（生物物理学专业论文）软件动物血蓝蛋白结构的低温电镜研究.pdf

软体动物血蓝蛋白结构的低温电镜研究 硕士生：戴兴红 导师：张勤奋副教授 专业：生物物理学 摘要 血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜输氧蛋白。软体动物血蓝蛋 白与节肢动物血蓝蛋白在基因结构、亚基结构、形态特征以及协同输氧的机制等 多方面都不一样。软体动物血蓝蛋白是十聚体或二十聚体的中空柱状结构，每条 亚基又由7 或8 个结合氧的功能单位( f u n c t i o nu n i t , f u ) 依序连接而成。虽然已 有软体动物血蓝蛋白单个f u 的晶体结构，但至今仍无一高分辨的整体结构足以 阐明各个f u 、亚基的排布，以及f u 间相互作用的方式、传递构象变化进行协 同输氧的机制等。 本研究借助低温电镜三维重构( c r y o e l e c t r o nm i c r o s c o p y3 dr e c o n s t r u c t i o n ) 技术解析了软体动物腹足纲杂色鲍血蓝蛋白i s o f o r ml ( h a l i o t i sd i v e r s i c o l o r h e m o c y a n i nl ，h d h l ) 的整体结构，尝试对上述问题进行探讨，并得到如下结 果： 1 获得了分辨率约7 8 a 的h d h l 三维结构； 2 测定了h d h l 基因的大部分序列，并用同源建模方法构建了h d h l8 个 f u 的结构模型；结合低温电镜重构的电子密度图，构建了整体h d h l 的 p s e u d o a t o m i cm o d e l ： 3 通过电子密度图，首次在血蓝蛋白中，发现了h d h l 亚基二聚体中具有 稳定结构功能的f u “互锁( i n t e r l o c k ) 结构，并确认了各f u 的依序排布方式； 4 发现了h d h i 中两个十聚体结合形成二十聚体的位点，结合m o d e l 分析， 确认了由m a 的h i s 2 7 1 、g i n 2 7 2 ，以及另一个十聚体中f u b 的h i s 3 0 4 组成 了h d h l 形成二十聚体的结构基础； 5 发现了h d h l 中f u 相互作用的几个位点，揭示了h d h l 相邻二聚体以及 上下十聚体中，存在由其中的四个f u 集合而成的一个产生变构和协同效应的基 本单位；这些变构基本单位分别可通过两种作用方式依次传递信息，产生变构协 同效应，f 霹步进行氧的结合和释放。 软体动物血蓝蛋白具有输氧和免疫的功能，本论文利用低温电镜三维重构技 术获得的这些结果，为研究血蓝蛋白的这些功能提供了重要的结构信息。 关键诃：软体动物、血蓝蛋白、低温电镜三维重构、变构效应、协同效应。 c r y o - e l e c t r o nm i c r o s c o p yr e s e a r c ho f m o l l u s c ah e m o c y a n i ns t r u c t u r e m s c a n d i d a t e ：d a ix i n g h o n g s u p e r v i s o r ：z h a n gq i n f e n ，a s s o c i a t ep r o f e s s o r s p e c i a l i t y ：b i o p h y s i c s a b s t r a c t h e m o c y a n i n s ( h e ) a 聆g i a n tc o p p e r - c o n t a i n i n gr e s p i r a t o r yp r o t e i n s i nt h e h e m o l y m p ho fm o l l u s e aa n da r t h r o p o d aa n i m a l s m o l l u s c ah e sa r eq u i t ed i f f e r e n t f r o ma r t h r o p o d ah c si na s p e c t so fg e n e s t r u c t u r e ，s u b u n i ts t r u c t u r e ，m o r p h o l o g y , m e c h a n i s mo fa l l o s t e r i co x y g e n - t r a n s p o r t a t i o n , a n ds oo n m o l l u s c ah c sa r eh o l l o w c o l u m n l i k ed e c a r n e r so rd i d e c a m e r s ，w i t h7o r8o x y g e n b i n d i n gf u n c t i o nu n i t s ( f t o l i n e a r l yl i n k e di ne a c hs u b u n i t a l t h o u g ht h e r ea r et w oc