（水产养殖专业论文）鲤遗传连锁图谱构建及耐低温性状相关标记的筛选.pdf

上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰弓，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者姥刍阋狍 日强汐6 局叼日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意! 学校保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密 口 学位论文作者签名：为) 砜移 日期渺年铂。7 日 指导撕签名船。l 勘主 日期：o 却，晖6 月，。日 i j 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 严云勤东北农业大学教授 。 答辩主席 梁利群黑龙江水产研究所研究员委员 孙效文黑龙江所产研究所研究员委员 石连玉黑龙江所产研究所研究员委员 尹家胜黑龙江所产研究所研究员委员 徐奇友黑龙江所产研究所研究员委员 王炳谦黑龙江所产研究所研究员委员 徐伟黑龙江所产研究所研究员委员 卢彤妍黑龙江所产研究所研究员委员 刘伟黑龙江所产研究所研究员委员 答辩地点黑龙江所产研究所答辩日期2 0 1 0 - 6 - 11 ffffffffjjfffjijiijij 上海海洋j v f - 硕士：挲键论文 鲤遗传连锁图谱构建及耐低温性状相关标记的筛选 摘要 基因组图谱的构建是深入开展各生物种类的分子生物学和基因组学研究的基： 础，如数量性状位点定位、标记辅助选择育种、杂交优势预测、基因组进化等等， 因此遗传图谱的构建通过对基因组进行系统性研究，是动植物遗传育种和人类遗 传疾病诊断和治疗的依据。耐低温性状作为鱼类的一种重要的经济性状? 研究鱼 类对环境温度适应问题对阐黾目鱼类温度适应机制、生物进化、自然选择等原理具 有重要的意义。 本文以荷包红鲤抗寒品系( 8 ) 和云南大头鲤( 早) 为祖父母本所培育的1 l o 个f 2 个体为作图群体，主要利用荧光扩增片段长度多态性( f l u o r e s c e n ta m p l i f i c a t i o n 好a g m e ml e n g t hp o l y m o r p h i s m ，f a f l p ) 分子标记和少量的e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g ，e s t ) 标记，通过o n e m a p 作图软件的远交全同胞家系模型构建了鲤遗传连 锁图谱；此外，将e s t 标记与鲤耐低温性状进行了相关性分析和定位研究，通过 分析e s t 标记的遗传信息进一步对鲤耐低温性状进行探讨。具体研究结果如下： 1 ，分子标记的开发 用经过筛选的3 0 对a f l p 引物组合，对亲本和作图群体1 1 0 个个体中进行 a f l p 分析，结果显示：共产生清晰的f a f l p 标记1 5 1 3 个，其中多态性标记9 1 1 个，多态性比例为6 0 2 ；平均每对组合产生5 0 4 个标记，多态性标记3 0 4 个。 卡方检验( p o 0 5 ) 显示，在子代中符合孟德尔遗传规律的有6 2 7 个( 包括3 ：l 和1 ：1 ) ，轻微偏分离标记2 8 4 个( o 0 5 d 0 0 4 ) 。 选取鲤脑c d n a 文库获得低温诱导表达的3 5 0 个基因序列，通过根据e s t 宁 列非翻译区( u t r ) 设计6 4 对e s t 引物，其中3 5 对获得清晰的扩增条带，含有 多态性引物1 2 对，其中有9 个符合l ：2 ：1 分离，3 个符合1 ：1 分离。 2 ：鲤遗传连锁图谱的构建 对含有多态性的9 1 1 个f a f l p 分子标记和1 2 个e s t 标记进行连锁分析，绘 制了鲤鱼遗传连锁图普。鲤鱼连锁图谱的框架图共含有2 4 6 个分子标记，其中有 2 3 8 个f a f l p 标记和8 个e s t 标记，分布在5 0 个连锁群上，连锁群长度从2 0 1c m 到4 3 7 4 6c m ，总图距为2 8 7 6 6 4 c m ，标记间平均间距为1 4 6 8 c m ，图谱覆盖率为 6 6 5 6 。 上海海洋大学硕七学位论文 3 。e s t 标记的相关分析和的定位研究 。 