（应用化学专业论文）紫杉醇的SPEHPLC分析方法建立及初分离工艺研究.pdf

哈尔滨工程大学硕士学位论文 摘要 紫杉醇是一种从红豆杉植物中获得的具有独特疗效的抗癌天然植物产 物，现已被多个国家批准应用于临床治疗卵巢癌和乳腺癌等。紫杉醇目前主 要还是依靠从红豆杉植物中提取。其制备工艺可分为四部分：前处理技术、 色谱分离技术、后处理技术和化学转化技术。本论文主要对前处理技术进行 研究。它的作用是去除极性与紫杉醇相差较大的非极性和高极性杂质，从而 降低后续色谱的负荷并改善传质阻力，发挥或增强色谱分离技术高选择性的 能力。论文针对目前前处理研究中存在的问题，通过新方法与传统方法的比 较，对前处理技术进行了系统的研究，并筛选出一种较为理想的前处理方法， 为整个制备工艺的完善奠定基础。 论文提出“新方法与传统方法相比较”的总体思路，对紫杉醇制备中的 前处理技术进行系统研究。首先是选择研究的目标，即两种新方法一h y 液液萃取法、树脂联用法，两种传统方法氯仿萃取法和酸碱沉淀法：其 次，确定评价指标并建立相应的分析方法：最后，综合分析各指标的测定结 果，筛选并建立理想的前处理方法。 论文中主要选择杂质去除率、脱色率和紫杉醇回收率为指标，相应建立 的分析方法有重量、电导、u v 、t l c 和h p l c ，着重对h p l c 方法进行阐述。 利用正相氧化铝为填料的固相萃取作为h p l c 分析前的样品预处理方法，对 其层析条件进行了全面考察。首次提出了以甲醇溶解样品上样并真空干燥的 全新上样方法，不仅解决了上样时面临的溶解度问题，而且将影响氧化铝吸 附效果的甲醇挥出。结果表明，样品经固相萃取处理后，大量杂质被去除， 紫杉醇得到了很好的富集，其回收率在9 0 以上，纯度由0 7 提高到2 5 。 紫杉醇浸膏分别经四种前处理方法除杂后，发现h - y 液液萃取法的杂质 去除率最高，达到了8 5 以上，树脂联用法次之，酸碱沉淀法最差。脱色率 哈尔滨工程大学硕士学位论文 和紫杉醇回收率也有同样的趋势。在h y 液液萃取法和树脂联用法去除杂质 过程中，紫杉醇几乎全部回收。根据t l c 、h p l c 分析，h y 液液萃取法和 树脂联用法除去的均是在t l c 板上没有保留，极性高于紫杉醇的杂质，氯仿 萃取法、树脂联用法和酸碱沉淀法除杂后，样品在t l c 板的原点处仍有一定 量没有展开的高极性杂质，而h y 液液萃取法则可较完全的去除这些杂质， 并且紫杉醇几乎没有损失。 总之，通过多指标对四种前处理方法进行综合评价，表明h y 液液萃取 法无论紫杉醇回收率还是杂质去除率或脱色率，都高于其它三种方法，可用 于紫杉醇的制备中。 关键词：紫杉醇：前处理；固相萃取：h p l c 哈尔滨工程大学硕士学位论文 a b s t r a c t p a c l i t a x e l ( t a x 0 1 ) i s a ni m p o r t a n ta n t i c a n c e rn a t u r a l p r o d u c tw h i c hw a s i s o l a t e df r o mt h ey e wt r e e i th a sb e e np e r m i t t e dt ot r e a to v a r i a na n db r e a s tc a n c e r b ym a n yc o u n t r i e s s of a r , p a c l i t a x e lm o s t l yd e p e n d e do ni s o l a t i n gf r o my e wt r e e i t sp r o d u c t i o nt e c h n i c sc o n s i s to ff o u rp a r t s ，p r e t r e a t m e n t c h r o m a t o g r a p h i c i s o l a t i o n ，b a c k t r e a t m e n ta n dc h e m i c a lt r a n s l a t i o n a sap a r to fs t u d i e so f p r o d u c t i o no ft a x o l ，t h er o l eo fp r e t r e a t m e n tw a st oe l i m i n a t em o r ep o l a ra n d a p o l a ri m p u r i t y , i tn o to n l yr e d u c et h ef o l l o w i n gc h r o m a t o g r a p h ) r sb u r d e n ，b u t a l s op l a y o ri m p r o v ei t sh i g hs e l e c t i v ea b i l i t y i nt h i sp a p e r w ed e s i r e dt od e v e l o p ap r e t r e a t m e n lm e t h o ds u i t a b l ef o r t h el a r g e - s c a l es c r e e n i n go ft a x u sc r u d ee x t r a c t ， l a i daf o u n d a t i o nf o r t h ew h o l e p r o d u c t i o nw o r k i nt h i s p a p e r , t h ec o m p r e h e n s i v ed e s i g no fs t u d y i n go v e r a l lp r e t r e a t m e n t m e t h o d s 。