r y s t a ls t r u c t u r e so fm o l l u s c a h cs i n g l ef ur e s o l v e d ，n oh i g h - r e s o l u t i o ns t r u c t u r eo fm o l l u s c ah ea saw h o l ei s a v a i l a b l et oe x p l a i nt h ef u sa n ds u b u n i t sa r r a n g e m e n t ，t h ei n t e r a c t i o no ff u s ，a n dt h e m e c h a n i s mo fa l l o s t e r i ca n ds y n e r g i s t i ce f f e c t h e r ew e r e p o r t t h e3 ds t r u c t u r eo fd i d e c a m e r i ch a l i o t i sd i v e r s i c o l o r ( g a s t r o p o d a , m o l l u s c a ) h ci s o f o r ml ( h d h1 ) r e c o n s t r u c t e df r o mc r y o e l e c t r o n m i c r o s c o p y , a n dg o ts e v e r a lr e s u l t sa l sf o l l o w ： 1 a b o u t7 8a n g s t r o mr e s o l u t i o ne l e c t r o nd e n s i t ym a po fh d h li st h et o po f s e v e r a la v a i l a b l em o l l u s c ah ew h o l es t r u c t u r e s ； 2 w i t hh d h1 g e n e s e q u e n c ed e t e r m i n e d i nt h i s e x p e r i m e n t ，aw h o l e p s e u d o a t o m i cm o d e lo fh d h 1w a sb u i l tb yh o m o l o g o u s m o d e l i n g ，a u t o m a t i cr i g i d b o d yf i t t i n gt o g e t h e rw i t hm a n u a lf i t t i n gm e t h o d 3 b a s e do na n a l y s i so ft h ed e n s i t ym a p , w ec o n f i r m e d ，f o rt h ef i r s tt i m e ，a n “i n t e r l o c k ”p a t t e r no ff u si nh d h 1s u b u n i t d i m m e r s 眦sp a t t e r ns h o u l db ep l a y i n g 眦i m p o r t a n tr o l ei nt h es t a b i l i t yo fm o l l u s c ah c s m 4 f r o mt h ed e n s i t ym a p , w ea l s oi d e n t i f i e dt h a tt h es i t e sf u - ah i s 2 71 、g i n 2 7 2 a n df u bh i s 3 0 4f r o md i f f e r e n td e c a m e r s 躺s t r u c t u r a lb a s i s f o rh d h ld i d e c a m e r a s s e m b l yf r o md e c a m e r s 5 b a s e do ns e v e r a li n t e r a c t i o ns i t e sb e t w e e nf u si nt h eh d h1d e n s i t ym a pa n d m o d e l ，w ep r o p o s e dam e c h a n i s mf o ra l l o s t e f i ca n ds y n e r g i s t i ce f f e c ti nm u l l u s c ah c s s o m eb a s i c u n i t sc 0 i i l p o s e do ff o u rf u sf r o mn e i g h b o r i n gs u b u n i t - d i m m e r so r n e i g h b o r i n gd e c a m e r sc o u l ds e q u e n t i a l l yt r a n s f e r , f r o mf ut of