在鲤遗传连锁图谱中，将8 个e s t 标记分别连锁定位到6 个连锁群，通过 s p s s 的g l m 程序对标记与性状相关性检验得知，标记c c 0 0 9ip o 0 5 ) 与标记 c c l1 5 ( 尸 0 0 5 ) s h o w st h a t i nt h eo f f s p r i n gw i t hm e n d e l i a nh a 、7 e6 2 7 ( i n c l u d i n g3 ：1a n d1 ：1 ) ，2 8 4m a r k e rs e g r e g a t i o n ( o 0 5 p 0 0 4 ) i i i 上海海洋大学硕士学位论文 s e l e c t e d350l o w t e m p e r a t u r ei n d u c e dg e n e si nt h ec a r pb r a i nc d i , i al i b r a r ya n d d e s i g n e d6 4 ；p f i i r so f e s tp r i m e rb y e s ts e q u e n c e sb a s e du n t r a n s l a t e dr e g i o n ( u t r ) ，i n w h i c h35p a i r sw e r ec l e a r l ya m p l i f i e db a n d s ，p o l y m o r p h i cp r i m e r sc o n t a i n i n g12p a i r s ， 9o fw h i c hm e e tt h e1 ：2 ；1s e p a r a t i o n , 3s e g r e g a t i n g1 ：1 、，j 、一 j 2 g e n e t i cl i n k a g em a p p i n go fc o m m o nc a r p t h er e s u l t ss h o w e dt h a tat o t a lo f1513f a f l pb a n d sw e r ep r o d u c e di n1 10f 2 i n d i v i d u a l s ! i nw h i c h91 + 1w e r ep o l y m o r p h i ci n a r k e r s ，b e s i d e s ，12p o l y m o r p h i ce s t m a r k e r sw e r ed e v e l o p e d ，f i n a l l y , 9 2 3m a r k e r sw e r eu s e dt oc o n s t r u c tt h eg e n e t i cl i n k a g e m a p t h ef r a m e w o r ko fg e n e t i cl i n k a g em a pc o n s i s t e do f2 3 8f a f l pm a r k e r sa n d8 e s tm a r k e r si n5 0l i n k a g eg r o u p s s p a n n i n g2 8 7 6 6 4 c mw i t l la v e r a g ei n t e r v a l14 6 8 c m a n dt h em a pc o v e r a g ei s6 6 5 6 3 c o r r e l a t e da n dl o c a t e da n a l ) ，s i so fe s tm a r k e r t h er e s u l t ss h o w e d ：8m a r k e r sw e r el i n k e dt os i xl i n k a g eg r o u ps e p a r a t e l 3 ，i nt h e g e n e t i cl i n k a g em a po fc o l i i i n o nc a r p ，w h i c h m a r k e rc c 115w a sa n dl o c a t e do nt h e l i n k a g eg r o u l 5a n dc c 0 0 9w a sl o c a t e do n3 8l i n k a g eg r o u p t h em a r k e rc c 0 0 9 ( p 1 0 0 0 ) 的s n p 分型项目。