（生物学专业论文）生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氨酸的生产工艺研究.pdf

摘要 摘要 本报告第一部分主要研究了微生物谷氨酰胺转胺酶( m t g ) 在3 0 0 l 发酵罐上的 工艺条件，同时对m t g 分离的关键步骤进行了研究。主要研究结果如下： s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e 生产m t g 发酵过程中p h 控制策略为：通过在2 4 h 以后流加一定适合种类的有机酸来调控p h ，使该值控制在6 0 - - - 6 8 ；通过加入离子捕 捉剂，改变造成发酵p h 变化的一些关键盐离子浓度；建立发酵体系中m t g 酶的专 一性非抑制体系，阻断m t g 的自身产生的一些酶反应。、 发酵原材料的从工业化成本考虑以葡萄糖为主，适当补加甘油或淀粉水解物等是 比较理想的碳源组合。高压水解的豆饼粉为氮源比较理想，豆饼粉水解物的最适添加 浓度为2 5 e , l ，其与对照组比m t g 酶活高出2 6 2 ，其次鱼粉水解物也是比较适宜 m t g 合成的氮源。 在1 0 - 5 0 l 发酵罐实验结果的基础上，对3 0 0 l 发酵罐的一些关键参数通气量、 搅拌转速等进行了模拟放大，同时对机械搅拌器的类型进行了比较，以混合流体为主 的六箭叶圆盘涡轮式与六折叶圆盘涡轮式相比，对m t g 酶活的影响并不显著，但这 两种搅拌器好于以轴向流为主的锚式桨。 将s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e 发酵得到的t g a s e 酶液凝胶层析后进行 s d s p a g e 电泳，获得了酶的分子量在3 7 k d a 左右，为进一步的超滤分离参数选择 提供依据。将t g a s e 酶的活力损失和超滤膜通量综合考虑确定超滤温度选择在8 + 2 比较适宜，在确定超滤过程温度的基础上，考察了对膜通量有重要影响的因素，确 定料液的p h 在7 5 左右，操作压力在0 2 0 - - 9 2 5 m p a 之间。 本报告第二部分主要研究了酵母菌生物转化s 一腺苷甲硫氨酸的离子交换分离过 程。 筛选了一种对s a m 具有较强分离效果的大孔弱酸性阳离子交换树脂d k l1 0 。对 s a m 在d k l l 0 上的不同p h 情况下离子交换行为进行了研究，发现在p h 6 7 的范围 内吸附效果较为理想。在p h 小与1 5 则会对产物结构产生影响。研究了s a m 在d k l l 0 树脂上的动态吸附行为，确定并优化了工艺条件。将上柱液以2 0 m l m i n 的速度， p h 5 p 7 o ，用1 浓度的硫酸以1 5 2 0 m l m i n 的流速洗脱是适宜的条件，再经过层析 吸附等步骤后s a m 的产物纯度达到了9 6 0 o - - - 9 8 。 关键词：谷氨酰胺酶转移( t g a s e ) ，酶活，分离，超滤，s 一腺苷甲硫氨酸 摘要 a b s t r a c t t r a n s g l u t a m i n a s e ( t r a n s g l u t a m i n a s e ，r - g l u t a m i n y lp e p t i d e ：a m i n ey g l u t a m i n y l t r a n s f e r a s e ，e c 2 3 2 13 ) a r et h i o le n z y m e st h a ti m p r o v ep r o t e i nf u n c t i o n s ，r e f o r m s t r u c t u r e sa n di n c r e a s en u t r i t i o nv a l u et h r o u g hc a t a l y z i n g p r o t e i nr e t i c u l a t i o nb y i n t r o d u c i n gi s o p e p t i d eb o n d s ( 一( y g l u t a m i n y l ) l y s i n eb o n d s ) i nt h i sp a e ro fp a r to n et h ef e r m e n t a t i i o nt e c h n o l o g i e so ft r a n s g l u t a m i n a s e ( m t g ) w e r es t u d i e di n3 0 0 一l i t e rf e r m e n t e r , m o r e o v e rt h es e p a r a t i o np r o c e s so fm t gw e r ea l s o s t u d i e d n o wt h em a i nc o n c l u s i o n sa sf o l l o w ： t h ep hv a l u eo fm t gf e r m e n t a t i o nc u l t u r eb r o t ho fs t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e