u ，c o m f o r m a t i o n a l c h a n g e st h r o u g ht w oc l a s s e so ft h e s ei n t e r a c t i o ns i t e s ，a n dc o m b i n eo rr e l e a s eo x y g e n c o o p e r a t i v e l y i nc o n c l u s i o n , m o l l u s c ai - i c sh a v eo x y g e nt r a n s p o r t a t i o na n di m m u n o l o g i c a l f u n c t i o n s ；o u rs t r u c t u r eo fh d h lr e c o n s t r u c t e d 、 ，i t hc r y o - e l e c t r o nm i c r o s c o p y p r o v i d e si m p o r t a n ti n f o r m a t i o nf o rp r o t e i na s s e m b l ya n df u n c t i o n a l i t ym e c h a n i s mo f m o l l u s c ah e m o c y a n i n s k e yw o r d s ：m o l l u s c a ；h e m o c y a n i n ；c r y o e l e c t r o nm i c r o s c o p y3 dr e c o n s t r u c t i o n ； a l l o s t e r i ce f f e c t ；s y n e r g i s t i ce f f e c t i v 缩略词 3 u t r3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n 3 dt h r e ed i m e n s i o n a l 觚 a m i n o a c i d c r y o e mc r y o - e l e c t r o nm i c r o s c o p y f s cf o u r i e rs h e nc o r r e l a t i o n f uf u n c t i o nu l l i t hh o u r h c h e m o c y a n i n h d hh a l i o t i sd i v e r s i c o l o rh e m o c y a n i n h d hih a l i o t i sd i v e r s i c o l o rh e m o c y a n i n i s o f c i r ml h h p l c h t h i g g k b k d a k l h l p o h c m 1 n o d g p l a g e p d b p e l h c h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h a l i o t i st u b e r c u l a t ah e m o c y a n i n i m m u n o g l o b u l i ng k i l o b a s e k i l o d a l t o n k e y h o l e l i m p e th e m o c y a n i n l i m u l u sp o l y p h e m u sh e m o c y a n i n m i n u t e o c t o p u sd o f l e i n ih e m o c y a n i n f u n c t i o nu n i tg p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p r o t e i nd a t ab a n k p a l i n u r u se l e p h a sh e m o c y a n i n 6 1 3 端非翻译区 三维 氨基酸 低温电镜 傅立叶球壳形相关函数 功能单位 小时 血蓝蛋白 杂色鲍血蓝蛋白 杂色鲍血蓝蛋白异型l 艾滋病毒 高效液相色谱 管鲍血蓝蛋白 免疫球蛋白g 千碱基对 千道尔顿 锁眼帽贝血蓝蛋白 l i m u l u sp o l y p h e m u sl f l l 蓝蛋 白 分钟 章鱼血蓝蛋白功能单位g 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白数据库 p a l i n u r u se l e p h a s 蓝蛋白 p i i 埘c r p m 呲c s s d s s r e v o l u t i o np e rm i n u t e r a p a n at h o m a s i a n ah e m o c y a n i n2 f u n c t i o nu n i te s e c