3 ) i l l u m i n as n p 芯片技术平台，主要针对大量s n p 位点( 上千至覆盖全基因组的几十万个) 分型 的项目。既可以根据客户要求定制芯片( g o l d e n g a t e t m 芯片) ，也可以直接提供 预制好的全基因组芯片。 1 2 4 表达序列标记( e s t s ) e s t 是从一个随机选择的c d n a 克隆进行5 端和3 端单一次测序获得的短 的c d n a 部分序列，代表一个完整基因的一小部分，一般长2 0 0 4 0 0 个核苷酸对。 _ 个全长的c d n a 分子可以有许多个e s t ，但特定的e s t 有时可以代表某个特定 的c d n a 分子。两端有重叠的共有序列的e s t 可以组装成一个叠连群( c o m i g ) ， 直到装配成全长的c d n a 序列，这样就等于是克隆了一个基因的编码序列。将 e s t 定位在基因组，也可作为基因组作图时的种标记序列。 e s t 作为表达基因所在区域的分子标签因编码d n a 序列高度保守而具有自身 的特殊性质，与来自非表达序列的标记( 如a f l p 、r a p d 、s s r 等) 相比更可能 穿越家系与种的限制。因此，e s t 标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁 图和比较各种重要性状信息是特别有用。同样，对于个d n a 序列缺乏的目标物 上海海洋入学硕士学位论文 种，来源于其他物种的e s t 也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相 关信息的迅速转化。具体说，e s t 的作用表现在：( 1 ) 用于构建基因组的遗传 图谱与物理图谱；( 2 ) 作为探针用于放射性杂交；( 3 ) 用于定位克隆；( 4 ) 借 以寻找新的基因；( 5 ) 作为分子标记；( 6 ) 用于研究生物群体多态性；( 7 ) 用 于研究基因的功能；( 8 ) 有助于药物的开发、品种的改良；( 9 ) 促进基因芯片 的发展等方面。正是因为e s t 表现出了这些巨大潜能，使其得到了充分的利用与 发展。 1 3 鱼类耐低温研究现状 鱼类对环境温度适应问题的研究，一方面，对阐明生物进化、自然选择等原 理具有重要的理论意义；另一方面，对进行遗传改良和定向培育品种也具有重要 的现实意义，因而受到生态学家、分类学家、遗传育种学家和的普遍重视。作为 变温动物，外界环境对鱼类的影响决定着其能否生存及其生存的适应状况。在自 然条件下，温度是决定鱼类地域分布的主要限制因子低温胁迫常使得一些源于热 带、亚热带水域的鱼类如鲮鱼c i r r h i n am o l i t o r e l t a ，罗非鱼o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s 等因其冷敏感性而无法在温带以北地区水域安全越冬。近年来，随着分子生物学 及相关交叉学科的飞速发展，对鱼类如何适应外界环境变化的相关研究已经取得 了大量成果。同时，形态学、生物化学、生态学、细胞遗传学及分子遗传学等学 科在探讨鱼类适应环境温度的机理方面，也取得了若干新的进展。 1 3 1 生物化学方面 当动物机体受到低温胁迫时，体温和新陈代谢活动都下降，体液粘滞性显著 增加，体液流速减慢。动物机体可以调节体内一系列生理生化反应来抵御低温对 机体所造成的损伤，生活在极度寒冷水域的冰鱼( i c ef i s h ) ，唯一没有血红蛋白的 脊椎动物，引起了人们的广泛注意。由此，提出了血红蛋白含量和鱼类低温适应 存在一定关联的假说。目前认为，低温时，较低的新陈代谢活动和水中较高的溶 解氧使鱼类通过降低红细胞比容( h e m a t o c r i t ) 和血红蛋白含量，缓解体液粘滞性 压力，从而维持机体正常的生命活动。l u c ab a r g e l l o n i 等【55 j 对n o t o t h e n i o i d s ( 冰 鱼的近缘种) 的6 个种群的血红蛋白及其基因的含量、结构等进行了研究，表明 随着鱼类栖息环境( 主要是温度差异) 的不同，血红蛋白结构及其功能逐渐由复 杂到简单，甚至丧失( 极端情况，如冰鱼) ，从分子水平验证了此假说的合理性和 正确性。