（应用化学专业论文）多原料植物甾醇络合水解法提纯及合理配比初探.pdf

摘要 植物甾醇是一种广泛存在于植被中的物质，天然植物甾醇种类繁多，主 要包括：b 一谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇等。植物甾醇能够通过与 胆固醇的竞争有效的限制血液中胆固醇的吸收从而避免了很多疾病的发生 。最近几年，人们越来越关注饮食中的植物甾醇含量，因为它可以有效的 抗癌并且可以降低血液中的胆固醇含量不论是动物摄入植物甾醇还是人类 都是如此。目前，植物甾酵主要是从大豆脱臭馏出物中提取，从菜籽、雪松 中提取和其中甾醇的组成、功能特性等研究鲜见报导担1 。因此，本课题对植 物甾醇的提取工艺进行了研究，选用多种原料进行不同的处理得到粗制甾 醇。溶于溶剂中与金属盐溶液形成络合物。络合物在蒸馏水中水解得白色甾 醇抽滤并干燥，溶剂溶解后通过反应。过滤，重结晶t l c ，h p l c 检测得纯的植 物甾醇。不同组分的甾醇混合后溶于溶剂中，重结晶得植物淄醇的晶体。干 燥并检测新配比的植物甾醇。研究了提纯过程各步骤的因素( 溶剂选择，混 合溶剂配比，温度等) 影响。得出了最经济、合理及易操作的路线。不论从 医学，保健还是科研及工业生产方面来看，都体现了积极的价值。 关键词：植物甾醇；络合水解：配比 硕士研究生李泉( 应用化学) 指导教师王亦军教授 a b s t r a c t p h y o s t e r o l sa r en a t u r a l l yo c c r r i n gc o m p o u n d st h a te x i s ti np l a n t s t h e r e a r em a n yk i n d so f p h y o s t e r o l s i n n a t u r e ，m a i n l yi n c l u d i n gb - s i t o s t e r o l ， s t i g m a s t e r o l ，b r a s s i c a s t e r o la n dc a m p e s t e r o le t c p h y t o s t e r o l sa p p e a r st oi n v o l v e t h ei n h i b i t i o no fc h o l e s t e r o la b s o r b t i o nf r o mt h ep r o x i m n mj e j u n u m b y c o m p e t i n gw i t hc h o l e s t e r o la ts p e c i f i cu p t a k es i t e s s oi tc a np r e v e n tm a n ys i c k s r e c e n t l y ，t h e s ed i e t a r yp l a n ts t e r o l sh a v er e c e i v e dag r e a td e a lo fa t t e n t i o n b e c a u s eo ft h e i rp o s s i b l ea n t i c a n c e rp r o p e r t i e sa n dt h e i ra b i l i t yt od e c r e a s e c h o l e s t e r o ll e v e l sw h e nf e dt oan u m b e ro fm a m m a l i a ns p e c i e s ，i n c l u d i n g h u m a n s a tp r e s e n t ，p h y t o s t e r o lm a i n l ye x t r a c t e df r o md e o d o r i z e r di s t i l l a t e so f s o y b e a no i li no u rc o u n t r y t h e r eh a v ef e wr e p o r to np h y t o s t e r o le x t r a c t i o nf r o m r a p e s e e do i la n ds n o wp i n e t h e r e f o r e ，t h i sp a p e rs t u d i e dt h et e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o no fe x t r a c t i o n ，a n dp u r i f i e d u s e do fm a n yk i n d so fm a t e r i a l st h a ta r e d e a l tw i t hd i f f e r e n t l yt og e tc r u d ep h y t o s t e r o l s d i s s o l v e di ti ns o l v e n t ，w h i c h r e a c t e dw i t hm e t a ls a l t st o c o m p l e x c o m p l e xw a st h e nh y d r o l y z e di nh o t d i s t i l l e dw a t e ra n dt h ew h i t ep h y t o s t e r o l sw a sf i l t e r e da n dd r i e d ，t h ew h i t e p h y t o s e r o l s w a sd i s s o l v e di n s o l v e n t t h r o u g hr e