o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s i m i a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s p a n u l i r u si n t e r r u p t u s 血蓝蛋白 每分钟转数 红螺血蓝蛋白异型2 功能 单位e 秒 十二烷基硫酸钠 猴免疫缺陷病毒 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：茸誓 日期：矸年占月j 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室 被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：翁芝知 日期：7 矽年( 月i 7 日 导师签名：私勃右 日期：卅年易月j 日 1 1 血蓝蛋白的功能 第一章前言 1 1 1 血蓝蛋白的生物功能 血蓝蛋白( h e m o c y a n i n ，h e ) 是广泛存在于软体动物和节肢动物血淋巴 ( h e m o l y m p h ) 中的呼吸蛋白( r e s p i r a t o r yp r o t e i n ) ，与高等动物血液中含亚铁离 子的血红蛋白( h e m o g l o b i n ) 类似，血蓝蛋白也在软体、节肢动物中主要行使着 运输氧的功能。与前者不同的是，血蓝蛋白含铜离子，所以呈现淡蓝色，故得名； 血红蛋白主要存在于血液中红细胞的胞浆中，而血蓝蛋白则游离于血淋巴中，直 接进行氧的结合和释放。 1 1 2 以k l h 为代表的血蓝蛋白免疫功能及其应用 除了氧运输功能，在过去几十年的研究中，人们还发现了血蓝蛋白的许多其 它功能和应用。 3 0 多年前，c u r t i s ，h e r s e o w i t z 和w e i g l e 等人发现了软体动物m e g a t h u r a c r e n u l a t a ( 俗称g i a n tk e y h o l el i m p e t ，故其h e m o c y a n i n 常简称为k l h ) 的血蓝 蛋白可以在实验动物和人身上均产生强烈的免疫激活作用( i m m u n o s t i m u l a t o r y p r o p e r t i e s ) ，可同时激活人体的体液免疫和细胞免疫( c u r t i se ta 1 ，1 9 7 0 ，1 9 7 1 ； h e r s c o w i t ze ta 1 ，1 9 7 2 ；w e i g l e ，1 9 6 4 ) 。随后，在未经k l h 免疫的人体中，也分 别发现了能结合k l h 的淋巴细胞( h e r s ha n dd y r e ，1 9 7 4 ) 和能与k l h 起交叉反 应的i g g 抗体( m o r o ze ta 1 ，1 9 7 3 ；b u r k ee ta 1 ，1 9 7 7 ) 。 k l h 的一项更广泛的应用是作为半抗原载体( h a p t e nc a r r i e r ) ：一些化合物、 药物、激素、短肽、脂类、多糖和寡聚核苷酸等，由于分子量较小，本身很难或 者根本不可能引发机体产生多克隆抗体；将这些半抗原与k l h 耦合以后再免疫 机体，则可以产生针对这些半抗原的抗原表位的特异性抗体( h a m s j r a n dj m a r k i 。1 9 9 9 ) 。 肿瘤学家还发现k l h 还对一些癌症有非特异或特异的抑制作用，如k l h 可以有效地降低浅表性膀胱癌( s u p e r f i c i a lb l a d d e re a r e i n o m a ) 的复发率( o l s s o n g ta 1 ，1 9 7 4 ) 。k l h 的这一抑癌特性与其携带的一个二聚糖抗原表位o a l ( b i - 3 ) g a l n a e 有关，这一抗原表位可以与膀胱癌细胞表面的一个类似抗原表位发 生交叉反应，故k l h 免疫机体所积累起来的体液和细胞免疫反应就可以逐渐对 癌细胞产生细胞毒性，并有效抑制癌细胞的生长。( w i r g u i ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。此后， k l h 本身或k l h 与其他抗原表位的耦合物被广泛地研究于其他癌症的治疗中， 如黑素瘤( m e l a n o m a ) ( h e l l i n ge ta 1 ，19 9 4 ) ，乳腺癌( b r e a s tc a n c e r ) ( l o n g e n e c k e r e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，卵巢癌( o v a r i a nc a n c e r ) ( y a c y s h y ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 等。 