。为了准确定量分析黑豆皮中花色苷， 论文研究了p h 示差法来测定黑豆皮中花色苷的总量，结果为：黑豆皮中花色苷的总量为 3 8 3 6 m g g 。 为了提高花色苷色素的纯度，论文研究了沉淀法和大孔吸附树脂法纯化花色苷的方 法。首先，依次用6 0 、7 0 、8 0 、9 5 乙醇沉淀除去色素中的多糖、蛋白质等杂质， 得到的色素的色价e m l 啪( 5 3 0 n m ) = 4 3 6 。然后，利用大孔吸附树脂进一步纯化花色苷。 对四种大孔吸附树脂的吸附、解吸性能进行了研究，结果表明：a b 8 大孔吸附树脂吸附 解吸花色苷色素效果最好。研究了p h 值、流速对a b 8 树脂吸附花色苷色素的影响，以 及洗脱剂、流速、p h 值对解吸效果的影响，结果表明：吸附时，p h 值为4 0 的色素溶 液作为上样溶液，上样流速为1 0 m l m i n ，在此条件下a b 8 大孔吸附树脂的动态吸附量 达到：1 0 0 4 6 m g g ( 树脂) ；解吸时，宜采用p h i 5 、9 0 的乙醇为洗脱剂，沈脱流速为 0 5 m l m i n ，此条件下动态沈脱率为9 1 6 。纯化后花色菅色素的色价e 吼l c n 。( 5 3 0 n m ) 提 蛆许 西安理工大学硕士学位论文 高到5 0 5 。经紫外可见光光普谱图和红外谱图证明色素中的主要组分为酰基化的花色苷。 关键词：黑豆皮花色苷，大孔吸附树脂法，提取，纯化 2 a b s t r a c t t i t l e ：s t u d yo ne x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o np r o c e s s0 f t h ea n t h o c y a n l n sf r o mb l a c kb e a np e a l m a j o r a p p l i e dc h e m i s t r y n a m e ：s h a o b ov ，a n g s u p e r v i s o r = a s s o c i a t ep r o f y o n g f e n gd u a b s t r a c t s i g n a t u r e ： s i g n a t u r e ： 一 t h eb l a c ks o y b e a nc o u l db eu s e da sf o o da n dm e d i c i n a lm a t e r i a l sa n da r ep l a n t e di nm o s t p r o v i n c e sa n da r e a so fc h i n a t h er e dp i g m e n tf r o mb l a c kb e a np e a li s an a t u r a lp i g m e n t i t s m a i ni n g r e d i e n ti sa n t h o c y a n i n s t h eh a r m l e s sn a t u r a le d i b l ep i g m e n tw a sc o n s p i c u o u st o p i ci n t h ep h y t o c h e m i s t r ya n dt h ef o o ds c i e n t i f i cr e s e a r c hi nr e c e n ty e a r s t h ea n t h o c y a n i n sf r o mt h e b l a c kb e a np e a la r ei m p o r t a n tn a t u r a lo r g a n i cc o m p o u n d ，b e s i d e st a k i n gt h ee d i b l ep i g m e n t ，i t a l s oh a st h ev i t a ls i g n i f i c a n c et ot r e a t m e n t sa n dt h ep r e v e n t i o nd i s e a s e ，s u c ha st u m o r , s e n i l e ， c a r d i o v a s c u l a ro fh u m a n i t y b l a c kb e a np e a la r es of a c i l ea n dc h e a pt h a tt h e yc a nm e e tt h e e x p e c t a t i o no fi n d u s t r y t h e r ea r eg r e a tp o t e n t i a la p p l i c a t i o n so fa n t h o c y a n i n si nf o o da n d m e d i c i n ef i e l d s i nt h i