c o m p a r e db e t w e e nn e w a n dt r a d i t i o n a lm e t h o d s ”w a sp u tf o r w a r df o r t h ef i r s tt i m e f i r s t l y s t u d i e do b j e c t sw e r es e l e c t e d i n c l u d i n gt w on e w t e c h n i q u e s h y l i q u i d l i q u i d e x t r a c t i o na n dr e s i n c h r o m a t o g r a p h y a n d t p , 0t r a d i t i o n a l t e c h n i q u e s c h l o r o f o r me x t r a c t i o na n da c i d i c b a s i cp r e c i p i t a t i o n t h en e x t s t e p w a st od e c i d et h ec o n c r e t ee v a l u a t i n gi n d e xa n dd e v e l o pr e l a t e d a n a l y t i c a l m e t h o d s f i n a l l y , r e s u l t so fe a c hi n d e xw e f ea n a l y z e da n da l li d e a lp r e t r e a t m e n t t e c h n i q u ew a s s e l e c t e d t h ei n d e c e ss e l e c t e di nt h e p a p e r w e r e i m p u r i l x e l i m i n a t i o n r a t e ， d e c o l o r a t i o nr a t ea n d p a c l i t a x e lr e c o v e r y i na d d i t i o n w e i g h t e l e c t r i c a l c o n d u c t a n c e ( e c ) u vt l ca n dh p l cw e r es e l e c t e d a sr e l a t e d a n a l ”i c a l m e t h o d s ，e s p e c i a l l y , h p l cm e t h o dw a se m p h a s i z e d p r i o rt oa n a l y s i sf o rt a x a n e s o fd i f f e r e n tp o l a r i t yb yh p l c ，t h en e u t r a la 1 2 0 3s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) w a s u s e dt os c r e e no ft h ec r u d ee x t r a c t ，f u r t h e r m o r e t h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s o fs p ew a sr e s e a r c h e dg e n e r a l l y i no r d e rt oa v o i dap r o b l e mw i t ht h ed i s s o l v i n g o ft h ec r u d ee n c o u n t e r e da sa d d i n gs a m p l eo fs p e i tw a sd e c i d e d1 0u s em e t h a n o l 哈尔滨工程大学硕士学位论文 t od i s s o l v et h ec r u d e ，a d d e dt ot h ec o l u m na n de v a p o r a t e dt od r y n e s si n v a c u u m - d e s i c c a t o r t oo u rk n o w l e d g et h e r ei sp r e s e n t l yn op u b l i s h e ds u c hm e t h o d ， w h i c hn o to