w a sc o n t r o l l e d ，t h ev a l u eo fp hw a si n j u s t e db ys o m eo r g a n i ca c i dw i t h i n6 o 击，8a f t e r f e r m e n tt i m eo f2 4h o u r s ，s o m es a l ti o n sc o u l dc h a n g e dt h ep hv a l u ea n dt h e yc o u l db e r e d u c e do rc o n t r o l l e db ys o m ea b s o r p t i o n s u b s t r a t e s p r e v e n t i n gm t ge n z y m a t i c a l r e a c t i o ni nb r o t hb ys o m ei n h i b i t o r sc o u l dp r o t e c tt h ea c t i v i t i e so ft r a n s g l u t a m i n a s eb y s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e f r o mt h ec o s t i n go fm t gp r o d u c t i o nt h ea p p r o p r i a t ef e r m e n t a t i o nc a r b o ns o u r c e s w e r es e l e c t e dt h e g l u c o s ew i t l l s t a r c hh y d r o l y s a t eo rg l y c e r 0 1 e f f e c t so fd i f f e r e n t h y d r o l y s a t eo fs o y b e a no nm t gp r o d u c t i o na n dm t g a c t i v i t yw e r es t u d i e d ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a t2 5 9 lo y b e a nh y d r o l y s a t eh a dt h eb e f i te f f e c to nm t gp r o d u c t i o na n d o b t a i n e dt h eh i g h e rm t ga c t i v i t y t h ef i s hp o w d e rh y d r o l y s a t ea sn i t r o g e ns o u r c eh a d b e e na l s os t u d i e di nt h i sp a p e r t h ep i l o t - s c a l ef e r m e n t a t i v ep r o d u c t i o n su s i n g3 0 0 lr e a c t o rw e r es t u d i e dw h i c h i n c l u d e dt h es c a l e u po ft h er e a c t o rs t i r r i n gr a t ea n dg a sr a t e ，c o m p a r i n gt h r e ek i n d so f a g i t a t o r st ot h ee f f e c to nt h ee n z y m ea c t i v i t y t h ec r u d et r a n s g l u t a m i n a s eb r o o t hf e r m e n t e db ys t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s ew a s s e p a r a t e da n dp u r i f i e db yg e lc h r o m a t o g r a p h y , t h e nt h es d s p a g e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e m o l e c u l a rw e i g h to ft r a n s g l u t a m i n a s ea n dt h ev a l u eo fp 1w e r e3 7 k d aa n d8 7 - 9 0 r e s p e c t i v e l y c o m b i n e da n da n a l y z e dt h ee f f e c to f t h eu l t r a f i l t r a t i o nt e m p e r a t u r e ，p hv a l u e a n dp r e s s u r eo nt h el o s so ft h et r a n s g l u t a m i n a s ea c t i v i t ya