a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n p h y t o s t e r o l sw a sf i l t e r e da n dr e c r y s t a i l i z e d t h e ni ti sd e t e c t e di tb yt l c ，h p l c m i x t u r eo fd i f f e r e n tc o m p o n e n tp h y t o s t e r o l sw a sd i s s o l v e di ns o l v e n t p r e f e r r e d b l e n d i n go fp h y t o s t e r o l sw a sr e c r y s t a l l i z e d ，d r i e da n dd e t e c t e d t h r o u g hs t u d y o ff a c t o r s ( s o l v e n tc h o o s i n g ，m i x t u r es o l v e n tr a t i o ，t e m p e r a t u r ee t c ) o fe a c h e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o ns t e p ，t h em o r ee c o n o m i c a l ，r a t i o n a la n dc o n v e n i e n t w a yi sg o t t e n n o to n l yi nt h em e d i c i n e ，b u ta l s oi nt h es c i e n t i f i cr e s e a r c ha n d i n d u s t r i a lp r o d u c t i o n ，i th a sv e r yi m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e k e yw o r d ：p h y t o s t e r o l ；c o m p l e x i n ga n dh y d r o l y z i n g ；b l e n d i n g p o s t g r a d u a t es t u d e n t ：q u a nl i ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f y ij u nw a n g 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中 依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 论文作者签名：歹耋孔日期：协7 年知h 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。 学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校 后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为 青岛大学。 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密d 。 ( 请在以上方框内打“”) 论文作者签名：躲 导师签名： 写每夏 日期：1 7 年月日 日期：御译厶日 ( 本声明的版权归青岛大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用) 引言 引言 植物甾醇广泛存在于生物体组织内的一类天然有机化合物，具有十分重 要的生理功能。甾体化合物可保持生物体内环境稳定、控制糖原和矿物质的 代谢、调节应激反应等。因而甾体化合物被科学家们誉为“生命的钥匙”。 甾体化合物的种类繁多，一般系根据其天然来源与所具有的生理作用进行分 类。通常可分为：甾醇类，胆酸类，甾族激素类，强心甙类，甾族皂素类与 甾类生物碱类等。甾体化合物具有十分重要的生理作用，尤其是植物甾醇类 作为适用面广的化合物的各种研究成为当今医疗与制药研究中热门领域0 1 。 目前植物甾醇的主要来源是油料作物制油工业中产生的脱臭物，主要的 油料作物有花生、大豆、油菜籽、葵花籽、棉籽等。还广泛的采用制纸工业 中的纸浆浮油为原料。这些原料的特点是成本低廉，杂质成分较少，甾醇含 量相对较高易于提取和纯化进行。缺点就是对地域要求比较苛刻，工业化提 取植物甾醇必须靠近油料作物生产地，而且有相关的制油或者造纸产业相依 托”。 从油菜籽，油菜籽饼柏，雪松树枝等原料中提纯甾醇在国内并未得到深 入的发展，一方面，这些原料需要进行预处理才可以用于植物甾醇的深入提 纯，而且在预处理的时候对反应器容量要求较高，反应条件与效果难控制在 一个较理想的范围之内。预处理时会产生大量没有再利用价值的废渣，增加 了后处理的困难程度和成本；另一方面，国内对植物甾醇的提取、纯化技术 未达到从这些原料中充分提取出植物甾醇，并且将其转为经济效益的要求。 从而很大程度限制了将油菜籽，油菜籽饼粕，雪松树枝等为原料提取植物淄 醇的发展”o 。 本论文采甩络合水解的纯化方式，将油菜籽，油菜耔饼粕，雪松树枝等 原料与传统的菜籽油脱臭馏出物和塔而油原料充分利用，以较理想产率从各 原料中提纯出植物甾醇，并且分析了其中各原料植物甾醇的组分含量，考察 每种原料得出的植物甾醇含量关系，人工配比的方式给于了各种原料提纯所 得植物甾醇产品以再配比。从而得到了含量更加丰富，组分更加合理的混合 植物甾醇产品。 