n l ys o l v et h es o l u b i l i t yp r o b l e m ，b u ta l s or e l e a s em e t h a n o ld e c r e a s i n g a b s o r p t i o na n di s o l a t i o na b i l i t yo fa 1 2 0 3 t h er e s u l t si n d i c a t e dl h a tt h en e u t r a l a 1 2 0 3s p ec a ne l i m i n a t e a g r e a t d e a lo fi m p u r i t y p a c l i t a x e lw a se n r i c h e d e f f e c t i v e l ya n di t sr e c o v e r yw a so v e r9 0 p u r i t yw a si m p r o v e df r o mo 7 t o 2 5 i tw a sf o u n dt h a tt h ei m p u r i t ye l i m i n a t i o nr a t eo fh - yl i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n w a st h e h i g h e s t ，e x c e e d i n g 8 5 n e x ti sr e s i nc h r o m a t o g r a p h ) a c i d i c b a s i c p r e c i p i t a t i o nw a sm o s tb a d l y t h e r ew e r es a r n et r e n d sf o rd e c o l o r a t i o nr a t ea n d p a c l i t a x e lr e c o v e r 3 , d u r i n gt h ei m p u r i t ys c r e e n i n gb yh yl i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n a n dr e s i nc h r o m a t o g r a p h y p a c l i t a x e lw a sa l m o s tf u l l yr e c o v e r e d a c c o r d i n gt o t l ca n dh p l cr e s u l t s i m p u r i t ye l i m i n a t e db yh yl i q u i d l i q u i de x t r a c t i o na n d r e s i n c h r o m a t o g r a p h ) w a s m o r e p o l a r s u b s t a n c e i no u rr e s e a r c h h y l i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o nc a nc o m p l e t e l ye l i m i n a t et h em o r ep o l a ri m p u r i t y , t h e r e w a ss t i l lm u c hm o r ep o l a ri m p u r i t yw h i c hd i d n ts p r e a do nt h eo r i g i no ft l cp l a t e f o ro t h e rt e c h n i q u e s i nc o n c l u s i o n h yl i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n 、 a st h eb e s to n ea m o n gt h ef o u r p r e t r e a t m e n tt e c h n i q u e s t h i sm e t h o da p p e a r st o b es u i t a b l ef o rt h e l a r g e - s c a l e s c r e e n i n go fc r u d es a m p l e sb e c a u s eo fi t ss i m p l i c i t ) a n dl o b u s eo fo r g a n i c s o l v e n t sa n de s p e c i a l l yi t sh i g hp r o d u c t i v i t ) k e yw o r d s ：p a c l i t a x e l ；p r e t r e a t m e n t ：s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ：h p l c 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本论文的所有工作，是在导师的指导 下，由作者本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文 献的引用己在文中指出，并与参考文献相对应。