（微生物学专业论文）硅酸盐细菌胞外多糖及其发酵条件的初步研究.pdf

独创性声明 本人声明所翌交的论文是我个人在导师指导下避行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，狳了文中特剐加以橱注和致谖l 姻地方外，沧文中不包含其他人已经发袭或撰 写过的研究成粜， 照不包含为获褥沈闭农业大学或其它教育梳构鲶学位或诞书两馒瘸过 的材料。与浅一闻工俦的同志对零辑究所骰的任何贡献均已在论文中 乍了明确的浇明并 表示了谢意。 研究生签名：誊熵 露搏签名： 对翔；2 蟛年善月2 翔 时潮：年月 鞠 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知谈产权为沈阳农她大学所有。本入完全了解沈阳农业大学蠢关傺蓊、使 用学位论文的规定，即：学校有救缳馨送交论文的复印 串稻磁盘，允许论文被褒阙和倦 阕，可以采用彩印、缩印或扫擒等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农渡大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中静鼹有内容不经沈阳农业大学授权不得戬任侮方式擅是对外发表。 ( 保密的学像论文在解密质废遵守此协议) 研究生签名：罨巍南 时间：o 嬲年占月爻弱 时间： o 耐年角童醴 沈女l 农业火学硕七学位论文 摘要 多糖怒一类由广泛存在予融然弊的生物体产曼| 三的独特的生物大分子。它们具有各种 各样特殊的且在大多数情况下榻警复杂豹化学绣构，不同的生理功麓霸广泛的( 潜在的) 皮羽价值。本论文怼碱酸盐细菌鹣臌外多穗进行了分离缝优，并襁步研究了葵耱基缀成。 傻溺紫矫线对醚陵盐细菌遂褥诱变处理，利霜乎板季露缔，摇瓶复簿，最终获得聪辨多糖 高产菌株u v _ 2 3 。对其摇瓶发酵培养基和摇瓶发释条件进抒了优化，摄禽了硅酸盐细菌 胞外多糖的产爨。 硅酸蘸细菌经过摇瓶臻养后，莱捌碱握醇沉涪褥到糠多糖，粮多糖经紫外光谱分析 不舍孩酸翻餐囱矮，再经d e a e + 纾维索离子交换棱瑟轿纯纯褥到缝多糖，采臻s e 妯a d e x g 。l o o 凝胶柱层柝和醋酸纤维薄膜电泳对纯多糖进幸亍纯度检验，结采表明纯多糖为单一 缎分，然厝采朋化学法对纯多糖的糖基组成避行分桥，结采表明硅酸热细菌胞外多糖含 有耱醛酸，不含有氨基己糖和硫酸取代基。 幂噩髑孢予热处理泫对硅酸簸细藏避行缝纯，选择多糖发酵往能较好的7 号菌株彳乍为 诱交出发菌株，摇瓶多糖产量为o 5 l g ，l 。然后对出发菌株进行紫终线诱交处理，经过 乎板初筛和摇瓶复筛，最终获得多糖离产藏株u v 一2 3 ，产量达翔o 5 9 l ，愚国发菰栋 的1 1 6 倍。 通避单豳索试验和均匀设计馕他，确定u v _ 2 3 萤椿的最佳发酵培养基配方为：蔗 糖1 、蕊酸铰o 3 、c lo 0 6 、n a 2 h p 。4o 1 、m g s 强7 珏2 0o 0 9 、酵母膏o 0 8 、 c 0 3o 3 3 ，按优化后的培养蒸进行摇瓶发酵试验，多糖产量为2 2 5 9 l 。 雀单嗣索试验的纂确上，采用响应禹分析方法对发释培养的初始d h 、装液量和温 度遂幸亍优化，优选彳葶到较佳酶摇瓶发酵工艺条传：初始赫1 7 8 、装液鳖8 0 m “2 5 0 m l ， 发簿培养温度3 9 5 ，摇糕发懿产爨为3 。7 3 9 龙。 关键词：礁酸赫缁菌；膝外多糖；紫外诱变；优纯 a b s t r a c t a b s t | a c t p o l y s a c 棘甜i d ei su n i q u # b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l em a ti sp r o d u c e db yt h eo r g a n i s m s e x i s t i n g 主nt h en a t u r a 呈w o r l d 1 h e yh a v oas p e c i a la n di nm o s tc a s e sv e r yc o m p l e xc h e m i e a l s t n l c t u r e s ，d i 仃e r e m 曲y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n de x t e n s i v e ( p o t e n t i a l ) 拄p p l i c a t i o nv a | u e 轴 诹i s t h e 苗s ， 也e s e p a r a t i o f l ，p u r 壕c a t i o n a n dt h e s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c so f e x o 巾o l y s a c c h a f i d e s f 沁mb 醅c 掰辫埔棵e i 昭衙o s 淞i s s t u d i e d u s i n gu v 斑d i a t i o nt r e a t b 盘c 川。