n dm e m b r a n ep e r m e a t i n gf l u x ， t h e s em a i n l yp a r a m e t e r sa b o v ew e r ec o n t r o l l e d8 2 ，7 5a n d0 2 0 - - 0 2 5 m p a r e s p e c t i v e l y t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fs - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ( s a m ) p r o d u e db yy e a s t i i 摘要 w e r es t u d i e di nt h i sp a p e ro fp a r tt w o ，m a i n l yi n c l u d i n gt h er e l e a s i n go fp r o d u c t i o n s a m ，s e p a r a t i o na n de x t r a c t i o n f i r t s l yc o l l e c t i n gt h ey e a s tf r o mb r o t ha n db r o k e nt h e e e u w a l lb y10 t r i c h l o r i d ea c e t i ca c i d ，t h e no b t a i n e dt h es u p e r s t r a t u ml i q u i dc o n t a i n i n g s a mb yc e n t r i f u g e ，m o r es e p a r a t i o np r o c e s sc o n c e r n i n gt h ep r o d u c t i o no fs a mt h r o u g h t h eu l t r af i l t r a t i o ni nw h i c ht h em e m b r a n eo f5 k d 5 0 k dm o l e c u l a rw e i g h tw e r es t u d i e d a n dt e s t e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts e l e c t i n gt h e10 k dm e m b r a n ew a st h eb e t t e rc h o i c ei n t h i sw a y i nt h ep r o c e s so fc a t i o ne x c h a n g i n gc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，t w ok i n d so fr e s i n s o fd k110a n dj k110w e r es t u d i e di nt h i sw a yt h a ti n c l u d i n gt h es t a t i ct e s t sa n dd y n a m i c e l u t i n gp r o c e d u r e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e t t e rt y p eo fc a t i o n e x c h a n g er e s i nw a s d k l 1 0 ，c o r r e s p o n d i n gt o t h ep r o c e s sp a r a m e t e r so fd k l1 0w e r e4 c - 1 5 c ，p h 5 0 - 7 0 a n ds a m p l i n gr a t e2 0 m l m i nr e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：t r a n s g l u t a m i n a s e ( m t g ) ，s e p a r a t i o n ，u t r a l f i l t r a t i o n ，e n z y m e a c t i v i t y , s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e i i i 华东师范大学博士后结题报告微生物转化符氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氮酸的生产丁艺研究 第一章绪论 关于谷氨酰胺转胺酶 1 1 谷氨酰胺转胺酶催化反应简述 微生物谷氨酰胺转胺酶( m i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s e ，简称m t g 或t g a s e ， e c 2 3 2 1 3 ) 是一种硫醇酶，能催化蛋白质之间或之内的酰基转移反应，该反应 能催化在蛋白质以及肽健中谷氨酰胺残基的y 羧酰胺基和伯胺之间的酰胺基的 转移反应，利用这个反应可以将赖氨酸引入蛋白质来改善蛋白质的营养特性。