除文中己 注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人豉集体已 经公开发表的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律结果由本人承担。 作者( 签字) - 墨值 日期：7 口舻年，a 月 f曰 哈尔滨工程大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 研究背景 癌症，己成为严重威胁人类健康的主要病症之一。每年约有6 0 0 万新的 病例被报道，其引起的死亡率占所有疾病死亡率的第二位，仅次于心血管疾 病。由于癌症早期诊断的困难，相当数量的癌症患者将依赖药物治疗，因此 进行抗癌药物的研究与开发是非常必要的。紫杉醇( p a c l i t a x e l ，商品名t a x 0 1 ) 因其独特的作用机理，成为新一代抗癌药物的代表。 1 1 1 紫杉醇的发展史 1 9 5 8 年，美国国家癌症协会n c i ( n a t i o n a lc a n c e ri n s t i t u t e ) 发起一项 历时，2 0 余年的筛选3 5 0 0 0 多种植物提取物的计划，以寻找安全有效的抗肿 瘤新药。在这项计划实施的过程中，美国化学家w a n i 和w a l l 于1 9 7 1 年从美 国西海岸的短叶红豆杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 树皮中提取出一种抗肿瘤物质并命 名为紫杉醇，并于同年乱i 等确定了其化学结构。此后各国药理学家、药 物化学家对紫杉醇进行了大量研究，1 9 7 8 年确定了紫杉醇的剂型；1 9 7 9 年， h o r o r i t z 等报告了紫杉酵的作用机理j 9 8 0 年开始进行给药规程化研究， 紫杉醇的一期临床研究始于1 9 8 3 年，其目标是决定最大耐受量和剂量限制毒 性3j ；紫杉醇的二期临床研究始于1 9 8 7 年，主要着重于紫杉醇对多种癌症的 疗效进行观察【3 】，1 9 8 9 年基本完成。过程中发现，紫杉醇对卵巢癌和肺癌的 治疗效果最好。二期临床中，紫杉醇对卵巢癌的最高有效率可达4 8 ，部分 缓解率最高为3 1 ，完全缓解率最高为1 3 7 ：紫杉醇对肺癌的有效率为 3 7 0 i4 1 。1 9 9 0 年以后转入i i i 期临床试验，1 9 9 2 年1 2 月，紫杉醇被美国 药品与食品管理局( f d a ) 批准用于治疗晚期卵巢癌，此后，f d a 又相继批准 紫杉醇用于治疗转移性乳腺癌( 1 9 9 4 年) 、与爱滋病关联的k a p o s i s 恶性肿 哈尔滨工程大学硕士学位论文 瘤( 1 9 9 7 年) ，并与顺铂联合使用作为治疗晚期卵巢癌( 1 9 9 8 年) 和非小细胞 肺癌( 1 9 9 9 年) 的一线用药，展现出广阔的应用和发展前景。 11 2 紫杉醇的药理作用机制 紫杉醇具有独特的抗癌作用机制，能诱导与促进微管蛋白聚合、微管装 备与微管稳定，从而阻止肿瘤细胞的生长。微管是真核细胞的种组成成分， 它是由两条类似的多肽( 旺和1 3 ) 为单位构成的微管蛋白二聚体形成的。正常 情况下，微管与微管蛋白二聚体之间存在动态平衡。紫杉醇可以使两者之间 失去动态平衡，导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锥体和纺锥丝，抑制了细 胞的分裂和增值，从而发挥抗肿瘤作用。体外研究表明，紫杉醇浓度依赖性、 可逆性地结合到微管上，尤其是结合到n 端微管蛋白的p 一亚蛋自上，这一作 用降低聚合所需的微管蛋白浓度，是动态平衡向着微管装备的方向移动，增 加聚合的速率与产量。紫杉醇诱导形成的微管较短，并且比不用紫杉醇时正 常形成的微管屈回性约1 0 倍。另外，紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的 正常状态再生，会防止正常的有丝分裂纺锥体的形成，导致染色体断裂并抑 制细胞复制与转移，紫杉醇改变了细胞有丝分裂过程，使有丝分裂持续时间 从o 5 h 增加到15 h ，并抑制细胞质分裂。这导致形成多核细胞，这些多核细 胞继续回复到g 1 期，然后试图再次进行有丝分裂，但在有丝分裂中没有阻 止细胞( a r r e s t i n g c e l i s ) ，在许多细胞中还观察到微核。抑制纺锥体的形成似乎 与这种不正常的有丝分裂有关”j 。 1 2 研究意义 1 2 1 紫杉醇及其相关化合物 紫杉醇是一个具有独特化学结构的二萜类紫杉烷衍生物。分子由3 个主 环构成二萜核，上连1 个苯异丝氨酸侧链。分子中有1 1 个手性中心和多个取 代基团。分子式为c 。h 5 i n o 相对分子量8 5 3 9 2 。紫杉醇的母核部分是一 哈尔滨工程大学硕士学位论文 个复杂的四环体系，有许多的功能团和立体化学结构，如图1 1 a 所示。 