sp a p e r ，b l a c kb e a np e a lp r o d u c e di ns h a a n x iw a su s e da s t h e e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l ，t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fi c a r i i nh a db e e ns t u d i e d t h em a i n r e s e a r c hi sa sf o l l o w s f i r s t l y ，t h i sp a p e rc o m p a r e dt h et w oe x t r a c t i n gm e t h o d sw h i c hw e r ec i r c u m f l u e n c e e x t r a c t i o nb ye t h a n o la n du i t r a s o n i ce x t r a c t i o n t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n so b t a i n e d f r o mt h eo r t h o g o n a ld e s i g nw e r e ：t h ee x t r a c t a n tw a sc o n s i s t e do fp h 2 0 、5 0 e t h a n o l ，t h eb l a c k b e a np e a lw e r es o a k e di ne x t r a c t a n tf o r12 0m i n u t e sa t5 0 u n d e rt h ec o n d i t i o nt h er a t i oo fr a w m a t e r i a la n de x t r a c t a n tw a s1 ：5 0 ( g ：m l ) t h er a t eo fe x t r a c t i o nw a s8 6 7 t h er e s u l to f e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fe x t r a c t i n ga n t h o c y a n i n sp i g m e n tw i t h u l t r a s o n i cm e t h o dw e r e ：t h ee x t r a c t a n tw a sc o n s i s t e do fp h 2 0 ，5 0 e h t a n o l ，t h eb l a c ks o y b e a r l h u l lw e r es o a k e di ne x t r a c t a n tf o rl5m i na t5 0 u n d e ru l t r a s o n i cc o n d i t i o n t h er a t i oo fr a w m a t e r i a la n de x t r a c t a n tw a s1 ：2 5 t h er a t eo fe x t r a c t i o nw a s9 5 2 i no r d e rt od e t e r m i n a t et h e c o n t e n to f a n t h o c y a n i n si np i g m e n t ，t h ep hd i f f e r e n t i a lm e t h o dw a ss t u d i e d t h ea n t h o c y a n i n s c o n t e n to fb l a c kb e a np e a lw a s3 8 3 6 m g gc a l c u l a t e db yt h ep hd i f f e r e n t i a lm e t h o d 3 西安理工大学硕士学位论文 t w om e t h o d st o p u r i f ya n t h o c y a n i n sp i g m e n tw e r es t u d i e d f i r s tr e m o v et h e p o l y s a c c h a r i d e s ，p r o t e i n sa n do t h e ri m p u r i t i e sb y6 0 a n d7 0 ，8 0 ，9 5 e t h a n o ls o l u t i o ni n s e q u e n c e t h ec o l o u rc h a r a c t e r i s t i co fa n t h o c y a n i n sp i g m e n tp u r i f i e db