当 蛋白质中赖氨酸残基的y 氨基作为酰基的受体，蛋白质在分子内或分子间形成 ( y g l u t a m y l ) l y s 共价键，通过该反应，蛋白质发生交联，使得食品及其它制品 产生质构变化，从而赋予产品特有的质构特性和粘合性能。但不存在伯胺时，水 会成为酰基受体，谷氨酰胺残基脱去胺基，该反应可用于改变蛋白质的等电点及 溶解度。谷氨酰胺转胺酶的催化反应i l 2 t 3 j 见图1 1 。 中寻i 入氰篓盛 图1 1 ：谷氨酰胺转胺酶的催化反应方程示意图 f i g 1 - lc a t a l y s er e a c t i o no ft r a n s g l u t a m i n a s e 华东师范大学博士后结题报告微生物转化谷氮酰胺转胺酶和腺苷甲硫氮睃的生产工艺研究 1 2 谷氨酰胺转胺酶的主要理化性质 1 2 1m t g 的主要特性 采用微生物生产的m t g 多为种胞外酶，分子量约4 0 0 0 0 d a l t o n s ，活性中心 包括一个游离的c y s 残基，m t g 主要特点：( 1 ) 对c a 2 + 的非依赖性；( 2 ) 对热 和p h 的稳定性；( 3 ) 容易存放，发酵液经过离心和过滤后在2 0 c 下可以存放几 个月，而酶活性仅损失l o 。 m t g 对蛋白分子中有l y s 或l y s 二肽的底物表现出很强的催化能力。但是 当底物为c b z g i n - g l y o c t ，c b z g i n g i n g l y ，c b z g l y g i n g l y g l y 时，m t g 的 酶活就比动物提内的谷氨酰胺转胺酶( g u i n e a p i gt r a n s g l u t a m i n a s e ，简称g t g ) 低。 g t g 的分子量大约是m t g 的两倍，并且活性依赖于c a 2 + ，而m t g 则刚好相反， 据文献报道4 ，5 1 ，不需要c a 2 + 激活的g t g 氨基酸序列和需c a 2 + 激活的m t g 氨 基酸序列相比，虽然同源性程度很低，但是它们的活性中心均含有c y s 。活性中 心的氨基酸序列均为t y r - g l y g i n c y s t r p ，且维持活性中心的二级结构相同。 1 2 2m t g 的一级结构1 6 i 放线菌m t g 一级结构同源程度很高，s t r e p t o m y c e sl y d i c u s 和 s t r e p t o v e r t i c i c i l l i u m 的m t g 氨基酸序列有2 2 是不同的( 2 7 9 个氨基酸残基有 6 2 个不同) 。s t r e p t o m y c e sn a t e n s i sm t g 氨基酸序列和s t r e p t o v e r t i c i l l i u ms 8 11 2 m t g 的氨基酸序列有1 9 存在差异。 在已经研究的s t r e p t o v e r t i c i l l i u ms 8 11 2 中，m t g 的二级结构包括2 2 的q 螺旋结构和3 1 的1 3 折叠结构。该蛋白是一种球蛋白，有高度的亲水性，其活 性中心氨基酸胱氨酸位于1 3 折叠片内， s t r e p t o v e r t i c i l l i u ms 11 8 2 的m t g 一级 结构如图1 2 所示。 d s d d r v t p p a e p l d r m p d p y r p s y g r a e t v v n n y i r k w q q v y s h r d g r k q q m t e e q r e w l s y g c v g v t 1 7 n s g o y p n 、ri ，a f a s f d e d r f k n e l k n g r p r s g e t r a e f e g r v a k e s f d e e k g f q r a r e 、，a s v m n r a l e n a h d e s a y l d n l k k e l a n g n d a l r n e d a r s p f y s a l r n t p s f k e r n g g n h d p s r m k a v i y s k h f w s g q d r s s s a d k r k y g d p d a f r p l a p g t g l v d m s r d r n i p r s p l r s p g e g f q f d y g w f g a o n 狐d a d k t v w t h g n h y h a p n g s l g a m h v y e s k f r n w s e g y s d f d r g a y v i t f i p k s w n t a p d k v k q g 、冲 图l - 2s t r e p t o v e r t i c i l l i u ms - 118 2 的m t g 一级结构 f i g 1 - 2a m i n oa c i ds e q u e n c e so ft h eg e n ee n