从紫杉植物中已分离得到2 0 0 余种紫杉烷二萜类化合物l6 1 ，其中重要的 化合物有： 紫杉醇( p a c l i t a x e l ，t a x o l 4 ) 三尖杉宁碱( c e p h a l o m a n n i n e ) 紫杉醇c 1 0 一去乙酰基巴卡亭i i i ( 1 0 一d e a c e t y l b a c c a t i n ，i o d a b l i 【) 巴卡亭i i i ( b a c c a t i n ) l o 一去乙酰綮杉醇( i o y d e a c e t y l t a x 0 1 ) 1 0 一去乙酰三尖杉宁碱( i ，1 3 - d i a c e t y - j 0 - d e a c e u ，l c e p h a l o m a n n i n e ) 1 0 一去乙酰紫杉醇c 这些化合物在结构上述均具有6 8 6 三环2 0 ( 5 ) 环氧结构( 见图1 1 ) ， 其中只有紫杉醇( p a c l i t a x e l ，丁酞o f 8 ) 和多烯紫杉醇( d o c t a x e l ，t a x o t e r e 。) 被批准为抗癌药物上市，多烯紫杉醇是在进行紫杉烷类半合成研究时得到的 一种紫杉醇类似物，是第二代紫杉烷类抗癌新药的代表。其余的化合物只可 作为半合成的原料。半合成原料在紫杉提取物中的总量为紫杉醇的】0 倍以 上。 1 2 2 紫杉醇的市场需求与药源的矛盾 1 221 市场需求状况 迄今为止，紫杉醇作为唯一促进微管聚合的抗癌药物，现已在全球4 0 多个国家上市。目前，进入我国市场的紫杉醇有美国旌贵宝的泰素，法国罗 纳普朗克的多烯紫杉醇以及澳大利亚的安素泰。我国在1 9 8 4 年就开始了对紫 杉醇的研究，以国产红豆杉植物为原料，成功生产出了紫杉醇( 商品名紫素) ， 于1 9 9 5 年2 月获准进行1 i 期临床试验，并于1 9 9 5 年8 月获准二类新药证书。 尽管如此，仍不能满足市场的需求。以每个患者需2 克紫杉醇的消费剂量来 哈尔滨工程大学硕士学位论文 。1 h?pl娶。a。oo o 蕊u i q c 6 h s n tbuooh h s 1 8 l l 坚，一o h 1 3 ：io 5 气2 h h 拶二4 i 、o p h ic 6 嗽一 ” a qo o ( = 6 h 5 u 一、，o h no一7 、h h o h h 矿- 一ho c 6 h s 一0 a 。o 、 0 c e p h a l o m a n n i n e ( t a x o lb ) a 呜o ? 掣5 7 一，0 h no 7 h ho h h 矿叫h o c 6 比一o a c o 、 o t a x o ic o h o 、o h j q h s n ? 0 ，。h 一 、严1 。h ho h h a ，h o q h 5 一一o a c o 7 - x y l o s y l - t a x o la h o 0 k h 叫 一，一o h i no一fh h o h h 矿一ho c 6 ”，o 棚 o a 气o 1 、，o h o 一7 h h 矿一h ? o 厶h s 一0 枷 0 b a c c a t i n a 呜0 。一i 训 矿一h 、0 q , u ，0 a 。o 1 0 _ d e a o e c v jb a o c a t j n a c 0 喜鼍 ， o h o h h 1167。-acohc 、。 c , h 。一o ” o 9 - d i h y d r o - 13 - a c e t y lb a c c a t i ni 图1 1重要的紫杉烷化合物 4 哈尔滨工程大学硕士学位论文 计算，1 公斤紫杉醇仅能满足5 0 0 个患者的用药。全世界约有2 0 0 0 万癌症患 者，有近2 0 0 万人需要使用紫杉醇。因此紫杉醇销售市场的理论饱和容量可 达4 0 0 0 公斤。美国每年有6 万病人需要使用紫杉醇进行治疗。中国每年约有 1 7 0 万人成为癌症新患者，而我国乳腺癌和卵巢癌的发病率高于美国，人口 基数也是美国的6 倍，估计我国每年至少有3 0 万乳腺癌和卵巢癌的患者需要 紫杉醇类药物进行治疗。 3 0 2 5 2 i5 1 0 、 0 紫杉酊销售移( 亿美元 昌凸白卣勘锢 1 9 9 21 9 9 4】9 9 51 9 9 8i q 叫2 0 0 02 0 0 i2 0 0 2 图1 2 紫杉醇全球市场增长情况 紫杉醇价格高昂，患者支付能力往往成为紫杉醇消费量的决定因素。尽 管如此，由于紫杉醇对多种癌症疗效确切、药理作用独特，目前尚无可替代 产品，因此，紫杉醇自1 9 9 2 年上市以来，销售额以年均j 亿美元的净值迅速 增长，2 0 0 2 年紫杉醇的实际销售量约3 5 0 4 0 0 k g ，仅为理论市场饱和量的十 分之一。 1 2 ，2 ，2 红豆杉资源面临的问题及鳃决办法 在紫杉醇需求快速增长的同时，紫杉醇的药源解决途径成为关注的焦点。 因为紫杉醇仅见于裸子植物红豆杉科的红豆杉属和澳洲红豆杉属植株体内。 全世界约有1 1 种紫杉属植物，主要分布在北半球温带和亚热带。我国有4 个品 种和1 个变种f 9 】。除浆果紫杉、加拿大紫杉和杂交品种曼地亚紫杉外，其余紫 杉属植物均生长缓慢，需百年以上才能成树，用树皮作原料生产紫杉醇意味 着整棵树的死亡，资源不可再生。