yp r e c i p i t a t i o nm e t h o d w a s4 3 6 t h e nt h ea n t h o c y a n i n sp i g m e tw a sf u r t h e rp u r i f i e db ym a c r o p o r o u sr e s i n s t h r o u g h c o m p a r i s o n sa m o n gf o u rk i n d so fr e s i n s a d s o r p t i o n ，d e s o r p t i o np r o p e r t ya n da d s o r p t i o n d y n a m i c ，a b 一8r e s i nw a ss e l e c t e da st h ea d s o r b e n t e f f e c t so fp hv a l u e ，f l o wr a t eo na d s o r p t i o n a n de f f e c t so fe l u e n tf l o wr a t e ，p hv a l u eo nd e s o r p t i o nw e r ea l s o s t u d i e d t h er e s u l tw a sa s f o l l o w ：w h e nt h ep hv a l u ei ns o l u t i o no fp i g m e n tw a s4 0 ，t h ef l o wr a t ew a s1 0 m l m i n ，t h e a d s o r p t i o nc o n t e n tw a s10 0 4 6 m g g ( r e s i n ) ；w h i l e9 0 e t h a n o lw i t hp hi 5a se l u e n t ，f l o wr a t ea t o 5 m l m i n ，t h ed e s o r p t i o nr a t ew a s9 1 6 t h ec o l o rc h a r a c t e r i s t i c so fp u r i f i e da n t h o c y a n i n s p i g m e n tw a s5 0 5 k e y w o r d s ：b l a c ks o y b e a n a n t h o c y a n i n ； m a c r o r e t i c u l a rr e s i n ； e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n 4 独：刨一j 性，i 声- 明 幂承祖国优良道德传统和学校的严谨学风郑重申明i 一夸人绣呈零的学停论享是我雯 入在导师指导下进行的研究工作及取得的成果i + 尽我所知：除特另加以标注和致谢的地 方外，c 论文中不包含其他人的研究成果与我二同工作的同志对本文所论述的工作和成 果的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并已致谢。 本论文及其相关资料若有不实之处。一曲本人承担一切相关责任 论文作者签名f 。三立鳓届年，蚕月侈b 学位论文使用授权声明 本人= = 曼之搜在导师的指导下创作完成毕业论文。本人已通过论文的答辩，。并： 已经在西安理工大学申请博士硕士学位j 本人作为学位论文著作权拥有眷，同意授权4 西安理工大学拥有学位论文的部分使用权j 即。1 ) 已获学位的研究生按学校规定提交 印刷版和电子版学位论文，：学校可以采用影印、，缩印或其他复制手段保存研究生上交的 学位论文，| 可以将学位论文的全部或部分内容编人有关数据库进行检索；i 2 r 为教学和。 科研目的，：学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料在图书馆i ：资料室 等场所或在校园网上供校内师生阅读浏览o j 本人学位论文全部或部分内容的公带一 鼠李糖 半乳糖 木糖 阿拉伯糖。 从表1 1 可以看到，花色素结构中存在甲氧基化形式，甲氧基化的位置多位于c 3 和 c 5 【3 3 】。多羟基存在时的稳定性不如多甲氧基存在时高，花色苷稳定性随着糖配基羟基 化程度增加而下降，甲氧基化程度增加而上。 b 花色苷的酰基化 直至1 9 9 0 年，花色苷的稳定性仍被认为其分子中需要两个或更多的酸性基团对花色苷 结构的修饰。研究最多的是添加有机酸进行酰化掩盖c 2 位，通过掩盖c 2 位，保护活化中 心不受水分子的攻击，抑制水化反应，从而花色苷结构起到稳定作用【3 4 1 。酰基化的花色 苷对p h 变化、热处理、光照有较强稳定性。b o l i a ra 等1 4 l 】研究了在不同p h 、温度和光照 条件下紫甘薯和紫玉米花色苷提取物的稳定性。结果表明，紫甘薯中含有丰富的酰化花色 苷，其稳定性好于紫玉米中花色苷。