c o d i n gt h em t g f r o ms t r e p t o v e r t i c i l l i u ms 118 2 2 华东师范大学博士后结题报告微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氮酸的生产工艺研究 1 2 3m t g 的作用机理 谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，其作用特点如图2 所示： i ：r g l u c o - n h 2 + n h 2 一r l r g l u c o - n h r i + n h 3 i i ：r - g l u c o - n h 2 + n h 2 l y s r l r g l u c o - n h l y s r l + n h 3 i i hr g 1 u c 0 n h 2 + h o h - - - k r g l u c o o h + n h 3 图l - 3 谷氨酰胺转胺酶的作用特点 f i g 1 - 3a c t i o nc h a r a c t e r i s t i co ft r a n s g l u t a m i n a s e t g 以肽链中谷氨酰胺残基的丫羧酰胺基作为酰基供体，而酰基受体可以是 以下几种： ( 1 ) 伯胺基。形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接( 图1 3i ) 。利用该反 应可以将一些限制性氨基酸引入蛋白质分子以提高其营养价值。 ( 2 ) 多肽链中赖氨酸残基的氨基。形成蛋白质分子内和分子间的8 ( r 谷氨 酰) 赖氨酸异肽键( 图1 3i i ) ，使蛋白质分子发生交联，从而改变食物的质地和 结构，改善蛋白质的溶解性、起泡性、乳化性等许多物理性质。 ( 3 ) 水。当不存在伯氨时，水会成为酰基受体，其结果是谷氨酰胺残基脱去氨 基生成谷氨酸残基( 图1 - 3 i i i ) ，该反应可以用于改变蛋白质等电点及溶解度。 1 3 谷氨酰胺转胺酶的生产 1 3 1m t g 的微生物发酵 除了通过菌种遗传特性的改良外，酶的产量还依赖微生物生长的环境条件， 如碳氮源、诱导物、阻遏因子、温度、p h 值和溶解氧等。在一定程度上，通过 环境因子的调节，可达到快速提高菌株产量的目的【7 】。1 9 8 9 年日本味之素公司和 天野制药公司从多株放线菌中筛选到数株m t g 产生菌，其中s t r e p t o v e r t i c i l l i u m s 1 1 8 2 所产m t g 酶活最高，为2 5u m l 引。 吴介文等【9 l 报道s t r e p t o v e r t i c i l l i u ml a d a k a n u m 能产m t g ，m t g 的产生和菌 体生长平行。2 8 培养4d ，其酶活为1 8u m l 。若加入2 2 p p me o l i s t i n ，则产 率可以提高3 0 ，酶活达到2 1 u m l 。z h u t l 0 】等优化s t r e p t o v e r t i c i l l i u m 的产酶培 养基，使酶活提高了四倍，为0 9u m l 。1 9 9 7 年j u n q u a 1 1 】等运用实验设计方法优 化培养基，用s t r e p t o v e r t i c i l l i u mc i n n a m o n e u m 生产m t g ，使酶活增长了3 倍， 最高酶活达0 3 3u m l 。1 9 9 8 年z h u 1 2 1 3 】等运用质量平衡理论，分析了发酵产酶 过程中氨基酸的代谢情况。发现s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e 在发酵后期，由于 3 华东师范人学博士后结题报告 微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氨酸的生产工艺研究 发酵液中的自由氨基酸与蛋白质被m t g 交联，影响了菌体的生长和产酶，因此 采用流加硫酸铵的方法使酶活提高了8 0 。郑美英【1 4 】等运用质量平衡理论，用 s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e 生产m t g , 采用流加硫酸铵的方法使酶活达3 9 7 u m l 。 1 3 2m t g 的分离纯化 m t g 是一种分泌在发酵液中的胞外酶。发酵结束后，先对发酵液进行离心 分离，除去菌体，然后对上清液进行处理，即可得到酶制剂产品。离子交换、色 谱、纸层析、超滤等常规生物工程单元操作也常用于m t g 的纯化。将这些方法 高效组合使用，可提高m t g 酶的提取纯度和提取收率。一些研究表明在提取过 程中还需要向粗酶液加入盐、蛋白质、类脂及表面活性剂等稳定剂【1 5 】。 a n d o 2 j 报道了s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e 产生的m t g ，经超滤、 a m b e r l i t e c g 5 0 离子交换、b l u es e p h a r o s e 柱分离等步骤，酶被纯化了1 7 4 倍， 总回收率为4 2 。