另外，李仁德等1 5 6 j 对蜥蜴不同温度时血红蛋白含量进行了检测分析，同 上海海洋大学硕_ ：- - - 7 ” - 位论文 样证实随着体温和新陈代谢活动的下降，血红蛋白浓度也相应降低。水温的变化 速率及持续的时间长短是决定鱼类能否存活的重要因素。常玉梅等对荷包红鲤抗 寒品系( c y p c a r p i o ，) 与大头鲤( c y p p e l l e g r i v ip e l l e 守 i n iy c h a n g ) 种间杂交f 2 共 8 5 尾进行低温胁迫实验，并观察了血液及血清生化指标在降温过程中的变化，发 现变化明显的指标基本都与p i l e 的变化密切关联。血液学指标表明p i l e 变化最明 显，p h e 稳态的打破，必然引起其它相关因子的变化。p e r r ye ta 1 认为1 5 ，快速氧 合的h g b ，会释放出大量的波尔质子( b o h rp r o t o n s ) ，促使h c 0 3 发生脱氢反应， 所以氧合的血液流经鱼鳃时，会提高c 0 2 的排出速率。c 0 2 排出率提高，p c 0 2 随 之下降所以p i l e ，卜升。另外? p h e 的变化也会引起血液离子浓度发生一定的变 化【5 8 棚】。t a y l o re ta l 6 0 】认为，动物通过对新环境的一段时期的驯化，普遍存在生化 过程的温度补偿策略。其中，p i l e 由于对内在的生理生化过程的温度变化十分敏感， 而且与温度呈负相关( - o 0 1 6 o 0 1 9 u 。) ，所以p h e 是细胞间代谢的一个非常重 要的调节因子。 低温胁迫也破坏了实验鱼血清离子的稳态。水温从1 6 快变至4 时，血清 n a + 、c l 。和c a 2 + 发生明显变化，其中n a + 和c a 2 + 含量明显下降。g a n i me ta l 认为， 鱼类为了提高在低温环境下的生存能力，通常会采取降低c a 2 + 的渗透性，以维护 一些重要器官如心脏，大脑等的离子稳态【6 。而p h e 的变化必会引起n r 浓度发 生波动。b u r t o n 曾报道，在特定的温度下，硬骨鱼类，两栖类和爬行类的正常p h e 与血浆n a + 浓度呈负相关，并且认为它们在保持p h e n a + 稳态的作用机制也十分相 似，这种稳态的存在是为了保证细胞表面某些特定分子的正常功能【5 乳拶j 。 1 3 2 细胞生物学方面 细胞膜主要由脂类、蛋白质和一些碳水化合物组成。因此，膜的结构、功能 和性质也决定于这些组分的种类、结构及相互间的作用。膜系统为了适应外界环 境的温度变化调整自身组成成分的含量，从而保持其低温稳定性( c r y o s t a b i l i t y ) 和流动性( f l u i d i t y ) 。目前，植物抗寒性研究取得了十分可喜的成绩。其中，l y o n s 6 2 1 提出的“膜脂相变”学说为解决植物抗寒性问题提供了一条研究途径。该学说认为膜 脂不饱和脂肪酸含量高，膜的相变温度就低。因此可以通过操纵脂肪酸脱饱和反 应来改善植物抗寒性。动物、植物和真菌等的膜腊包含有特定组成的脂肪酸，而 其不饱和脂肪酸就是由催化不同脱饱和反应的脱饱和酶所控制。因此，脂肪酸脱 饱和酶在控制生物膜的生物形成和物理性质，调节膜脂脂肪酸组成与不饱和程度 等方面起着关键作用。在鱼类研究方面，f a r k a s 6 3 j 的实验证实，鱼的脂肪酸代谢对 体温降低的适应很敏感，这种脂质代谢变化的结果使得磷脂中长链不饱和脂肪酸 ( 特别是d h a ) 的积累，由于长链不饱和脂肪酸主要影响膜的流动性，可以认为 上海海洋j j ：学硕士! 学位论文 这种反映是膜流动性对于温度适应的表现。h a z e lj r 6 4 】在他的实验中发现，当温度 骤降时，虹鳟o n c o r h y n c h u sm y k i s s 体内脂肪生成过程中，不饱和脂肪酸比例升高。 id e y 等1 6 纠通过对海水和淡水鱼肝脏磷脂膜的分子结构研究发现，冷驯化鱼类( 5 1 0 ) 比暖驯化鱼类( 2 5 2 7 ) 含有较高的多不饱和脂肪酸，但长链多不饱和脂肪 酸d h a 似乎并不参与低温适应过程，而单不饱和脂肪酸油酸( 18 ：1 ) 在低温条 件下含量增高。