tf o s s e n 等1 4 2 研究表明，酰化矮牵牛花色苷在中性和 碱性溶液中色泽比酸性溶液中深，说明某些酰化花色苷适宜于中性或偏碱性条件。添加某 些芳香酸或脂肪酸对现有的花青素结构进行改造，使花青素酰化，可提高其稳定性。 d o n a l e d k 掣4 3 j 在胡萝卜细胞培养液中添加苯乙烯酸和其它芳香酸后得到了1 4 种新型 单酰化花青素，其酰化部位通常发生在花色苷糖基c 6 位上，酰化花青素在p h 为2 和6 时具有 最大吸收峰。酰化花青素在接近中性条件下能较好地保持原有颜色泽。 c 多酚一花色苷复合 天然色素花色苷通常只有在强酸介质中才能保持稳定，但是花瓣细胞在正常情况下只 能显示弱酸性，如果只是花色苷，花瓣不可能形成稳定的颜色，实际上花色苷是与多酚共 存的。花色苷通过与多酚形成分子复合物，使花色苷稳定性提高，这种复合左右使花色苷 对光的吸收在可见光区鼹示了明显的红移，吸光系数也增大1 4 4 i 。 1 3 黑豆皮红色素中花色苷的概况 6 # 一章镕论 黑豆皮花色苷色素，足呻p 天然色素，该色素无毒，食用安个，往酸性条件f ，其对 光、热的稳定性好，不仪适合十许多食品以及肉类加 的着色，而且其木身也具仃多种生 理活性功能。找刚黑钍植物资源牛h 当丰富山1 ：近年来高含量的黑蕾红色素的周内外需求 培不断加人，其市场价格也坯年攀升。所以以黑豆应为原料丌发其新的提取_ 【= 艺，降低生 产成本，提高其台量，具有良好的社会效益与经济效益。 131 黑大豆简介 黑大豆是豆科植物的种子，又称乌豆、冬豆f 、黑豆，如图l 一2 所示，是黑色食品的 主要原料【4 ”。黑豆在全国部有栽培，尤以山西、河北、陕西栽培较多。黑豆适应性强， 耐旱、耐礴、酎虢碱。在有灾害的年代罩更显现黑豆的价值。黑豆的类型十分丰富，北方 有一年一熟辑种秋收的春性黑人豆，黄淮地区有麦收后播种的复播黑大豆，k 江以南有春 种、夏种和秋种的黑大豆。从现有的营养学研究来看，黑大豆营养丰富，古有蛋白质、脂 肪、碳水化台1 2 物、维生素a 、b i m bb mc 、e ，尼克酸、月q 碱、宵机酸、i 锕萝h 蠢、异黄酮、大豆皂苷、花色苷类色索锋，还含有多种矿物质。其中蛋门质禽量高达4 98 居豆类之首，其营养价值之高不占而喻。 幽i 一2 黑人丑形态及种千 f i g i - 2s h a p e & b l a c ks o y b e a na n d i t ss e e d s 1 32 黑豆花色苷的概况 黑豆皮( 也称黑豆衣或乌豆衣) ，迄今为止人们肘黑豆皮的化学成分的研究不多，黑豆 皮中含有丰富的维生素类成分如b 族维生素维牛索b i ，维生素b 2 、维牛素b 6 、维生 豢p 等，黑豆皮还岔有乙酰丙酸、果胶、多种糖类以及铁、硒、磷等各种微量元素，因此 在q j 国医学e 被称为功能性食物。黑豆红色素是以黑豆为原料提制的食用天然色素，其主 耍成分为花色苷，网此我们称它为墨豆花色苷。育研究表明i “i 黑豆花色苷的t 要成分为 飞燕早色索一3 葡萄糖苷和矢车菊一3 一葡萄糖苷，其化学结构裘w ；如罔i 一3 所示。 豢两帆繁 西安理工大学硕士学位论文 h h r l = o h ，r 2 = o h 飞燕草3 葡萄糖苷 r 1 = o h ，r 2 = h 欠车菊3 葡萄糖苷 图1 3 黑豆皮所含花色苷的化学结构 f i g 1 - 3c h e m i c a ls t r u c t u r e so fa n t h o c y a n i n si ns e e dc o a t so fb l a c ks o y b e a n 1 3 3 黑豆皮中花色苷的功效 1 1 抗氧化作用 自由基的连锁氧化反应，可导致生物细胞膜有害物质的形成和膜结构的变性，如酶、 d n a 等的改变，并引发各种疾病，如动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等，均可由自由基所 引发。近年来，学者对各种花色苷给予很大关注。美国时代周刊2 0 0 2 1 2 l 发表的以“作 用巨大的1 0 种食物 为题的文章中称，“兰莓可能比其他任何一种水果或蔬菜含有的抗氧 化物都要多，一其主要成分就是花色苷。黑豆皮中最主要的花色苷成分就是矢车菊3 葡 萄糖( c y a n i d i n g 3 g l u c o s i d e ) 简写为c 3 g ，研究发现c 3 g 在自由基发生剂( a m v n ) 存在 下，一方面可产生具有抑制氧化能力的代谢产物，同时可产生能捕捉自由基的原儿茶酸， 因而认为c 3 g 具有双重抗氧化作用，c 3 g 有明显预防活性氧( 过氧化自由基和羟自由基) 使超螺旋d n a 链断裂的能力以及抑制人低密度脂蛋白的氧化改造。此外，这种花色苷并 不介入细胞毒，在鼠巨噬细胞r a w 2 6 4 1 7 细胞中抑制可诱导的一氧化氮和成酶的表达而减 少一氧化氮形成【4 7 1 。 b 抗癌作用1 4 7 j ( 1 ) 花色苷将细胞从增殖状态恢复到分化状态，最近研究对矢车菊素3 葡萄糖苷给予特别 重视，不仅在于它分布广泛，而且它赋有花青素对人类健康功能的优势性状。