g e r b e r 1 6 j 等报道利用s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e 生产的 m t g ，经过离心、过滤菌体后，将滤液用f r a c t o g e le m d s 0 3 强酸性阳离子交换 树脂分离，可得到纯化了1 2 8 倍的m t g ，回收率达6 0 。该法选择性强。该酶 在2 0 可保存数月，酶活力仅损失1 0 。 n o v o 公司报道利用s t r e p t o m y c e sl y d i c u s 生产m t g ，其发酵液经过压滤除 去菌体后，滤液用3 0 0 0 d a 超滤膜浓缩6 倍，然后加入硫酸铵使其饱和度为6 5 沉淀m t g ，将沉淀的m t g 溶解、透析、上s p s e p h a r o s e 柱分离，收集比酶活 高的组分，用1 0 k d a 超滤膜浓缩，再用b l u e s e p h a r o s e 除去杂蛋白，即可得到 s d s p a g e 电泳纯的m t g ，纯化倍数达9 0 倍【l7 1 。 d u r a n i1 8 】等人从c b s6 8 3 6 8 ( s t r e p t o v e r t i c i l l i u mc i n n a m o n e u m ) 中分离提取 m t g ，使用离子交换层析和亲合层析的方法，为了消除从p h e n y ls e p h a r o s e c l 4 b 中提取的酶液不纯的干扰，将g e l a t i ns e p h a r o s e4 b 亲合层析放在纯化最后一步。 鲁时瑛1 1 9 等人用c m 离子交换柱和s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤纯化 s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e 发酵产生的m t g 。周楠迪【2 0 l 等人用s u p e r d e x7 5 凝 胶过滤和s o u r c e3 0s 离子交换纯化同样条件下的发酵产酶。唐名山等人1 2 l j 研究 了基因工程产m t g 的分离纯化，使用n i n t a 亲和柱分离和稀释法复性。 1 3 3m t g 生产过程 生产m t g 的方法主要是从微生物发酵生产。具体的谷氨酰胺转胺酶生产过 程见图l 。4 4 华东师范人学博士后结题报告 微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氨酸的生产t 艺研究 回圈 上上 区圃囤 上 湘氯1 9 9 4 销圈 上 ( a n d o 等，1 9 8 9 年) f i g 1 - 4 p r o c e s so f t r a n s g l u t a m i n a s ep r o d u c t i o nb ym i c r o o r g n i s i u m 图l - 4 微生物谷氨酰胺转胺酶的生产流程 1 4m t g 酶的稳定性综述 酶的稳定是导致失活和稳定作用力的一个平衡结果。在分离纯化过程中，搅 拌、升温、p h 、盐浓度等条件变化都可能造成酶的失活，添加表面活性剂或有 机溶剂等都是一些必需的操作和难以避免的结果，也会造成蛋白质三维结构变化 1 2 2 】 0 1 4 1 提取分离过程酶的失活 提取分离过程造成酶失活的主要因素和过程：a 温度因素：影响酶稳定性 的最重要因素就是温度。通常来说，温度越高，酶活稳定性越低。酶在一定的温 度范围内通常是稳定的，但超过最高温度或者低于最低温度，都可能失活。b p h 5 圈上曰上回 华东师范大学博 后结题报告微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氨酸的生产工艺研究 值：当p h 值远离蛋白质等电点时，同种电荷之间的静电排斥作用增加导致蛋白 质的解链【2 3 , 2 4 , 2 5 1 。导致解链趋势的一个较弱的因素是在极端p h 下盐桥的形成减 少。c 减切和振动：蛋白质在振动和减切过程中容易失活。d 吸附因素：蛋白 质很容易被许多界面吸附，蛋白质在空气水表面的吸附，首先是蛋白质分子的 锚定，然后吸附分子发生重新定位和重排1 2 6 】。这种吸附性质是与蛋白种类有关 的，而与蛋白质的大小和等电点无关【27 1 。蛋白质的表面吸附通常也和浓度有关， 在一定浓度下可以达到最大值。e 盐类：盐对蛋白质稳定性的作用十分复杂， 是完全暴露在表面和完全部分埋藏在蛋白质分子内部的离子相互作用。盐对蛋 白质稳定的作用与盐的类型、浓度和离子相互作用相关【2 引。金属离子对蛋白质稳 定性作用也与离子类型和浓度相关。金属离子在不影响蛋白质二级结构的前提下 对蛋白质稳定性产生显著作用【2 引。与金属离子相关的螯合剂( e d t a ，柠檬酸) 对蛋白质的稳定作用，是通过结合蛋白质和或蛋白质的关键性金属离子使蛋白 质失活，或者通过结合有害金属离子提高蛋白质活性。 1 4 2 冷冻干燥过程酶的失活| 3 0 ，3 1 i m t g 酶工业生产过程中，常用冷冻干燥的方法将酶液处理。在冻干过程中 为了减少酶失活，常添加一些化学物质形成一种保护体系。