cb u d a 等【6 6 j 于次年研究鲤鱼冬季( 5 ) 和夏季( 2 3 2 5 ) 脑细 胞膜的组成成分变化时，发现冬季鱼体内不饱和脂肪酸( 主要是花生四烯酸和 d h a ) 含量升高。c o s s i n sa r 6 7 - 6 s 也证明了不饱和脂肪酸在鲤鱼冷诱导抗寒过程中 的重要性。目前，人们通过基冈工程手段迸一步证明了这类脱饱和酶基因的直接 功能。上述研究表明，鱼类的脂肪酸代谢对体温降低的适应很敏感。通过积累磷 脂中长链不饱和脂肪酸的含量，使膜在低温胁迫时仍保持稳定性和流动性，从而 提高自身的抗寒能力。 1 3 3 神经系统与内分泌方面 动物机体在冷暴露条件下保持其内环境的稳定，是机体自主神经、内分泌、 代谢和行为统一调控的结果【69 | 。冷暴露作为应激源之一，能够引起动物机体产生 应激反应，在应激反应中，交感一肾上腺髓质轴和下丘脑腺垂体甲状腺轴起着重 要作用。同时，其他内分泌活动也会发生相应改变。 目前，冷暴露对哺乳动物甲状腺激素变化的影响，已有较多报道。在鱼类方 面，甲状腺激素对鱼类代谢活动、生殖、胚胎发育、仔鱼生长、变态及其存活等 方面均有报道【7 啦7 1j ，但有关甲状腺激素对鱼类低温胁追时的代谢补偿研究，报道 较少。v a nd e nb u r ge h 等【72 j 检测了鲤鱼在冷暴露时的激素变化，他的研究表明 t 4 随着冷暴露时间的延长，含量显著增高，而t 3 含量不受外界温度变化的影响。 肾上腺髓质相当于一个交感神经节，其分泌的肾上腺髓质激素与交感神经系统 构成交感肾上腺髓质系统，使机体能产生“应急反应”。当机体处于畏惧、严重焦 虑、暴冷暴热和乏氧窒息等特殊紧急情况时，这些刺激通过中枢神经系统，立即 调动起交感一肾上腺髓质系统的活动。其总义在于增加心率和心缩力，使心输出量 增加；在冷环境中，肾上腺素可增加产热。 在鱼类研究方面，a h oe 等【n3 j 谬i 定了虹鳟在4 c 和l7 时，肾上腺素存在与 否情况下，其心率变化水平。他的研究结果表明，低温时肾上腺素使心率加速， 通过提高b 肾上腺素能的活性来适应低温环境。 为了阐明神经系统与环境温度之间的关系，以及在适应环境温度的过程中神 经系统的作用等问题，b a s l o w 和n i 笋e l l i 7 4 j 比较热带生物和喜冷生物的某些特异性 酶对温度变化的不稳定性程度，发现热带鱼的脑a c h e 比喜冷鱼的脑a c h e 对热具 上海海洋大学硕士学位论文 有较大的稳定性和对冷的不稳定性。b a l d y , t i n 和h o c h a c n , z a 7 5 】研究硬头鳟( s a l m o g a i r d n e r i i ) 脑a c h e 在对温度适应期间的动力学时注意到，该酶可以两种截然不 同的形式存在。长时期适应于1 7 v 水温的鱼中，出现这种酶的“温暖”变异体； 而适应于2 水温之后则出现这种酶的“寒冷”变异体。在较适温度区内( 1 2 ) ， 两种形式可同时存在。实验证明，该鱼的脑a c h e 变异体的k m 值是由环境温度决 定的。对于喜冷性鱼类南极鱼( t r e m a t o m u sb o r c h g r e v i n k i ) 来说，a c h e 与底物结 合的能力就只限于低温区内( 0 左右) ，当温度高于0 v 以上时，该酶的活力下降， 在7 左右时即失活而导致死亡。由于它是决定这种鱼存活的温度上限条件，所以 人们把a c h e 称为临界脯酶【7 引。但是对于“喜暖”定湿性鱼类鲮鱼( c i r r h i n u s m o l i t o r e l l a ) 来说，脑a c h e 的活力特性恰好相反。随着水温的下降，酶的活力相 应地下降，到了临界温度( 7 c ) 时，酶的活力丧失，鱼体出现冷休克，最后导致 死亡。显然，温度降低，机体死亡是与鱼脑a c h e 活力显著下降有关的。 1 3 4 酶促动力学方面 低温时，酶分子的多种形式( 同工酶) 和蛋白质的多态性的表达可能与生物 对环境温度的适应有关7 7 1 。b r o w n 7 8 1 在研究葡萄糖代谢时发现，鲤鱼同时开放两 条代谢途径，他认为适应性可能包含着葡萄糖降解途径的转换。在温度下降至鱼 冷休克期间l d h 同工酶活性升高，特别是肝l d h 同工酶活性都升高。