s a r a f i n o 等 研究矢车菊素3 葡萄糖苷的对人黑色细胞瘤的增殖和分化的效果，可用的形态和功能两 方面的参数都被评估。以单一剂量的矢车菊素一3 葡萄糖苷处理，使瘤细胞增殖减少，但 不影响细胞生存能力和细胞坏死。s 相的有丝分裂指数和细胞百分比在矢车菊素3 筒萄糖 苷处理组比未经处理的明显较低。矢车菊素3 葡萄糖苷的处理以剂量和时问依赖的方式 诱发黑色素细胞瘤细胞分化。 ( 2 ) 花色苷诱导细胞凋亡： f i m o g n a r i 研究了矢车菊素3 葡萄糖苷对诱导t 2 类淋巴f 4 细 8 第一章绪论 胞的细胞凋亡的能力以及在h l 2 6 0 - 自；f 髓细胞性白细胞中诱导细胞凋亡和分化能力。在2 个 系统中的矢车菊素3 葡萄糖苷均诱导细胞凋亡，h l 2 6 0 细胞比t 2 类淋巴胚细胞较不敏感。 c 对心血管的作用 许多研究证明每天服用豆制品会降低心血管疾病的危险，这是由于黑豆对低密度脂蛋 白的氧化有抑制作用【4 羽。此外，黑豆皮中花色苷可以用作调节心血管紊乱疾病的药。蛋 白印迹分析和荧光酶活性测定表明花色苷能抑制血管细胞粘附分子1 诱导的肿瘤坏死因 子a 、细胞内私附分子1 和环氧化酶的浓度，而且花色苷能够预防老鼠缺血一再灌注造成 的心肌损伤1 3 8 l 。 d 改善视力 黑豆皮中花色苷具有明目软化血管稳定血压的功效。长时间大量摄取花色苷，可以有 效地预防和治疗假性近视、老年性花眼，长时间看书、驾车等引起的眼睛疲劳症等眼科疾 病。 e 保健美容减肥作用1 4 9 1 花色苷对高脂肪饮食有明显抑制体重增加和体内脂肪组织的积聚作用，但是对正常膳 食组无明显差异，2 0 0 2 年日本素材技能研究所申请了关于含有花色苷的黑豆皮提取物用于 减肥的健康食品及饮料的应用专利。此外有实验报道1 5 0 1 ，卵巢切除后的小鼠喂0 0 2 从黑 豆皮中提取的花色苷3 0 d ，其内脏脂肪的积累为6 4 ，而没有喂养花色苷的小鼠为8 9 。 同时花色苷能够抑制高脂肪、高蔗糖所诱发的高血糖症，并使高胰岛素血症完全恢复正常。 由于花色苷具有很强的抗氧化作用，因此具有延缓衰老的保健美容之功效。 f 其他作用 食用黑豆皮的提取物可以明显增强记忆力与学习能力，特别是长期记忆力。黑豆皮花 色苷还可以有效地预防和治疗胃炎、肠炎等消化系统疾病；并且具有护肝保肝作用，有效 地预防和治疗酒精肝、肝炎、胆腹水等疾病的作用【5 。 1 3 4 黑豆皮中花色苷的应用 a 黑豆皮中花色苷在食品添加剂中的应用 自从使用合成色素就其安全性被提出众多质疑以来，天然植物色素如花色苷色素引 起了食品加工业的极大关注。花色苷色素是非常有效的食品添加剂，不仅因为它的安全性， 还因为它比起人造色素更容易与食品结合，易上色。如今花色苷色素已被广泛应用于食品 添加剂中。 黑豆皮红色素是一种天然色素，该色素无毒，食用安全，在酸性条件下，其对光、 热的稳定性好，适合于糖果、糕点、果酒、饮料( 酸性) 以及肉类加工的着色，具有合适 的货架寿命。因此用黑豆皮作为原料，成本低廉，为挖掘、开发天然色素，为农副产品的 综合利用开辟一条新路，具有一定的社会效益与经济效益。 b 花色苷作为功能性食品的应用 随着学者对花色苷类色素成分研究的不断深入，其不仅可以为食品添加烈岍的色彩， 9 西安理工大学硕士学位论文 同时还具有抗氧化、抗癌、保护视力缓解眼部疲劳、延缓衰老、降压等功效。因此花色苷 已逐步向功能性健康食品方向发展。目前在同本、韩国就已有以花色苷为主要成分的产品 投放市场，用于缓解电脑诱发的眼疲劳等症状【5 2 1 。在美国，花色苷的建议摄入量为18 0 2 1 5 m g d ，用于抗氧化营养增补剂，产品有片剂，每片含花色苷5 0m g ，也有每片含花色 苷1 2m g 和b 胡萝b 素lm g ，与此同时，随着黑豆皮花色苷抗氧化、减肥等功效的确定， 其均可适用于开发成保健美容减肥的健康食品。 1 4 黑豆皮花色苷红色素提取、纯化研究进展 1 4 1 提取研究进展 传统的浸提方法有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取法、水蒸气蒸馏法等。我国古 代医籍中就有用水煎煮、酒浸渍提取药材的记载。上世纪5 0 年代，全国兴起的中药剂型改 革高潮中，基本上是使用煎煮法、浸渍法、回流法、渗漉法等浸提方法制备合剂或口服液。 近2 0 年来，科技人员对传统浸提方法工艺参数进行了较为系统的考查，建立了目前公认的 参数确定方法，即以指标成分的浸出率为指标，通过正交设计、均匀设计法等优选浸提工 艺条件，确定工艺参数。但常规的浸渍，渗漉，索氏热回流提取及动态提取等方法，使用 溶媒量大，操作时间长，能源消耗高，有效成分损失严重，为了获取更多的有效成分，通 过实验研究，科技工作者把现代的高新技术应用于中药提取的领域，如应用超声波垆引， 微波【5 4 1 ，超临界【5 5 】等提取方法。在此对黑豆皮红色素的提取研究进展作简单叙述。 a 热回流法 目前，在天然药物提取中，传统的热回流浸出工艺应用最为普遍，但具有沸点高，时 间长，有效成分损失大的缺点。 