由于人们的过度采伐，本已十分有限的红 豆杉资源储量目益减少，因此，资源不可再生性和紧缺性是紫杉醇生产的主 要矛盾。一般认为，紫杉醇在该属植物树皮中的含量为0 0 0 0 1 o 0 6 9 ，平 哈尔滨工程大学硕士学位论文 均0 0 1 5 ，目前的产业收率为0 0 1 。依此计算，每提取和生产1 公斤的紫 杉醇需要1 0 吨的紫杉树皮，其结果将砍伐3 0 0 0 棵成树。目前全球每年生产紫 杉醇4 0 0 公斤仍远不能满足目前的市场需求。如果不改变现有的资源供给和生 产水平，即便将全部的天然资源采伐。也只能满足短期的需要。因此，在紫 杉醇作为投资新药发展的后期，其使用已不受安全和疗效的制约，而是被药 源资源的供应所限制。为了解决紫杉醇的来源问题，国内外学者进行了大量 的研究工作，取得了令人瞩目的成就。现将其归纳如下： ( 】) 全合成 1 9 9 4 年，紫杉醇的全合成在实验室获得成功f 8 9 1 ，但由于过程复杂，总收 率太低，相应的费用较高，只有理论价值，难以形成商业化生产。 ( 2 ) 化学半合成 半合成是以从红豆杉属植物的枝叶中提取的巴卡亭i i i ( b a c c a t i n i l l ) 或 l o 一去乙酰基巴卡亭 - i ( 1 0 一d e a c e t y l b a c c a t i n ，1 0 - d a b ) 为前体，进行紫杉醇 的合成1 m i 。其过程较全合成简单，成本较低，因为l o - d a b 和巴卡亭i i i 在红 豆杉属植物中的含量较紫杉醇丰富，分离提取也较紫杉醇容易，而且树叶是 可再生资源。从长远看，化学半合成是解决紫杉醇资源问题的有效办法。 ( 3 ) 植物细胞培养法 植物细胞培养法就是将红豆杉植物的茎、形成层或树皮的愈伤组织诱导， 进行继代培养，在建立细胞的悬浮培养，进而扩大培养生产紫杉醇。此方法 在经济和环境问题上均具有吸引力，是一个非常活跃的研究领域，目前还处 于商业化的前期。 这种人们所期望的紫杉醇商业化生产，不受病虫害、季节的影响，在生 物反应器中大规模生产并通过控制培养条件诱导出大量的紫杉醇，所得产物 比从植物体内直接提取得到产物，可简化分离、纯化的步骤：同时还可以生 产紫杉醇的半合成前体及其他有抗癌活性的原植物体内不含有的化合物。目 前，国内外在分化细胞株系和培养条件方面作了不少工作，摸索了外植体、 哈尔滨工程大学硕士学位论文 光照、培养剂组成等因素对细胞培养及紫杉醇生产的影响，从而可望实现红 豆杉细胞培养生产紫杉醇的突破j 。 ( 4 ) 真菌培养法( 微生物发酵法) 通过真菌生产紫杉醇也是解决紫杉醇短缺的方法之一。目前，己从红豆 杉树皮中分离t 皇2 0 0 多种微生物，其中一些内生真菌已被证实能生产紫杉醇。 但表达量偏低，近期内不可能实现商业化生产。 ( 5 ) 人工栽培 人工栽培是目前解决紫杉醇来源的较好途径之一。采用种子繁殖及扦插 等无性繁殖手段，大量培育红豆杉幼苗，开辟人工种植园，用此方法获得的 灌木型红豆杉生长快，产量大。近年来，美国等大力发展t a x u sm e d i ah i c h s i i 的人工栽培，使资源短缺的现状得到明显缓解。美国施贵宝公司于1 9 9 1 年种 植了4 0 0 万株，此后每年又增加种植1 0 0 0 万株。我国云南农科院高山经济植 物所繁育了5 万株，成活率达9 4 3 ：湖南缓宁县林业局繁殖幼苗3 0 0 0 多 株，现己移栽大田：黑龙江中医学院人工育苗也获成功；1 9 9 9 年重庆峡光科 技开发公司，在山峡库区引种繁殖北美紫杉全部成活，1 年生枝条扦插繁殖 成活率达到9 0 以上；烟台中林紫杉新科技有限公司从美国引种杂交品种 t a x u s m a d i a h i c h s i i 在山东省广泛栽培，预计国内外的紫杉醇资源供给现状在 未来几年内将会有明显的改善。 相比较而言，紫杉的人工大量栽培是最为现实、快捷和成本低廉的应对 措施和方法。 1 2 3 紫杉醇生产现状及面临的问题 12 31 我国紫杉醇原料药产业现状 目前，我国紫杉属原料药生产厂主要有云南汉德、陕西天成、洛南泰华 和陕西奥赛斯等骨干企业。另外，尚有零星散在的小加工厂数十家。中国的 生产量已近】o o 公斤，均自天然紫杉中直接提取，生产技术水平严重落后， 哈尔滨工程大学硕士学位论文 存在的问题严重，如工艺的可靠性、重复性和稳定性极差，收率低、波动范 围大，甚至时常颗粒无收，生产中原料和辅料浪费大、消耗高、不能回收半 合成原料、成本高攀不下等。可以说，目前还没有一家企业能正常稳定地运 行。原料药生产现状的改善以迫在眉睫。 1 2 3 ，2 紫杉醇制备面临的挑战 紫杉醇的工业生产主要面临两个方面的难题：一方面是紫杉醇资源问题， 即紫杉醇资源匮乏，红豆杉几乎是其唯一来源旧”】，寻找紫杉醇的资源是 目前研究的一大热点：另一方面是紫杉醇在原料中含量低且与其它在结构和 极性等方面极为相似的紫杉烷物质共存，使分离提取困难i ”。尽管紫杉醇的 化学全合成及半合成均己获得成功，但就临床供药而言，紫杉醇目前主要还 是依靠从红豆杉植物中提取 怕l 。 无论从天然资源或其它可再生资源出发，紫杉醇的规模制备均需要分离 和纯化，紫杉醇资源珍贵，价格高昂，制备的收率是紫杉酵成本最为关键的 因素。