蝤m “c j 姆f 扎d s “s ，矗n a l l yo b t a i nt h eh i g h - y i e l ds t r a i no fp o l y s a c c h a 畦d e a 盎e rt h e c o n d i t i o n so ff b l 椎l e n t a t i o na n df c r f n e n t a t i o nm e d i ai s o p t i m 掘犯d ， m ep r o d u e t 主o no f p o l y s a e c h a r i d ei se n h a n c e d c r u d ep o i y s a c c h a r i d ei se x t r a c t e ds e p a r a t e l yf r o m 曰球c f 盯埘m 甜c f 豫g f 玎黜螂a n dp 曲矗e d b yi n 呻x c h a n g i n gc h r o m a t o 酽a p h yo nd e a e c e l l u l o s ec o i u m n s 。p a s s i n gu 玲a v i o l e ts p e c t r u m ， c r u d ep o l y s a c c h a r i d ed o e sn o tc o n t a i nt h ep t e i na n dn u c l e i c8 c i d i ti sp r o v e dt ob e 圭1 0 m o g e n o u sc o m p o s i t i o nb yc h r o m a t o g r a p h yo ns e 曲a d e xg - i c o l u m na n de e l l u i o s e a c e t a t em e m b f a n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c a m 嚣) a n dt 量l e nt h r o u 曲也ec h e m i cm e 壤o d ，m er e s u l t i n 文e 鑫t c d 斑a t 也ep u r ep o l y s c h a r i d ei se o n t 8 i nu r o n i ca c i da l l dn 文c o n t a i n 擞n i n os u g a ra n d s 0 d 2 t h e 蹄o r e so f 曰盘c f 甜淞m 淞f 趣g 砌o s 瑚i s 溉毪t 。db yh e a ta n dc h o o s et h e7 t hs t 蹦na s o r i g i 戚s t r a i nt h a tp r o d u c 垃o no fp o i y s a c c h a 西d ei s b e t t e r w h e 靛t k7 t hs 枉破l 轴sm u t a t e db y u vr a d i a t i o n ，h i g h - y i e l ds t f a i nu v * 2 3i so b t a i n e d 1 j h 勺u g hf e r m e n t a t i o n ，t h ep r o d u c t i o no f p o l y s a c 曲蕊d ei so 5 9 9 甩w i ms t a b l ep r o d u c t i o nc a p 如i l i t ya n di ti s1 1 6t i m e so fo 鞋g i n a l s t r a i n 1 孙o u 曲s i n g l e f a c t o ra n du n i f o 瑚d e s i g ne x p e f i m e 嫩a t i o n ，t h eb e s tf e 勰e n t a t i o nm e d i a o fs 投a i nu 2 3i si d e n 棘f i e d n l 鑫ti s ：s r o s e1 ，a 越m o 壬l i u ms u i 最t eo 。3 ，p o t a s s i 韭m c h l o r i d eo 0 6 ，s o d i 啪p h o s p h a 健d i b a s i co 1 ，m a g n e s i u 嫩s u l 蠡l t eo 0 9 ，y e a s te x t r a c t o 0 8 ，c a l c i u mc a r b o n a t eo 3 3 a c c o 斌n gt ot h em e d i aa f t e ro p t i m i z a t i o n ，t h ep r o 曲c t i o n o f p o l y s a c c h a f i d er e a c h e d2 2 5 9 忍 a c c o r d i n gt os i n g l 静角c t o re x p e r i m e n t a lr e s u l ta n dn s i n gt h em e t h o do fr e s p o n s es 氍纽c e a n a l y s i so p t i m i z e 也ee o n d i t i o n so ff 色m l e n t a t i o no fs t r a i nu v - 2 3t h a t o b t a i nt h eb e s t 惫r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni s ：i n i t i 越p h7 8 ，t l 艟v o l 黼eo fi i q u i d8 0 m b ，2 5 0 搬l 把娃巾e r a 撼r e3 9 5 d e 擎e e c e l s i u s a e c o r d i n gt o 搬oc o n d i t 至o na 矗e ro p t i m i z a t i o n ，也e p r o d u c t i o n o f p o l y s a c c h a r i d er e a c h e d3 。