p e t e ra 等 【7 9 j 为了阐明酶对极冷温度的适应，对n o t o t h e n i o i d s ( 1 8 6 l ) 和s o u t ha m e r i c a n n o t o t h e n i o i d s ( 4 1 0 ) 的乳酸脱氢酶( l d h ) 动力学特性( 米氏常数k r h 和催化 速率常数k c a t ) 和热稳定性进行了研究。他的研究结果表明，n o t o t h e n i o i d s 。比s o u t h a m e r i c a n n o t o t h e n i o i d s 具有较高的k m 和k c a t ，而且l d h 通过增加分子中一些影 响相邻活化位点结构活动的小区域的柔韧性，。以达到对低温的适应。此外，通过 研究酶动力学发现，酶与底物的亲和性随着温度的变化而改变，并一般都在其栖 息地点长期所适应的温度下接近最大值( 即k m 值最小) 。h o c h a c h k a 认为：生物 在对环境温度的进化适应中，酶与底物的亲和性是对自然选择比较敏感的一种生 物学特性f 8 0 】。 1 3 5 分子生物学方面 抗冻蛋白自1 9 6 4 年发现以来，就引起了各国学者的广泛重视。而在鱼类的研 究领域中，d e v r i e sa l 8 1 】在南极m c m u r d o 海峡的一种n o t o t h e n i o i d 鱼的血液中首 次发现。后经研究发现，多数极地鱼类和冷水鱼类都能产生抗冻蛋白( a f p ) 或抗 冻糖蛋白( a n t i f r e e z eg l y c o p r o t e i n ，a f g p ) 。这些蛋白质能将鱼的体液冰点降至2 2 ( 低于海水的冰点1 9 左右) ，从而使之在海水冰点之下仍能保持其体液的流 1 4 上海海洋大学硕士学位论文 动性。现已发现的4 类a f p 虽然都具有抑制冰晶生长的特性，但其氨基酸组成和 结构却各不相同，它们彼此之间无同源性，差异也较大捧2 l 。 在昆虫、植物、- 细菌中也都发现有抗冻蛋白的存在。但只有鱼类的a f p 研究 的比较清楚。随着分子生物学的发展和基因工程的日渐完善，a f p 得到了空前的 应用。从极地水域鱼中获取a f p 基因，利用转基因技术，可直接将抗冻蛋白基因 整合到动、植物的基因组中并使之能稳定地表达，获得耐低温的转基因动、植物。 因此，深入抗冻蛋白基因的研究为进一步阐明鱼类起源、进化及分类有重要意义。 黑龙江水产研究所自1 9 9 6 年开始研究鲤鱼的耐低温机理。梁利群等首次应用 分子标记技术，以耐低温的黑龙江野鲤、不耐低温的云南柏氏鲤、江西荷包红鲤 及其杂交子代为研究对象，获得了1 2 个与鲤鱼耐低温性状相关的r a p d 分子标记， 并将其中的1 个定位在鲤鱼遗传连锁图谱上，并由此提出鱼类的耐低温性状为数 量性状，受微效多基因控制瞵3 i 。 1 4 本研究的理论和实践意义 鲤科( c y p r i n i d a e ) 是世界现生鱼类中最大的一个科，约有2 1 0 属2 9 0 0 种【8 4 l ， 也是我国淡水鱼类中种数最多的一个科，有5 3 0 余种【8 川。鲤科鱼类分部地域广阔， 生活环境都有其各自的特点。对于一些优良的喜温性鱼类如何克服分布水域的限 制，尤其是北方温带水域成为鱼类生物学家面临的巨大挑战，鱼类的耐低温性状 是鱼类的主要经济性状之一，虽然鱼类生物学家对耐寒与不耐寒的现象做了大量 的研究，但至今对鱼类耐寒与不耐寒的机理了解得还不清楚。我国是内陆淡水养 殖发达的国家之一，但是由于有些鱼类优良品种耐寒能力差不能在北方越冬等条 件制约，使得大面积推广受限制。如鲮鱼c i r r h i n u sm o l i t o r e l l a 是我国南方主要池 塘养殖鱼类之一，其产量约占两广地区池塘总量的4 0 左右，因其肉质鲜美，深 受国内外广大消费者的欢迎。、但鲮鱼对低温极度敏感，一旦达到其冷致死温度 ( 1 0 7 ) ，持续1 2 天即死亡。与鲮鱼不同的是，一些喜温性鲤鱼，如柏氏鲤、 荷包红鲤，可以耐受2 - 6 的低温长达数天或者1 2 个月。但是北方一般冰封期较 长( 4 6 月) ，所以他们不能在北方安全越冬，极大了限制了其推广面积，也限制 了北方的养殖结构，因此，广泛深入地研究鱼类的耐低温机制，克隆出与鱼类耐 低温性状相连锁的结构基因及调节基因；利用现代分子生物学手段与传统的杂交 育种相结合，将是水产养殖业的一次重大突破，并会给养殖业带来巨大的经济效 益。