紫杉醇的制备原料具有如下特点：( 1 ) 紫杉醇的含量极低；( 2 ) 共存数百 至数万倍的杂质，其种类繁多、分子结构差异大、理化性质跨度大；( 3 ) 共存 多种活性成分类似物，其分子结构和理化性质与活性成分极为相近p i 。因而 紫杉醇的工业制各需解决两个关键技术：实现非紫杉烷类杂质与紫杉烷类化 合物分离，即非极性杂质和高极性杂质的去除，可称为前处理除杂技术：实 现紫杉醇与相近的其它紫杉烷类化合物的分离。前者所面临的挑战是首先要 除去数万倍的杂质，而这一过程中，若杂质中夹带微量的紫杉醇即带来整个 紫杉醇工艺的巨大损失。而后者面临的挑战则是能否获得高纯度的紫杉醇， 以及能否有效回收半合成原料。无论采用何种工艺路线，前处理技术都是首 先要解决的问题，是整个工艺的关键。在现有工艺中，紫杉醇的前处理除杂 损失高达2 0 3 0 ，且有机溶剂消耗量大，操作繁琐，成本较高，对其进行 系统优化无疑对显著提高紫杉醇的回收率有重要作用。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 1 2 4 研究的意义 紫杉醇规模制备技术的建立无疑对改善我国紫杉醇原料药产业现状发挥 积极作用。前处理除杂技术是实现规模制备的前提，目前该技术在国内尚未 进行系统化研究，对其进行较系统的优化研究对显著提高紫杉醇的回收率有 重要作用。使紫杉醇的损失降到最低，而且操作简单、方便的阿处理除杂技 术的建立对提高我国紫杉醇原料产业的制备水平具有积极的推动和促进作 用。 1 3 紫杉醇前处理技术研究概况 1 3 1 紫杉醇制备工艺的组成 根据紫杉提取物各组分在正相硅胶上的分布特点，如图1 3 所示，可将 其分为5 类： ( 1 ) 、紫杉醇系列化合物：包括紫杉醇、1 0 一去乙酰一7 表紫杉醇、7 表紫 一，扫展开方戽 高 极 - 性 杂 质 后 杂 紫 杉 醇 系 列 前 杂 非 极 性 杂 质 图1 3 紫杉提取物组分在正相硅胶上的分布如图 t l c 板：正相硅胶板( m e r k ) 展开剂：己烷一乙酸乙酯1 ：3 ；显色条件：1 0 硫 酸( 含5 香草醛) ，1 0 5 。c 杉醇、三尖杉宁碱和紫杉醇c ： ( 2 ) 、前杂：介于非极性杂质和紫杉醇系列化合物之间的低极性杂质， 哈尔滨工程大学硕士学位论文 能与紫杉醇一起同时在t l c 板上展开： ( 3 ) 、后杂：为介于高极性杂质和紫杉醇系列化合物之间的极性杂质， 其中含具有回收价值的1 0 一去乙酰基巴卡亭i i i 、9 一二氢乙酰基巴卡亭i 、1 0 一 去乙酰紫杉醇、1 0 一去乙酰三尖杉宁碱、】o 一去乙酰紫杉醇c 、1 。】3 - - - 乙酰基 一1 0 一去乙酰基巴卡亭i i i 等多种紫杉烷化合物。这类杂质能与紫杉醇一起同时 在t l c 板上展开： ( 4 ) 、以植物腊为代表的非极性杂质，位于t l c 板的前沿： ( 5 ) 、在正相硅胶板上无法展开的高极性杂质，其中含具有回收价值的 7 一木糖紫杉醇，位于t l c 板的原点； 根据紫杉提取物中组分的色谱性质、现有工艺的技术特点及其所揭示的 规律，我们将紫杉醇制备技术的组成确定为四部分：前处理除杂技术、色谱 分离技术、后处理除杂技术和化学转化技术。 1 、前处理除杂技术的作用是除去性质与紫杉醇相差较大的杂质，即上述 高极性杂质、非极性杂质及少部分的前杂： ：、色谱分离的作用在于实现紫杉醇系列化合物与前杂和后杂的分离以 及实现紫杉醇与紫杉醇类似物的分离。 3 、后处理除杂技术的作用是在进行色谱分离后，除去与紫杉醇共存的 其它紫杉烷化合物，提高结晶效率，使产品达到药典标准： 4 、化学转化技术是通过化学方法实现紫杉烷化合物向1 0 一去乙酰基巴卡 亨i i i 的定向转化，以利于资源的综合利用。 前处理除杂技术在紫杉醇制备工艺中占据举足轻重的位置，是现有各工 艺的重点。因为只有前处理过程中除去性质与紫杉醇相差较大的杂质后，才 能降低后续色谱的负荷并使色谱传质阻力得到改善，才能发挥或增强色谱分 离技术选择性的能力。前处理所涉及的技术可为传统技术，即萃取、沉淀、 结晶等，也可为色谱技术，以传统技术为佳。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 f i i ；| ；i i ；j i i i e i ，i i i i i i ；i i i e ；i i | j ；j _ 1 3 2 紫杉醇前处理技术研究概况 1 3 2 1 紫杉醇提取溶剂的的研究 目前从植物中提取紫杉醇常用甲醇、乙醇、甲醇一二氯甲烷( 1 ：1 ) 浸提， 但这一方法所得浸膏中杂质含量较高，因此在提取过程中，溶剂的选择对于 产物的质量具有重要影响。锅田宪助等7 i 对于紫杉醇的提取溶剂种类进行了 详细研究，结果表明：在乙酸乙酯、乙醚等溶剂中，以乙酸乙酯一丙酮( 1 ：1 ) 混和溶剂的提取效果最好，浸膏中紫杉醇的含量高达0 0 8 4 ，是甲醇提取所 得浸膏中紫杉醇含量的3 倍。也就是说用乙酸乙酯一丙酮( 1 ：1 ) 一次便可以使紫 杉醇提取量高于以往常用溶剂所能得到的量，为后序的分离纯化工作带来很 大的方便。加之乙酸乙酯一丙酮( 1 ：1 ) 与甲醇成本相当，因此，这一提取方法 的经济性和实用性较强。 提取过程中引入超声或微波技术，可大大缩短提取时间。