k l h 的抗原呈现( a n t i g e np r e s e n t a t i o n ) 功能除了应用于癌症治疗，同样可 以应用于针对各种病毒的疫苗制备。z i m m e r m a n 等人将h i v 病毒3 0 个氨基酸的 合成短肽与k l h 和氢氧化铝( a l u m i n a ) 佐剂一起注射实验动物，成功获得了抗 血清( z i m m e r m a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) m e y e r 等人将s i v 病毒的高可变区抗原表位 ( h y p e r v a r i a b l ee p i t o p e ) 的合成肽耦合k l h 后注射兔子和恒河猴，也均产生了 中和抗体( m e y e r e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这些成功的例子表明k l h 可能用于a i d s 的疫 苗制备和治疗。此外试验过的k l h 病毒抗原表位耦合疫苗还有b o v i n e p a p i l l o m a v i r u s - 4 ( c a m p oe ta 1 ，19 9 7 ) 、t i c k - b o r n ee n c e p h a l i t i sv i r u s ( v o l k o v a , 1 9 9 8 ) 、p o r c m ep a r v o v i r u s ( k a m s t r u pe ta 1 ，1 9 9 8 ) 等。 d i s s o u s 和g r z y e h 等人还发现血吸虫s c h 洳s o m am a n s o n i 与k l h 有一个可 发生交叉免疫反应的寡聚糖抗原表位( d i s s o u se ta 1 ，1 9 8 6 ；g r z y c he ta 1 ，1 9 8 7 ) ， 这意味着k l h 可能还可用于血吸虫的免疫诊断、预防或治疗。 k l h 的其他有应用潜力的方面还包括：将药物( 如可卡因，尼古丁，吗啡 等) 与k l h 耦合免疫动物产生针对药物的特异抗体，即可用于药物检测和药物 成瘾的治疗；将k l h 用于动物和人体的免疫力测试，用于诊断心理压力和抑郁 2 等心理问题( h a r r i s ，1 9 9 9 ，r e v i e w ) 。 1 1 3 血蓝蛋白结构研究的必要性 综上所述，血蓝蛋白具有输氧和免疫的功能。而作为具有输氧功能的血蓝蛋 白，其每个分子中都含众多亚基，与血红蛋白类似，各个亚基对于氧的结合和释 放，也具有很强的协同效应。协同效应的机制，即如何使众多的亚基依次发生 构象变化，迅速地结合或释放氧分子，是目前血蓝蛋白以及其它具有协同效应的 蛋白研究的热点。生物分子的功能通常都是与其结构密切相关的，因此，研究血 蓝蛋白的结构，是深入了解其协同效应机制的必经之路。 此外，血蓝蛋白是一大类具有序列同源性的蛋白家族，研究不同血蓝蛋白的 结构并加以比较，对于理解蛋白质序列与蛋白质折叠及三维结构之间的关系，是 很好的研究素材。 最后，了解血蓝蛋白的结构，对于血蓝蛋白免疫功能的应用来说，也具有重 要意义。虽然血蓝蛋白在免疫学上的应用大多与其结合的多糖或其他人工偶联上 去的小分子有关，而不仅仅是蛋白质本身，但高度有序的血蓝蛋白亚基和血蓝蛋 白整体的四级结构，为这些多糖或小分子提供了一个骨架，正是结合在这些稳定 的骨架上，这些小分子的半抗原才能刺激机体的免疫系统发生免疫反应。此外， 有文献报道，使用n a t i v e 的k l h 聚合物治疗鼠的膀胱癌，虽然可以获得更强的 免疫原性，但使用亚基形式的k l h 却可以产生更宽范围的多克隆抗体，提示在 k l h 整体复合物中，还有因空间位阻而隐藏起来的抗原表位( w e i g l e ，1 9 6 4 ) 了解血蓝蛋白的结构，就可以更准确地分析这些抗原表位或多糖位点的分布，对 于血蓝蛋白的应用具有重要的指导意义。 1 2 血蓝蛋白研究进展 1 2 1 血蓝蛋白的分类 血蓝蛋白根据其来源的宿主动物的生物学分类不同，可分为不同的类型，不 回类型的血蓝蛋白之间在形态、氨基酸序列、亚基组成和三维结构上都有区别。 一般认为血蓝蛋白可分为三类，如图1 阴影方框所示： 圈1 血蓝蛋白的分类示意图 f 咖怫1 c l 越s i f i c a t i o n o f h e m o c y a n i n s 不同类型血蓝蛋白的基因和蛋白质四级结构将分别在下面详细阐述 1 2 2 节肢动物的血蓝蛋白 节肢动物血蓝蛋白由六聚体的结构单元( b u i l d i n gb l o c k s ) 组成，每一个这 样的六聚体都是由6 条分子量约为7 5k d a 的亚基( s u b u n i t ) 组成，亚基的种类 一般共有3 8 种。