陆国权，吴小犁5 6 】对黑豆皮红色素提取的最佳工艺条件进行了研究，确定其最佳条 件为：0 8 盐酸酒精( v v ) 提取液，7 5 恒温，l ：2 5 物料比，l h 提取时间。在此条件 下，提取3 次，所得色素浸膏适于用作天然食用色素。 王海棠等【5 7 】分别考察了不同提取剂、不同浓度乙醇和室温浸泡、短时沸煮、恒温回 流等提取工艺方法及固液物料比、不同提取温度、不同浸提时间对提取效果的影响，试验 结果表明黑豆红色素的最佳提取条件为：5 0 乙醇水溶液为提取剂，固液物料比为l ：3 0 ， 提取温度为5 0 ，恒温搅拌，浸提时间为1 2 h 。该提取条件的优点在于：提取剂便宜易得， 无污染无毒害，且可杀死霉菌，提取液长期放置无霉变；浸提周期短，能耗少；对该温度 和提取剂色素溶解度大，杂质溶出少，每1 0 0g 黑豆可提得粉末状褐红色色素1 2 5g 。 崔蕊静，李凤英等【5 8 j 黑豆皮的提取工艺进行了研究。得到黑豆皮红色素最佳提取工 艺是：9 5 乙醇与0 i h c l 按l ：2 混合作提取剂，物料与提取剂比为l ：4 0 ( g ：m l ) ， 温度7 0 ，浸提时间1 0 0m i n 。本法采用乙醇h c l 混合液浸提，其得率高于单纯水或盐 酸提取，且颜色亮丽。 黄防等【5 9 1 以总抗氧化能j 为指标，采川响应分析法对黑大豆皮中抗氧化物质的提取 l o 第一章绪论 进行了优化，在豆皮粒度为6 0 目，料液比为l ：3 0 ，提取时间为2 小时的固定条件下， 得到的优化条件为：提取剂为p h1 o 的6 0 乙醇溶液，提取温度为8 0 。经过验证试 验，得知此条件下提取液的总抗氧化能力值为7 7 2 9u 儋豆皮。 梅建生等【6 0 】在确定了最佳溶剂( 乙醇水溶液) 及浓度( 5 0 ) 的情况下分别对温度； 料液比；浸提时间；p h 值进行四因素四水平正交试验，结果以提取温度7 0 ，料液比l ： 1 0 0 ，时间9 0m i n ，p h i 0 为最佳提取工艺。提取率可达9 8 左右。 马同锁，陈连文等【4 6 l 对黑豆红色素的提取进行了研究，得最佳提取条件为：提取剂： 稀酸；提取温度：6 0 左右；提取率为1 7 3 6 ( 按黑豆皮干重记) ，并对黑豆红色素的 稳定性进行了简单的研究。 徐金瑞等f 6 l 】以黑豆皮为材料，采用二次回归正交旋转组合设计对其花色苷的提取工 艺进行了优化研究。结果表明，最佳提取参数为温度6 0 、时间l h 、乙醇浓度6 0 、 料液比l ：4 0 。该法简单可行，提取率高，可为工业生产提供依据。 刘福第【6 2 】对黑豆色素提取的最佳工艺条件和稳定条件进行了研究。结果表明，黑豆 色素最佳提取条件为：9 盐酸为提取液，7 0 恒温，料液比1 ：3 0 ，提取时间3 h ，得率 可达1 6 2 。 b 微波提取技术 微波技术是在传统的有机溶媒萃取技术的基础上发展起来的以种新型萃取技术；将其 应用于中药有效成分的提取，可达到速度快，含量高的目的。溶媒可循环回收利用产降低 溶剂用量，从而减少排污量，改善环境，减少环境保护费用；具有快速，减员，节能，高 效，高纯度与高选择性以及工艺生产过程简单特点。， 高雪琴，王若兰等【6 3 j 以乙醇为溶剂提取黑豆红色素，对黑豆皮红色素的微波提取进 行了研究，采用正交试验法考察了提取溶剂，溶剂p h ，微波功率3 个因素，通过b ( 3 4 ) 正交试验法，确定最佳提取工艺为：乙醇浓度7 5 、功率为中高火、醇酸比1 ：3 。采用 微波辅助提取黑豆皮红色素，具有省时、省溶剂、操作简便等诸多优点，提取的黑豆皮红 色素颜色鲜艳，为农副产品的综合应用开辟了一条新路。 高雪琴等畔1 用微波法提取黑豆皮红色素，并与传统法进行了比较，通过单因素和正 交试验确定优化工艺条件。结果，采用微波提取功率为中火( 3 8 5 w ) 、体积比( 1 ：1 ) 的 7 5 乙醇和0 1m o l l 盐酸为提取剂、提取时间1 2 0s 、提取次数2 次，料液比l ：4 0 时， 色素提取率可达9 8 1 。采用微波提取法提取黑豆皮红色素与传统乙醇浸体法比较，具有 省时、省能量、操作简单、提取效率高等优点，为黑豆皮红色素的工业化提取找到了一种 高效途径。 c 超声法 超声波指频率 2 0 波段，利用其具有的机械、空化及热效应，通过增大介质分子的运 动速度以增大质的穿透力以提取中药的有效成分的方法。因不需氏时问加热，煎煮和回流， 可避免有效成分的分解；冈时m 短，无需蒸汽，冷却水，耗电少1 7 约能源：提r o j 有效成分 西安理工大学硕士学位论文 提取率，节约可观的原药材，有利于中药资源的充分利用；溶剂用量少，节约溶媒，利于 环保；过程不发生化学反应，不破坏药物的生理活性，有效成分含量高，有利于进一步精 制。目前，关于超声应用于黑豆皮红色素提取当中还未见报道，本文将对此法做简单介绍， 并将其引入到黑豆皮红色素提取实验当中做进一步的探讨和研究。 1 4 2 纯化工艺研究进展 目前，常用于花色苷类色素纯化的方法有纸层析法、薄层层析法、柱层析法、高效液 相色谱法等【6 5 1 。