k a s i t u 等l 8 1 采 用甲醇或乙醇作为提取溶剂，在6 0 6 c 条件下对红豆杉植物进行提取，所需时 间长达2 4 4 8 h ，在溶剂系统不变的情况下，采用微波技术，提取时间缩短到 1 0 r a i n 以内；采用超声技术，在2 0 3 0 c 条件下，所需提取时间仅为0 5 】h 。 x u 等l l g l 采用甲醇二氯甲烷( 9 5 ：5 ) 作提取溶剂，所需提取时间约为3 5 6 0 r a i n 。而将原料与溶剂的混和物进行超声振荡，提取达到平衡的时间缩短到 仅5 m i n 。超声或微波技术的引入。除可大大缩短提取时间外，还可以使提取 在低温下进行，从而避免了紫杉醇在高温下转化为其它物质而造成收率降低 1 2 0 l 。 13 22 紫杉醇前处理技术的研究 紫杉醇前处理除杂技术主要包括液一液萃取、固相萃取、沉淀法、超临界 流体萃取、树脂层析等方法，现将各方法的研究进展概述如下： ( 】) 液一液萃取法 液一液萃取通常分为非极性溶剂萃取、低极性溶剂萃取和碱液洗涤。对红 豆杉植物进行浸提后，所获浸膏通常用非极性或低极性溶剂进行分配萃取a 哈尔滨工程大学硕士学位论文 w a l l 等r t 对短叶红豆杉树皮的乙醇提取物用水和氯仿进行分配，由于红豆杉 树皮中紫杉醇的含量极低，约为0 0 0 7 ，为了寻找新的资源，w i t h e r u p 等1 2 i j 对6 种红豆杉属植物的针叶和树皮进行了分析，主要用二氯甲烷和水对提取 物进行分配，溶于二氯甲烷的部分用多种溶剂抽提，来进行初分离。 c a r d e l l i n a 2 2 】贝0 用多步溶剂抽提法达到初分离的目的。这种低极性溶剂萃取方 法的局限是过程中伴随紫杉醇的较大损失，因为体系中含有相当量的极性较 高的溶剂如甲醇、乙醇等，在除去的杂质相中仍有大量的紫杉醇，且此方法 需反复多次操作，有机溶剂消耗量大，污染环境。为了改善上述缺点，元英 进等3 1 用乙酸乙酯溶解紫杉醇浸膏后，再以碱溶液进行洗涤，除去大量杂质 的同时使紫杉醇几乎全部回收，此方法节约了溶剂用量，并减少了环境污染， 可用于生产。 ( 2 ) 固相萃取法( s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 由于植物中紫杉醇含量很低，且成分复杂，给提取工作造成很大困难， 简单的液一液萃取操作又常导致回收率低、分离效果差等问题。s p e 作为种 新型萃取方法，具有节省时间、降低溶剂用量、提高选择性和收率的优点。 s p e 实质是色谱分离方法( 前沿色谱) ，其主要是除去与紫杉醇极性相差较大 的杂质。所用填料主要有硅胶、氧化铝和c 】8 反相硅胶。陈振德等拉“以红豆 杉科榧属植物( t o r r e y a ) 的假种皮为原料，直接对乙醇提取物进行硅胶柱层 析，降低了制各紫杉醇的成本，扩大了其原料的来源，且保护了植物资源。 m a t h i n a i 驯提出了用c 1 8 固相提取法从粗提物中大量分离收集紫杉烷类化台 物并认为同上述的液一液分配相比较s p e 具有省时间和减少溶剂用量的优 点。但是在紫杉醇制备工艺中，液一液萃取法和固相萃取法多串联使用。由于 植物提取物中杂质含量数万倍于紫杉醇，若用s p e 直接处理提取物，将不仅 降低紫杉醇的处理量、加重填料的回收负荷、缩短填料的使用寿命，并且， 因传质阻力大，固定相对紫杉醇的吸附不彻底，会增大紫杉醇的损失。因此， 为了有效的克服s p e 的这些缺点，通常的做法是将液一液萃取法置于固相萃 哈尔滨工程大学硕士学位论文 r a o取法之前。等【2 1 “l 将紫杉醇提物经氯仿萃取后，再用反相c l8 柱对紫杉 醇等紫杉烷类化合物进行富集，达到了很好的效果。但反相c 18 填料价格昂 贵，易受原料中杂质污染而导致其使用受命缩短，实际生产难以接受。陈建 民等i ，j 利用种植的红豆杉技叶经乙醇提取后，用1 ：1 乙酸丁酯和水分散萃 取得到l 紫杉醇粗原料，再经常压正相硅胶柱层析，以乙酸乙酯和环己烷 梯度淋洗，对紫杉醇进行富集，建立了一条工艺简单、成本低的前处理路线。 从目前文献报道情况来看，高速逆流色谱( h s c c c ) 有望成为一种新的大 规模制备生产紫杉醇的方法1 2 81 9 1 与常规的柱色谱比较h s c c c 具有较高的 样品负载量、分离周期短、操作简便等优点，并且避免了分离样品与固体表 面产生化学反应而变性和不可逆吸附造成的样品损失。最近k e t c h u m 等”j 在 研究红豆杉细胞的水溶性培养液中紫杉烷的分离时发现，在用0 2 l m 的尼龙 或p v d f 膜过滤水溶性培养液时，这些膜对紫杉烷有拦截作用。大部分或几乎 所有紫杉烷被收集在膜上，再用一定比例的甲醇或乙醇水溶液洗脱就能使这 些紫杉烷通过滤膜。该方法可省去用溶剂分步提取或液一液分配萃取这一步， 并能节省大量溶剂，也减少了氯代烷对环境的污染。 ( 3 ) 沉淀法 紫杉醇在己烷溶液中能产生沉淀，这个性质可用来提取紫杉醇。l - l o n g 等 口】l 用有机溶剂浸取植物体以后，所得粗提液用合成的吸附剂来进行处理，最 后向滤液中加入己烷就可得到紫杉醇沉淀。p a n d e y 等1 3 2 1 也采用了类似的方法， 将紫杉醇粗提物用醇、丙酮等极性溶剂溶解，通过添加已烷、石油醚或轻汽 油等非极性溶剂将紫杉醇沉淀析