冷冻干燥是一个非常 复杂的过程，在预冷第一、第二干燥阶段和储存过程中，蛋白质的结构可能受其 中的物理化学变化影响而发生变化。特别是蛋白质多肽类药物的二、三级结构易 受破坏，失去活性而影响药效。 1 4 3 提高酶稳定性的方法 提高酶的稳定性，主要从稳定酶分子结构及改变酶分子周围的环境方面着 手。有人研究认为酶稳定性提高是由于在超分子结构中有其他细胞组分，如类脂、 糖类、蛋白质等的参与，这些物质作用的结果，使酶活性中心天然的、具催化活 力的构造变得不容易被破坏p 引。 1 4 4 影响m t g 稳定性的因素 加入谷氨酰胺转胺酶可以增加被添加物的弹性和硬度，同时降低由于粗材料 质量不均一造成的浪费【3 3 1 。随着谷氨酰胺转胺酶越来越广泛的应用，对其稳定性 的研究成为人们关注的问题。在谷氨酰胺转胺酶的分离提取、冻干保存和使用中 都存在引起m t g 失活的因素。 m t g 的分离提取过程主要包括： 6 华东师范大学博士后结题报告 微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氨酸的生产j 艺研究 过滤 l 超滤 if 微滤 l 乙醇沉淀 i 离心 l 凝胶色谱等 l 冻干 超滤过程中，酶液在罐体循环时受到罐体内压力和不断升高的温度影响，浓 缩酶液的总酶活损失较大。乙醇沉淀时，乙醇加入量和搅拌速度对酶活都有影响。 有机溶剂对蛋白质有沉淀作用，振动作用在溶液表面形成疏水的空气水界面， 界面上蛋白质分子上的疏水残基暴露，开始聚集团j 。冻干过程中由于温度突然升 高或降低，水分的凝结形成空隙等物理因素的影响，都会导致酶活损失。凝胶过 滤中的损失更加明显。酶分子在通过分子筛时，由于流动相作用和温度的影响导 致酶失活l 例。 酶的保存和使用过程中，温度、氧化、使用条件和微生物污染等是影响m t g 容易失活的主要因素。例如，在长期存储过程中，由于氧化作用，谷氨酰胺转胺 酶活性损失很多。在食品加工过程中，加入产品中的谷氨酰胺转胺酶参与高温蒸 煮、斩拌、减切等过程，很容易失活1 3 4 , 3 5 j 。 1 4 5m t g 稳定性的一些研究 h i s 觚o r in 等1 3 6 】石开究了离子强度对m t g 酶活的影响，加入不同浓度n a c l 实验 结果表明，随着离子强度增加酶活稳定性降低，但这种作用不明显，实验证明不 加n a c l 和加入0 6m 的n a c i ，米氏常数分别为1 4 4m g m l 和1 2 7m g m l 。在阴 离子的离子强度对酶活影响作用中，c l 。和b r 对酶活的调节作用要比i 。和n 0 3 作 用明显。 k u t e m e y e r 等人【3 7 】研究几种盐在不同浓度下对m t g 热稳定性的影响，单价 盐n a c i 和k c i 对高温下处理的m t g 酶活稳定性有促进作用，由于单价盐的加 入增加了酶在水中的溶解率。二价盐m g c l 2 和c a c l 2 的加入对酶活热稳定性没有 明显促进作用。 7 华东师范丈学博士后结题报告 微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺管甲硫氦酸的生产工艺研究 表1 1 有关m t g 的一些主要特性 t a b 1 - 1s o m ec h a r a c t e r so fm t g p u r i f i e df r o ms t r e p t o v e r t i c i l l i u m 在m t g 较长期保存上，日本a j i n o m o t o 公司研究了蛋白部分水解物对谷氨 酰胺转胺酶的稳定性作用【3 引。同时比较了大豆蛋白、乳清蛋白、酪氨酸钠和小麦 蛋白及部分水解产物对酶稳定性作用关系。 1 5m t g 的应用0 3 蛐5 i 1 5 1 m t g 在食品工业中的应用 m t g 主要在肉制品中的加工、水产品加工、豆腐加工、蔬菜水果加工、乳 品的加工等食品加工方面得到了广泛应用 表1 2 m t g 的主要应用 t a b 1 2t h em a j o ra p p l i c a t i o nw i t hm t g 来源产品作用 肉肉包提高弹性、质地、口味及风味 罐装肉良好的质地和外观 冻肉改善质地，降低成本 模型肉对肉进行改型再塑造 浸渍肉 改善肉的风味以及延长包藏期 鱼鱼肉泥提高质地和外观 碎鱼产品增加凝胶强度 l “l ll “l l 肉泥 改善质地 骨胶原鱼翅模拟美昧食品模拟 小麦烘烤食品改善质地，增人体积 大豆麻婆豆腐延长包藏期 煎豆腐改善质地，包藏期延长 蔬菜，水果矿物质吸收促进剂改善肠道中矿物质吸收 胶交联蛋白质降低过敏性 甜食 良好的质地、弹性和低热量 8 华东师范大学博士后结题报告微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氨酸的生产工艺研究 化妆品、药物良好的凝胶性及黏性 脂肪、油、蛋白质固体脂肪良好的质地、风味、口味的猪肉替代品 形成具有良好质地及口味的冻胶 植物蛋白蛋白粉改善风味和口味 调味品调味品增加黏度并在贮藏中保持原有口味及 米 黏米饭质地 黏性增加 牛奶蛋白牛奶防止软化 脆性甜食脆性甜食 1 5 2 m t g 在其他工业中的应用 主要是在纺织品当中和固定化技术当中的应用，m t g 通过交联反应能改变 蛋白质的空间结构，使蛋白质间或蛋白质内部发生共价交联，从而使其空间结 构的机械强度增加从而在洗的过程中不易错位。 