某些种类的节肢动物的血蓝蛋白就是i x 6 聚体，而有些种类可 以由更多的6 聚体组合到一起形成更大的复合物：2 x 6 、4 x 6 、6 x 6 或8 x 6 聚体( 最 大为8 x 6 聚体，同一物种一般只有一种6 聚体的组合形式) 如e u r o p e a ns p i n yl o b s t e r ( p a l i n u r u se l e p h a s ) h e m o c y a n i n ( p e l h c ) 是lx 6 - 聚体，由3 种亚基组成，分别为6 5 6 、6 5 6 、6 5 7 个a a 的大小，三种亚基的蛋白 质序列有2 5 3 8 个a l l 的差异( 9 4 2 9 6 2 i d e n t i t y ，9 7 0 9 8 3 s i m i l a r i t y ) 这 三种亚基的序列与同属的p a l i n u r u si n t e r r u p t u sh e m o c y a n i n ( p i n i - i c ) 的两种亚基 序列比较，分别有1 1 9 1 3 1 个a a 位点的差异( 8 0 0 8 1 9 i d e n t i t y ，9 1 6 9 2 4 s i m i l a r i t y ) ( m e i s s n e re ta 1 ，2 0 0 3 ) 。用低温电镜三维重构技术已获得了p e l h c 约8 a 分辨率的结构。 s c o r p i o np a n d i n u si m p e r a t o rh e m o c y a n i n 是4 x 6 一聚体，最新出版的s t r u c t u r e 上发表了y a o 等人的7 a 分辨率的低温电镜三维重构结果( y a oe ta 1 ，2 0 0 9 ) 是目 前已报道的最高分辨率的血蓝蛋白三维结构，从中可以清楚地看出6 聚体中各个 亚基的排布，以及4 个6 聚体间的排布关系。 l i m u l u s p o l y l ： h e m u sh e m o c y a n i n 由8 种不同的亚基组成8 x 6 聚体，l o a 分辨 率的低温电镜三维重构结果( m a r t i ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 显示，相对于4 x 6 聚体的血蓝 蛋白结构，8 x 6 聚体可以分解为2 个4 x 6 聚体以一定的相对旋转角度上下堆叠而 成。 低温电镜三维重构技术解析的亚纳米( s u b n a n o m e t e r ) 分辨率的结构可以很 清楚地解释各个亚基间的排布，结合单个亚基的原子结构模型，可解释血蓝蛋白 在结合释放氧过程中的变构调节( a l l o s t e r i c 陀g u l m i o n ) 和协同效应 ( c o o p e r a t i v i t y ) 。目前已有两种节肢动物血蓝蛋白的亚基结构由x 射线晶体学 方法解析出来：3 2 a 分辨率的d e o x y g e n m e dp a n u l i r u si n t e r r u p t u sh e m o c y a n i n s u b u n i t ( v o l b e d ac ta 1 ，1 9 8 9 ) ；l i m u l u s p o l y p h e m u sh e m o c y a n i ns u b u n i tl i2 1 8 a 分辨率的d e o x y g e n a t e d 状态( h a z e se ta 1 ，1 9 9 3 ) 和2 4 a 分辨率的o x y g e n a t e d 状 5 态( m a g n u s e ta 1 ，1 9 9 4 ) 下的结构。这些结构都是以同源六聚体的形式结晶出来 的，六个同源亚基的排布类似于n a t i v e 状态下的异源六聚体。 从l o 种节肢动物血蓝蛋白的蛋白质序列对比结果来看，p a n u l i r u si n t e r r u p t u s h e m o c y a n i n ( 以后简称p i n h c ) 和l i m u l u sp o l y p h e m u sh e m o e y a n i n ( 以后简称 l p o h c ) 分别代表了两大类节肢动物血蓝蛋白伽l s t a c e 趾h e m o e y a n i n ( 甲壳 亚门，如蟹c r a b s ，龙虾l o b s t e r s ，虾s h r i m p s ) 和c h e l i c e r a t a nh e m o c y a n i n ( 螯肢亚 门，如蜘蛛s p i d e r s , 蝎子s c o r p i o n s ，马蹄蟹h o r s e s h o ec r a b s ) 。这两大类血蓝蛋 白有3 3 左右的序歹i j 同源性，且亚基的结构也非常类似，形成相似的六聚体结构， 但二者在由六聚体组装成更高一级的结构时形式有所不同( h a z e se ta 1 ，1 9 9 3 ) ， 人们相信这一不同与c h e l i c e r a t a nh e m o c y a n i n n 端的2 1 a a 的缺失有关。 