另外，鱼类对环境温度适应问题的研究在理论上对阐明生物进化、自然选择 等原理具有重要的意义。 上海海洋大学硕壬学位论文 根据鱼类耐寒问题的研究现状和今后发展方向，开展鱼类耐寒基因的克隆鉴定 及其耐寒机理研究，构建适于抗寒分析的实验鱼体系，筛选出与抗寒相关功能基 因并研究其结构、功能及其表达调控机理，将为水产养殖鱼类培育抗寒优良品种 提供理论依据和技术方法，有利于提高我国鱼类抗逆分子育种的研究水平及在国 际上的地位，这对于水产养殖业的可持续发展及扩大优良品种的养殖面积，提高 人民的生活水平具有重要的现实意义、科学价值和巨大的应用潜力。 论文的总体设计 由荷包红鲤抗寒品系柏氏鲤f ：家系 上海海洋大! 学硕七学位论文 2 1 实验材料总汇 第二章材料与实验方法 2 1 1 耐低温家系构建 本实验以荷包红鲤抗寒品系( 8 ) 和云南大头鲤( 早) ( 见图2 1 ) 杂交f 2 代为 研究对象，其中，荷包红鲤抗寒品系由黑龙江野鲤和荷包红鲤经过传统的杂交选 育方法获得，为具有荷包红鲤表型并能在冰下安全越冬的荷包红鲤抗寒品系( 在 黑龙江地区越冬成活率达8 0 ) 。根据孟德尔遗传定律，f 2 代会出现性状分离现象， 部分鱼表现为具有较高的抗寒能力，可以安全越冬；而部分鱼则因耐受不住低温 而死亡。通过对能够正常越冬的个体和死亡的个体的样品作为研究对象。 荷包红鲤抗寒品系 f 2 图2 - 1 家系建立示意图 f i g 2 1 t h ed i a g r a mo ff a m i l ys e t e du p 2 1 2 实验试剂 1 人工接头( a d a p t o r ) 、预扩增引物、选择性扩增荧光引物均由上海生工合成。 ， 2 e c o r i 内切酶，m s e i 内切酶：t 4d n a 连接酶均贿自n e we n g l a n db i o i 。a b s ( n e b ) 公司；t a qd n ap o l y m e r a s e 购自m b i 公司。 。 3 葡聚糖蓝、分子量标准( r o x 5 0 0 ，内标) 均购自4 a 3 i 公司；去离子甲酰胺购 自b b i 公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、t r i s 碱均均购自a m r e s c o 公司；过硫酸铵、t e m e d 购自a l f aa e s a r 公司。 4 酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、n a c l 、n a o h 、 i r i s b a s e 、e d t a 二钠盐、溴酚 蓝、蔗糖均为实验室常用试剂； 5 琼脂糖购自b i o w e s t 公司；g o l d v i e w 染料购自赛百盛公司； 2 1 3 仪器设备 1 a b ip r i s m3 7 7 半自动测序仪( a b i 公司) 2 p c r 仪( p e 9 6 0 0 ，p e 9 7 0 0 ) 购自p e r k i ne l m e r 公司； 3 低温高速离心机c s 一1 5 r 购自b e c k m a n 公司； 4 冷冻离心机r s 2 0 1 1 1 购自t o m ys e i k o 公司； 5 紫外分光光度计u v - 1 2 0 0 2 购自s h i m a d z u 公司； 6 电泳仪e p s3 5 0 0 购自p h a r m c c i ab i o t e c h 公司； 7 电泳槽d y y - 3 3 a 购自北京六一仪器厂； 8 手压式封口机f r 一3 0 0 购自上海麦尔多机械有限公司； 9 电热恒温鼓风干燥箱g z x 9 1 4 0 购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂； 1 0 循环水浴锅2 2 1 9 m u l t i t e i i 购自l k b 公司； 1 1 立式压力蒸汽灭菌器购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂； 1 2 冰箱( 8 0 ) m d f u 4 0 8 6 s 购自a n y o 公司； 1 3 制冰机f m l 2 0 d 购自h