2 本课题研究的主要目的、内容和意义 在发酵摇瓶和1 0 l 发酵反应器的基础上，对m t g 的中试生产过程进行研究， 主要包括，工业发酵碳源、氮源的种类和使用量，引起发酵过程p h 值产生改变 的原因和控制，对中试发酵设备的参数放大，包括通气量、搅拌转速、搅拌功率 和机械要求，并对产生不同流型的机械搅拌器对产物的影响进行研究。上述中试 结果将为1 0 - - 2 0 m 3 的m t g 发酵生产奠定重要的基础。 过在完成发酵中试研究的基础上，对m t g 的关键提取步骤进行实验研究， 确定超滤过程的压力、温度、p h 、料液浓度等因素对膜通量的影响。 参考文献 【l 】m o t o k im ，a d a c h im ，u m e d ak ，e ta 1 ，p u r i f i c a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o no fan o v e l t r a n s g l u t a m i n a s ed e r i v e df r o mm i c r o o r g a n i s m s ，a g r i c b i 0 1 c h e m 19 8 9 ，5 3 ：2 613 - 2 617 【2 】a n d o ，h ；a d a c h i ，m ；u m e d a , k ；m a t s u u r a , a ；n o n a k a , m ；u c h i o ，r ；t a n a k a , h ；o t o k i ，m p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fan o v e lt r a n s g l u t a m i n a s ed e r i v e df r o mm i c r o o r g a n i s m s a g r i c b i 0 1 c h e m 1 9 8 9 ，5 3 ，2 613 2 617 【3 】赵晶，张睿，微生物谷氨酰胺转胺酶对乳清蛋白的改性，尹厚旯房弛2 0 0 4 ，3 2 ( 2 ) ： 3 6 - 4 0 【4 】k i n y 如w ；k e i i c h i ，a ；s a t o s h i ，k ；s u s u m u ，h ；a k i r a , m ；h m s h i ，t ；k a z u y u k i ，t 9 华东师范火学博士后结题报告微生物转化谷氨酰胺转胺酶和腺苷甲硫氨酸的生产工艺研究 m o l e c u l a rc l o n i n go ft h eg e n ef o rm i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s ef r o ms t r e p t o v e r t i c i l l i u ma n di t s e x p r e s s i o ni ns t r e p t o m y c e sl i v i d a n s b i o s c ib i o t e c hb i c h e m 19 9 4 ，5 8 ，8 2 8 7 【5 】s h i n o ，t ；k i n y 玛w ：；k e i i c h i ，a ；s a t o s h i ，k ；k a z u y u k i ，t ；h i r o s h i ；h i t o s h i ，t c h e m i c a l s y n t h e s i so ft h eg e n ef o rm i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s ef r o ms t r e p t o v e r t i c i l l i u ma n di t se x p r e s s i o n i ne s c h e r i c h i ac o l i b i o s c ib i o t e c hb i c h e m 19 9 4 ，5 8 ( 1 ) ，8 8 9 2 【6 】t o s h i y ak a n a j i ，e ta 1 p r i m a r ys t r u c t u r eo fm i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s ef r o ms t r e p t o v e r t i c i l l i u m s p s t r a i ns 一8 1 1 2 j o u r n a lo f b i o l o g i c a lc h e m i s t r y 19 9 3 ，2 6 8 ( 16 ) ：115 6 5 115 7 2 【7 】郭勇主编，摩乙超中国轻工业出版社，北京1 9 9 7 【8 】a n d o ，h ；a d a c h i ，m ；u m e d a , k ；m a t s u u r a , a ；n o n a k a , m ；u c h i o ，r ；t a n a k a , h ；o t o k i ，m p