其中纸层析、薄层层析具有快速、分辨力好、设备简单等优点，而高效 液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、色谱柱可反复使用的优 点，但纸层析法、薄层层析法分离到的花色苷的量都很有限，而高效液相色谱法还具有价 格昂贵、操作复杂、对样品要求高等缺点，它们的使用都受到一定的限制，因此很难应用 到大规模的工业化当中去。 柱层析是日前普遍采用的纯化花色苷的方法，对于不挥发的花色苷的分离是理想的： 多以吸附树脂、凝胶为吸附剂。而大孔吸附树脂是6 0 年代以来发展起来的有机高聚物吸 附剂，具有较好的吸附性能。近年来，在中草药化学成分的分离、富集中的应用越来越受 到人们的重视，在黄酮类化合物的分离方面显示出独特的优势，具有吸附效果好、操作简 便、树脂再生容易、有机溶剂用量小、提取率高的特点。黑豆皮红色素纯化目前基本采用 树脂法进行。 腾学峰，徐雅琴两】选择了7 种大孔吸附树脂，分别测定了它们对黑豆皮色素的吸附 率和解吸率，筛选出较优的黑豆皮色素的吸附剂，并对其动态吸附性能进行了考察，结果表 明：a b 8 树脂对黑豆色素有较好的吸附和解吸效果，当浓度为0 0 7 4m g m l 时树脂的吸附 效果最好，当流出体积为5b v 时，开始泄露，树脂吸附已接近饱和，当吸附流速和洗 脱流速均为2m l m i n 时，效果最好。 徐金瑞等【6 7 】筛选出了合适的用于分离、纯化黑豆皮花色苷的大孔吸附树脂，对影响 树脂吸附纯化效果的重要因素进行了细致考察。从l o 种性能不同的树脂中，筛选出弱极 性大孔吸附树脂a b 8 为纯化用树脂。结果表明，花色苷溶液在a b 8 树脂上吸附属于多 分子层吸附模型。吸附平衡时间为1 4 0m i n ，吸附的最适质量浓度为8 0 0m g l ，经其纯化 后的花色苷含量和总抗氧化能力分别提高约2 倍和3 倍。 刘岱琳等【6 8 】研究了大孔树脂分离纯化黑豆红色素的工艺。考察了六种树脂对黑豆红 色素的吸附量，选出最优树脂y w d 0 1 ，考察温度、酸度对其吸附能力的影响以及不同纯 度对该树脂的吸附作用。结果：通过筛选y w d 0 1 对黑豆红色素的吸附能力最强，其在 p h 3 0 时吸附效果最好，不同的乙醇浓度对洗脱有很大影响，5 0 洗脱效果最好。结论： y w d 1 0 树脂适用于分离纯化黑豆红色素，有望得到含量更高的黑豆红色素。 1 5 研究目的及意义 食品色素是食品添加剂的重要组成舟：分，合成色素以其色彩鲜艳、稳定性女f 、易于管 1 2 第一章绪论 色等特点一度得到广泛的使用。但是，随着现代科学的发展，人们发现人工合成色素对人 体有不同程度的毒性甚至致癌性，各国对允许使用的人工合成色素的种类及用量的要求越 来越严格。天然色素安全无毒、营养附加值高的特点，正日益受到人们的青睐。从天然产 物中提取和分离各种可食用的天然色素替代人工合成色素已成为食品科学领域研究的热 点之一。 花色苷作为一种天然食用色素已经被使用多年，至今没有发现有副作用，而且具有很 多生理活性。花色苷色素具有明亮的颜色，易溶于水，这些性质都使得人们对它产生了越 来越浓厚的兴趣，逐渐成为人工色素的替代品。 黑豆皮花色苷红色素不仅是一种良好的天然色素，而且黑豆花色苷还具有抗氧化、抗 癌、降低心血管疾病、保健美容等生理功能。我国的黑豆种质资源丰富，全国各地都有栽 培，因此黑豆皮花色苷色素的原料易得、价格低廉且提取成本低，可以满足工业化提取色 素的要求。而且黑豆皮含有的花色苷具有酰基化基团，酰基化的花色苷色素在加工和储藏 过程中表现出更好的稳定性、耐热性和耐光性，可以广泛用作食品着色剂来源。 因此，研究黑豆皮中花色苷色素提取及纯化的新方法，提高花色苷色素的提取效率， 以及色素的品质，可以为花色苷色素生产提供一种新的资源。通过对提取和纯化方法的探 索，为从黑豆皮中提取花色苷的产业化奠定基础，对于食品、保健品的开发具有积极作用。 1 6 主要研究内容 ( 1 ) 黑豆皮中花色苷色素提取方法的研究分别采用单因素试验法、正交设计法的提取 工艺进行探讨，确定出最佳的提取工艺。并对黑豆皮花色苷进行定量分析。 ( 2 ) 黑豆皮中花色苷色素纯化研究。 ( 3 ) 花色苷色素在大孔树脂上吸附解吸性能的研究。 第二章黑豆皮花色苷的提取工艺研究 2 黑豆皮花色苷的提取工艺研究 2 1 引言 黑豆皮中花色苷色素的提取是纯化的基础，提取效果直接影响到花色苷色素的进一步 分离纯化。花色苷的提取方法国内j l - 许多学者都做了大量的研究 6 9 - 7 5 1 ，花色苷色素属于非 脂溶性色素，易溶解于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂，因此可以用醇类、水和有机酸等进 行提取。对于提取溶剂，甲醇是最佳选择，酸性溶剂在破坏植物细胞膜的同时溶解水溶性 色素。最常用的提取溶剂是酸性甲醇溶液，但是用于食品着色时，考虑到甲醇的毒性，可 以选择酸性乙醇溶液。 