图2 是l i m u l u sp o l y p h e m u sh e m o c y a n i ns u b u n i ti i2 1 8 a 分辨率的原子模型， 整个亚基可分为3 个d o m a i n ，d o m a i nl 富含q h e l i x ，其中有一个c 1 离子结合 位点，可能与变构作用有关；d o m a i n 2 富含q - h e l i x ，其核心的2 个c u 离子，是 血蓝蛋白结合氧的部位，c u 离子由其周围的6 个h i s 侧链结合并稳定着，d o m a i n 2 也是亚基问结合形成3 次旋转对称的3 聚体的主要部位，上下两个3 聚体再叠 合在一起形成6 聚体：d o m a i n3 主要由1 3 s h e e t 组成1 3 桶( b b a r r e l ) 的结构，在 表面的l o o p 处有一个c a 2 + 离子结合位点，c a + 离子的结合可以稳定亚基本身的 结构，也可能和调节氧结合能力有关( h a z e se ta 1 ，1 9 9 3 ) 比较l p o h cd e o x y g e n a t e d 状态和o x y g e n a t e d 状态下结构的异同，以及与 p i n h c 比较，可以推测血蓝蛋白结合氧释放氧的过程中构象变化的机理，以及产 生协同效应的结构基础。o x y g e n a t e d 状态下的l p o h c ，其核心的2 个铜离子间 距为3 6 + - 0 2 a ，而d e o x y g e n a t e d 状态下为4 6 a ，但其整体的三级四级结构并 无很大变化( m a g n u se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。但比较l p o h c 与p i n h c 则发现，二者d o m a i n 2 和d o m a i n 3 均能较好地重合，主要的区别在于d o m a i n l ：在l p o h c 中，d o m a i n l 相对于d o m a i n 2 3 有8 。左右的旋转角度。比较二者6 聚体的整体结构又发现， 如果先将其中一个3 聚体( 前面已提到，一个6 聚体可以看作两个3 次旋转对 称的3 聚体上下叠在一起) 互相重合，则l p o h c 的另一个3 聚体必须要想对于 3 次轴旋转3 1 。，并向第一个3 聚体移近0 9a 才能很好地与p i n h c 的第二个3 聚体重合( h a z e se ta 1 ，1 9 9 3 ) 这两个旋转角度的变化被认为在所有节肢动物 6 血蓝蛋白的氧亲和力的调节以及协同效应的产生中均扮演了重要角色。 a 毒 2 一 l cd 田2l i 删l u sp o l n 曲e l u sh e l l o c y e m i ns u b u n i ti i2 1 8 a 分辨率的原子模查 脚r 吐t h e2 1 8 r e s o l u 6 0 na t o m i c m o d e l o f “- “缸p 口钾慨州时h e m o c y a n i n n b u t i t 整体结构：b - d 分别演示d o 哪i n1 2 ，3 的结构b 中蕾色小球是c 1 c 中两十黄色 小球是c u 离子的位置，d 中绿色小球示c g 。( 内窖引自h a z e se ta 1 ，1 9 9 3 ) 1 2 3 软体动物的血蓝蛋白 软体动物血蓝蛋白与节肢动物血蓝蛋白在基因结构上就完全不同，一般认为 二者由不同的o x y g e n - c o n s u m i n g 曲习佃进化而来，即在进化上没有什么联系 ( b u r m e m e r , 2 0 0 1 ) 。事实上。更直观地来看，软体动物血蓝蛋白在形态上与节 7 瓣 b 肢动物血蓝蛋白完全不同，后者由六聚体的b u i l d i n gb l o c k s 组成较紧凑的球状或 块状结构，而前者的基本构成是由1 0 个亚基组成十聚体的中空圆柱状结构，柱 子的直径约3 5 n m ，高1 8 n m ，内部有一圈称为c o l l a r 的结构。 软体动物的血蓝蛋白又分为两大亚类( s u b c l a s s e s ) ：头足纲血蓝蛋白只有 十聚体( d e t a i n e r ) 一种形式，且十聚体的c o l l a r 结构位于柱子的中央部位，因 此柱子是上下对称的；而腹足纲血蓝蛋白中的十聚体不是上下对称的，表现为除 了中间的c o l l a r 结构( 也有人称之为a r c ) 外，在柱子一端的内部还有额外的称 为s l a b 的结构，所以可认为柱子有首尾两端( f a c ea n de n d ) ，腹足纲动物的血 蓝蛋白大部分是由2 个十聚体首首相接( f a c e - t o f a c e ) 形成的二十聚体 ( d i d e c a m e r ) ，还有一部分可以在二十聚体核心的基础上，再以首尾相接 ( f a c e - t o - e n d ) 的方式在两端连接上额外的一个或多个十聚体，在有些物种中可 以以这种形式组装成很长的管状结构( k e l l e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。此外，头足纲和腹 足纲血蓝蛋白在基因结构上也有微小的差别。 