7 3 9 l k e y w o r d ：勘c 脚淞m 弹c 豫跏邪瓣；e x o p o l y s a c c h a r i d e ； u l t r a v l o l e l 激u t a g e 娃e s i s ； o p t i m i z a t i o n 2 沈川柑i k 人学硼卜学化沦文 刖茜 多糖是最早被人们认以的生物人分f 化台物，1 9 纪术，山于它的研究直接推动 了微生物学和化学的发胜。但部之肝，人们埘多糖均必趣迅速减弱将目光投向蛋白质 利核酸的领域。5 0 r 来笑j 。多栅的训 究i ! l 处在畿i j 赝利核酸的光环之外，有“扶姑娘” 之称。多糖结构的复杂性是多莉研究的一1 二翌【；_ ；醋，但是从另一个方面柬说，f 是多糖这 种结构的复杂性决定了多糖复杂多样的生物功能和良好的生物活陛。近2 0 年来分子生 物学等新的生物技术的发展使人们对多糖的了解愈束愈深，关于多糖的化学、生物学研 究已成为本世纪一个非常有诱惑力蛇n 口沿领域。 1 多糖的生理功能 近年来多( 寡) 糖的增强免疫功能、抗癌、抗辐射、抗炎、降血糖等生理活性受到 广泛的重视。糠链作为细胞识别的分子机制和细胞分化标志的结构基础，在某些细胞中， 例如肿瘤细胞的逆转分化过程起重要作用。目前，灵芝、茯苓及香菇多糖注射液已被广 泛用于临床治疗各种肿瘤，牛膝寡糖作为免疫埔强剂被深入研究。植物生理学研究表明， 许多游离的寡糖分子具有重要的生物功能，它们在极微量( l 时为氨慕薅萄糖。 表1 1 氨基己糖测定结粜 t a b 1 - lr e s u l to f a m l n os u g a 由表1 1 历示的结果可知，样品中不合有氨基己糖。 2 5 2 己糖醛酸分孝斤缩采 大多数多糖含有己糖醛酸，测定己糖醛酸所用方法包括咔穗法和地衣酚法，咔矬法 的原理在于样品中的己糖醛酸在浓硫酸作用下形成生色原，后者定薰迪与咔唑呈色；地 衣酚法中，襻品所含的己糖醛酸缀反应液中盐骏作用优先脱羧，生成都戊糖一致的生色 原，后者定量地与地衣酚呈色。多糖样品通过咔唑法和地衣酚法测定，即可分别求出篡 中己糖醛酸相当予葡萄游醛酸的含量，以c 代表咔唑法测得值，以o 表示迪衣酚法测 得德，c o 比僵很易求得。 1 2 l o 8 罾o 6 。 o 4 0 2 0 o 1o 20 。30 40 。5 1 1 a 浓度( m g e l l ) 圈l 葛眯唑法标准曲线 f 嘻l - 5s t a n d a 州c u r v e 矸c 矗丙8 砷l em e t h o d 流辫1 农灶大学颈士学德论文 3 2 - 5 2 蓍l ，g l 。，5 0 oo 。lo 20 3o 4o s h 矗浓度( m g 煎) 鳝l 地袭酚法标准髓线 辩g 。l 巧s t 8 n d 8 r dc u r v e 祥。牲 # 硝m “h o d 表l o 透明旗酸测定结榘 + h b 1 - 2r e 3 u 强o f h a 麓= = ： e 擅。俊毽 竺竺茏c 0 n c e n t 蹦 舶o f 辩aa v e r a g eo t 删 趣lo 2 l o 。4 70 。4 3 o ，2 o - 3 o 4 o 。4 0 o 6 0 o ，7 7 1 1 8 j 5 l 2 0 8 o 5o ，9 42 ，2 8 o 4 l 袭l - 3 样靛涮定结巢 h b 1 0r 璐n 摊o f s a m p l 棼 嚣。 e 德。值 c ，o 饿 羔嚣羡 s a m n l ea v e r a g e0 lo u 1o i 4 o 2 8o 4 9 2 o ，2 2o 4 s o o 4 。 30 2 0 o 5 9o 3 4 4 0 1 4o ，4 8 o 2 9 国表 矗和表1 3 可知，栉燕的c ，o 平均簸与透鞠痰酸豹c ，o 平均簇裉接邋，因此 可以初步推断样品中含寄己糖歉羧。 2 ，5 3 硫酸熬测定结果 有些多糖含有硫酸萋，测餍盐酸承群法，硫彀基可与无枫锁离子反应并在含瞳睃的 溶波中缣持懋浊状态， 浊测定表明戴悉浊滚的光吸收与硫酸基呈线憾关系，由此测褥 硫酸蒸含量。 挣0 船菩! o 0 o 第一童硅酸盐缁蔼脆外多糖的分离纯化 趔 0 3 5 0 。3 o 2 5 0 2 0 。1 5 o 1 o 0 5 o 02 44 87 29 81 2 0 硫酸钾浓度( ug m l ) 匿l 一硫酸麓栎准馥线 f 酶1 7s 拇n d a r dc u r v eo f 岱o f 2 寝l o 碱馥基测定缝巢 弧h 1 0r e s u 轻o f s o d 2 由表l ，4 可知，硫酸基的测定结果为负值，说明样品中不含肖硫酸基。 3 结论与讨论 3 j 结论 1 ) 硅酸赫缁菌豹腿终多耱经紫辨光港、波楣色谱、毫泳鉴定为擎组分。 2 ) 硅羧盐缨藏的熙外多糖经化学方法分孝居表明，其禽有己糖醛酸，不含骞氨鏊己 糖和硫酸基。 3 2 莒孪论 1