o s h i z a k ie i e c t r i c 公司； 1 4 数显不锈钢电热培养箱h p x 9 0 8 2 m b e 购自上海博迅实业有限公司； 1 5 特种净化工作台购自苏州净化设备厂； 1 6 微量移液器购自g i l s o n 公司； 1 7 m i l l i q 超纯水仪； 1 8 机械手购自p e r k i ne l m e r 公司 1 9 分析天平； 2 0 凝胶成像仪购自g e n e 公司 2 1分子标记技术的应用 1 8 上海海洋大学硕： 学位论文 2 2 1a f l p 分析 1 ) 基因组d n a 的提取 检测a f l p 引物多态性的模板d n a 取自荷包红鲤抗寒品系( 艿) 和柏氏鲤( 早) 杂交f 2 代的尾鳍。具体操作方法为：将0 2 m g 鳍条放入i 5 m l 的e p p e n d o r 借中加 入2 0 l 裂解液( 2 0 0 9 9 m l 蛋白酶k ，o 5 十二烷基肌氨酸钠，5 0 0 m m o l le d i a ( p h 8 0 ) ) ，5 5 。c ，中间不时地轻轻地摇动，待组织完全消化后取出。用等体积的 酚氯仿屏戊醇混合液( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提3 次，加入无d n a a s e 的r n a a s e ，终浓度 为2 0 p g m l ，3 7 。c 保温3 0 m i n 。再用等体积的氯仿抽提1 次。 将基因组d n a 进行透析( 透析液：5 0 m m o l lt r i s c 1 ，p h 8 0 ；1 0 m m o l l e d t a ，1 0 m m o l ln a c l ) ，方法见分子克隆，直至透析液o d 2 7 0 0 0 5 ，加入2 倍 体积的无水乙醇沉淀3 0 m i n ，7 5 乙醇洗涤1 次，室温干燥，加入1 0 0 9 lo 1x t e 溶解， 然后用1 a g a r o s e 凝胶检测样品质量，调选片段均大于2 0 0 0 b p d n a 样品用于a f l p 分析( 见图2 2 ) ，4 0 c 保存备用。 使用外分光光度计( 型号d u 6 5 0 ，b e c k m a n 公司) 检测o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值， 结果显示绝大部分样品的d n a l 匕值在1 8 2 0 之间，根据d n a 的质量，将其浓度调 整至i j 5 0 n g g l 用于a f l p 分析。 图2 2d n a 样品质量检测结果 f i g 2 - 2t h e t e s tr e s u l to fd n a s a m p l e si n1 a g a r o s e 2 ) e c o r l * 1 g s e 双链接头的合成 由上海生工合成的e c o r i 和m s e i 上下游接头： e c o r i - e a d a p t o r l ：5 - c t cg t a g a c t g c g t a c c 一3 e a d a p t o r 2 ： 3 一c a t c t g a c g c a t g g t l 钆- 5 m s e i ： m a d a p t o r l ：5 一g a c g a t g a g t c c t g a g 一3 m a d a p t o r 2 ： 3 - t a c t c a g g a c t c a t 5 将各上下游接头使用 1 0 自, 0 t e 稀释成浓度为 u g u l ； e c o 脚双连接头合成：e a d a p t o r l 取8 5 u l ，e a d a p t o r 2 取9 0 u l ，各接头含量为 1 5 n m o l ，加灭菌水, b n 3 0 0 u l 。 1 9 上海海洋火! 学硕? 仁学位论文 弘p 厥连接头合成：m a d a p t o r l t 双8 0 u l ，m a d a p t o r 2 取7 0 u l 各接头含量为1 5 n m o l ， 加灭菌水补到3 0 0 u l 。然后分别分装成2 0 u l 的p c r d , 管进行合成，p c r 程序程序采 用降温式( 9 5 0 c