目前，除了常规的提取方法如：热提取法( 索氏法、煎煮法等) 和浸泡提取法( 渗漉 法、冷热浸泡法等) 还有许多新方法不断出现，大体有：超临界流体提取法、微波提取法、 超声提取法等，这些方法都受到了人们的关注。 超声波是指频率在声频以上，即超过人耳所能接受的频率2 0 k h z 的弹性波。超声波的 频率也有上限，一般认为是5 x 1 0 6 k h z 。超声波是一种在弹性介质中的纵波，可在固、液、 气中产生。超声波具有频率高、方向性好、穿透力强、能量集中等特性，已在机械制造、 化学、冶金、医疗卫生、轻工业、农业、动力工程等方面广泛应用。超声波应用于生物、 化学等技术是一个较新的研究领域。近年来超速声波在高分子化合物降解、有机合成、提 取分离等方面得到了广泛的研究和应用，如多糖的讲解及提取。目前超声波应用于从陆地 植物中提取有用有机成分进行了较多的研究，都取得了较满意的结果，回收率大大提高。 超声提取法就是利用超声波产生的强烈振动，很高的加速度、强烈的空化效应、搅拌等特 殊作用，可以破坏植物的细胞，使溶媒渗透到被提取物的细胞中，以便使被提取物的化学 成分溶于液体之中，再通过化学分离提纯以得到所需要的成分。超声提取的主要动力是声 空化。空化现象是指在超声波的作用下，在液体中形成空腔的现象。这些空腔随传播着的 声波的频率而伸张和压缩。声空化是液体中气泡在声场作用下所发生的一系列动力学过 程。当足够强度的超声波通过液体时，当声波负压半周期的声压值超过液体内部的静压强 时，存在液体中的微小气泡( 称作空腔或空化核) 就会迅速增大，而在相继而来的声波正压 相中，气泡会突然绝热压缩。当压缩时，气泡的尺寸会变小，同时它所产生的巨大压力可 能会使空腔完全消失，既可能是它们完全闭合。因为闭合之前的瞬间空腔及其周围微小的 空间内出现热点，形成高温高压区( 压力可达几千个大气压，温度超过5 0 0 0 0 ，并伴有强 大的冲击波和时速达4 0 0 k m 的射流。所以在空腔完全闭合的瞬间，由于出现这种极端的物 理环境，只是中草药化学成分的细胞在溶剂中瞬时产生的空化泡的崩溃而破裂，以便溶剂 渗透到细胞内部，而使细胞中的化学成分溶于溶剂之中。同时，超声波产生的振动作用加 强了细胞内物质的释放、扩散及溶解。而且，超声波破碎过程是一个物理过程，浸泡提取 过程中无化学反应，被浸泡的化学成分的结构和性质不会发生变化，因而超声波的振动作 用提高了细胞的破碎速度，缩短了破碎时问，促进了化学成分向溶剂中溶解。所以用超卢 西安理工大学硕士学位论丈 波提取化学成分可以大大的缩短提取时间，提高提取率，得到的化学成分的结构和性质也 不会改变【5 3 1 。 2 2 仪器与试剂 2 2 1 试验仪器 电子天平 ( 沈阳龙腾电子有限公司) d k 一8 8 i 型电子恒温水浴锅( 天津市泰斯特仪器有限公司) r e 5 2a a a 型旋转蒸发器 ( 上海嘉鹏科技有限公司) s h b b 9 5 型循环水式多用真空泵( 郑州长城工贸有限公司) d z 2 b c 型真空干燥箱( 天津市泰斯特仪器有限公司) p h s 3 c 精度p h 计 ( 上海精密科学仪器有限公司) u v - 2 1 0 2p c 型紫外可见分光光度计 ( 上海尤尼柯仪器有限公司) v i s 7 2 2 0 分光光度计( 北京瑞利仪器有限公司) k s 一1 2 0 0 超声波细胞粉碎机 ( 宁波科生仪器有限公司) 2 2 2 试验材料与试剂 黑豆皮( 购于西安药材市场) 无水乙醇( 西安化学试剂厂) 浓盐酸( 广东汕头西陇化工厂) 甲醇( 西安化学试剂厂) 氢氧化钠( 天津市北方天医化学试剂厂) 2 3 试验方法与步骤 2 3 1 试验方法 目前，在医药工业科研与生产中，优化工艺条件的实验设计法主要有以下三种：单因 素设计法、正交设计法和均匀设计法。三种方法各有优劣：单因素设计法简单、易行，但 不能综合反映各种因素、水平之间的交互作用，经其机械组合的优化结果可能是局部优化， 未必是最佳结果；正交设计具有均匀分散、整齐可比、计算简便的优点，但因其试验次数 是水平数平方的整数倍，故一般只用于水平数不超过5 的多因素试验；均匀设计非常适合 于多水平的试验，但试验数据处理必须借助特定软件在电脑上完成。但正交设计与均匀设 计都是对己有因素水平作出判断，使用时应作一定的预试验，从而确定所考察因素的最佳 水平在所选范围内，否则会出现因素选择不当、水平选择不妥、评分方法不对、适用对象 不符或目的不明确的情况【7 6 j 。 本实验中分别采用单因素设计、f 交设i , - i - x , j 黑豆皮花色苷的提取工艺进行研究，用正 交设计安排试验，筛选出在各冈索、水、严d 作用下的最佳提取工艺，并且将超声波技术 1 6 g _ - 章黑豆皮花色苷的提取工艺研究 应用于黑豆皮花色苷的提取当中，与传统法进行了比较，以确定黑豆皮红色素的最优提取 工艺条件。并将对花色苷色素的定量分析方法进行研究，确定黑豆皮中花色苷的总量，以 考察新工艺条件的提取效果。 2 3 2 分析方法 分光光度法：根据朗伯比尔定律，即彳= fb c ，其中，在定温度和介质条件下为 定值，b = lc m 。因此，在一定测