1 2 4 软体动物血蓝蛋白的基因结构 软体动物血蓝蛋白的亚基( s u b u n i t ) 是一条, - - 4 0 0 k d a 的多肽链，每一亚基 均折叠成7 8 个球形结构，称为 f u n c t i o n a lu n i t ( 简称f u ) ，每个f u 的分 子量约为4 5 - - 6 5 k d a ，均带有一个双铜离子的氧结合活性中心。多序列比对结果 表明，这些线性排列成一串的f ir s 的一级结构( 即氨基酸序列) 虽不同，但高 度保守，约有6 0 - 7 0 的序列同源性。这一序列相似性不仅仅存在于同一亚基的 不同f u 间，而且不同物种间的f u 也有同样程度的序列相似性。这一现象表明， 软体动物血蓝蛋白很有可能是由一个原始的单一f u 基因经过基因的倍增和融合 ( g e n ed u p l i c a t i o n sa n df u s i o n s ) ，进化为现在的结构。 头足纲和腹足纲血蓝蛋白基因结构的微小差别，主要为头足纲血蓝蛋白的亚 基一般只有7 个f u ( 命名为f ua - g ) ，而腹足纲血蓝蛋白有8 个f u ( 命名为 f ua - h ) 。 图3 分别是腹足纲h a l i o t i st u b e r c u l a t ah e m o c y a n i n1 ( h t h1 ) 和头足纲 8 o c t o p u sd o f l e i n ih e r n o c y a n i n 基因结构示意图。软体动物血蓝蛋自的5 端有编 码信号肚( s i g n a lp e p t i c e ) 的一小段序列，在各个f u 序列间或f u 内部有大量 的内台子序列t3 有u t r ( u n - t r a n s l a t e dr e g i o n ) 区。 ，。犍如。b 。，。， o c t o p u si 赢j 。 “南$ 岳古当函占古壬封” 圈3 h t l i l 和删的基因培柯 f 呐n 1 g _ l h m m o f h t h l a n d o d l l 编码f i ( a - h ) 的不同外显于区域甩不同颜色标示，灰色衰示f i 问的内音于黑色衰示f u 蝙码区域内部的内古子自和s ，是蝙码信号肚的两段井显于，u t r 表示3 b t r ( a d a p t e d f r 帽 b e r n h a r de ta l2 0 0 1 ) 。 多序列比对结果和x 射线晶体学，低温电镜三维重构技术解析的结构均表 明，虽然头足纲和腹足纲血蓝蛋白存在上述几点差异但总的来说，它们的生化 特性、基因序列和结构、f u 的结构及捧布等大同小异。本研究采用的样品提纯 自杂色鲍鱼h a l i o t i sd i v e r s i c o l o rh e m o c y a n i n ( h d h ) ，属于腹足纲，此后的研 究综述将以腹足纲血蓝蛋白为代表，除特别标示之外，这些描述一般也适用于头 足纲血蓝蛋白。 1 2 5 软体动物血蓝蛋白的生物合成 一般认为软体动物血蓝蛋白的生物合成( b i o s y n t h e s i s ) 发生在软体动物外套 膜等c o m l c c f i v et i s s u e 的孔细胞( p o r ec e l l s ) 中，这些细胞一般很大，富含内质 同，有独特的多孔的细胞表面特征在外套膜等组织中分布广泛。在这些细胞的 内质网中有时可发现富集的血蓝蛋白已经组装成完整的柱状结构，有时甚至可形 成细胞内的晶格状排列( c r y s t a l l i n ea r r a y s ) ( a l b r e c h te ta 1 ，2 0 0 1 ) 值得一提的是，软体动物血蓝蛋白的表达可能是间歇性的，如在k l h 的测 序过程中，血蓝蛋白r n a 的提取经常会失败，据推测，可能是因为k l h 经过 很短一段时间的转录和表达后，就进入较长时间的间歇期，然后再进入下一次短 暂的表达。 1 2 6 软体动物血蓝蛋白的生化性质 在关于k l h 的研究中，人们发现提纯的k l h 中其实包含了两种亚基的变 体( s u b u n i ti s o f o r m s ) ，后来分别命名为k l h l 和k l h 2 。这两种亚基的分子量 大小非常接近，如k l h i 约3 9 0k d a ，k l h 2 约3 6 0k d a ( s o h n g e ne ta 1 ，1 9 9 7 ) ， 因此在进行k l h 亚基( 在高p h 时血蓝蛋白会解离成单一亚基) 总样品的 s d s - p a g e 时，总是只能看到单一的条带；但是在进行非变性p a g e 时，则可 以区分出两条带，说明样品中存在两种生化特征不一样的分子。随后的蛋白质测 序和基因测序均证明了两种亚基及其编码序列的存在。在h a l i o t i st u b e r c u l a t a h e m o c y a n i n ( h t h ) 等其他许多腹足纲物种的血蓝蛋白中也发现并确证了两种 s u b u n i ti s o f o r m s 的存在( 命名为h t h l h t h 2 等) ( k e l l e re ta 1 ，1 9 9 9 ；a l t e n