青岛大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 植物甾醇的简介 植物甾醇是指：由含有氢化程度不同的1 ，2 - 环戊并菲甾核作为分子骨 架，在甾核上一般还含有三个侧链的一大类化合物1 。甾醇通常为片状或粉 末状白色固体，经溶剂结晶处理的甾醇为白色鳞片状或针状晶体，其中在乙 醇溶剂中结晶形成针状或菱片状，在二氯乙烷溶剂中形成针刺状或长棱晶。 甾醇分子中，碳原子数一般为2 7 - 3 1 ，分子量约为3 8 6 4 5 6 0 “1 。甾醇熔点较 高，都在1 0 0 c 以上，最高达2 1 5 c 。甾醇的相对密度略大于水，不溶于水， 可溶于多种有机溶剂哺1 。植物甾醇的物理化学性质主要表现为疏水性，但是 因为其结构上带有羟基基团，因而又具有亲水性。在同一个物质结构中同时 具有亲水基团和亲油基团意味着该物质具有乳化性。植物缁醇的乳化性可以 通过对羟基基团进行化学改性而得到改善。植物甾醇具有两性的特征使得它 具有调节和控制反相膜流动性的能力“1 。植物甾醇的结构通式见图i - i 。 通 式中r 。、，只表示甲基或氢原子，r 。则为8 一1 0 个碳原子构成的烃链，当r ， 和r 。均为h 原子时，称为4 一无甲基甾醇，即狭义上的甾醇，是当今主要开发 的植物甾醇，己鉴别出来的这类天然甾醇有1 6 0 多种。 r i 圈1 i 甾醇分子结构通式 2 第一章文献综述 甾醇在结构上与胆固醇很相似，植物甾醇根据来源不同，一般可分为三 大类：动物性甾醇、植物性甾醇和菌性甾醇。如果植物甾醇双键被饱和后称 为甾烷醇，羟基被酯化后称为甾醇酯的植物甾醇在常温下为白色结晶粉末， 无臭无味“。 常见的植物甾醇主要包括b 一谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇以 及他们的甾烷醇。它们的结构见图1 2 1 8 一谷甾醇 菜油甾醇 菜籽甾醇 谷甾烷醇 菜油箔烷醇 菜籽甾烷醇 豆甾酵 豆甾烷醇 图1 2 常见植物甾醇的结构式 植物f 醇广泛的分布于自然界，特别是各种油料种子中含量较高，在各 种植物的种子，尤其是油料植物的种子，茎中均有丰富多样的植物甾醇品种。 总结多种人们日常生活中常见的食品中植物甾醇的含量情况“2 1 如表1 1 所 示： 表1 1 多种食品中植物甾醇含量 食品名称游离甾醇：酯型塔醇谷甾醇：豆甾醇： 菜油甾醇 芝麻 l ：o 7 81 0 0 1 7 52 0 6 葵花耔i ：1 3 9 l o o 2 1 61 7 7 花生l ：0 5 ll o o1 6 31 6 5 菜籽 l ：o 8 51 0 0 4 6 31 1 1 大豆l ：o 7 81 0 04 4 22 5 5 绿豆l ：o ，8 21 0 06 1 31 3 o 毛豆1 0 06 1 3 1 3 0 d i 麦 i ：1 7 41 0 0 6 6 1 玉米l ：1 6 01 0 0 1 7 42 6 8 甘薯 l ：0 1 4l o o9 3 3 1 o 马铃薯l ：o ，5 9 1 0 0 2 1 51 7 箩卜l ：0 1 81 0 02 5 8 4 第一章文献综述 常见的植物甾醇物理特性“3 1 由下表1 2 列出： 表1 2 常见的植物甾醇物理特性 植物甾醇相对分子量 熔点( ) 比旋光度( c h l c = 2 ) b 一谷甾醇 4 1 4 21 4 03 7 菜油甾醇 4 0 0 6 61 5 73 3 菜籽甾醇 3 9 8 ，71 4 86 4 豆甾醇4 1 2 7 01 7 0一5 l 1 2 植物甾醇的提取分离 根据植物甾醇的理化性质，植物甾醇的提取与分离一般采用化学与物理 相结合的方法。常见的三种萃取方法：物理萃取一植物甾醇结晶分离：化学萃 取一溶剂提取植物甾醇：物理化学萃取一通过加成化合物的形式使植物甾醇和 添加剂结晶分离。随着新型技术的诞生，超临界c o 。萃取和分子蒸馏技术作为 新型的技术，也可以用于回收植物甾醇。目前，很多研究者利用先进的设备， 如高速逆流色谱( h s c c c ) 和自制备色谱分离出了高纯度的甾醇成分。虽然这 些设备有分辨率高，分离速度快等优点，但还是不能满足工业化生产的需要 14 1 因此探寻适用面广，提纯纯度较高且能力强的方法非常重要。 1 2 1 溶剂结晶法 该法一般为现今油脂工程专业教材上所述的提取方法操作较为简单。其 工艺流程是： 脱臭馏出物一皂化一乙醚萃取一乙醚抽出物一无水硫酸钠 一干燥并过滤一丙酮萃取一干燥一甾醇粗制品一乙醇重结晶 一甾醇精制品 s 青岛大学硕士学位论文 此工艺缺陷在于所用溶剂过多，回收困难，而且甾醇比例不高，难以 工业化生产。但其处理的方法及其中一些工序仍广为探索新工艺的人们参考 和借鉴，用于实验室做甾醇的定性，定量分析也较为合适。 t i t o h “钉“。1 等人用1 o n 氢氧化钾的乙醇液在氮气条件下回流皂化混 合物，稀释后不皂化成分用异丙醚萃取而得，通过蒸馏水冲洗，并在无水硫 酸钠条件下干燥，可得到i p e 萃取物即不皂化成分。k i u c h i “ 等人用混合溶 剂溶解皂化物后，再用混合亲水溶剂室温下从上述混合物中萃取包括混合甾 醇的极性组分，混合亲水溶剂包括：o 9 9 9 甲醇、0 5 0 正己烷、0 5 0 丙酮、 o 1 1 0 水、0 - 1 0 除甾醇外的其它不皂化物，溶剂循环利用。r a y n e w h a l “町 等人则将不皂化成分与活性炭悬浮在丙酮中，升高温度至4 0 5 0 c 范围内， 形成中性成分的丙酮溶液，去除不溶部分和活性炭后再分离结晶，结晶过滤 回收甾醇，其比例为6 0 以上，纯度为9 0 以上 1 2 2 络合法 日本、美国等就采用此法工业化生产植物甾醇”。针对谷维素生产老 工艺中提取谷甾醇的困难，繁复，我国少量米糠甾醇的工业化生产亦是采用 此法其工艺流程如下： 脱臭馏出物一皂化一酸分解一萃取一络合反应一分离一 络合物一分解一甾醇粗制品一脱色一结晶一甾醇精制品 此法经实验证明 酸、卤酸、尿素和卤 钙，氯化锌，氯化镁 有用异辛烷的，反应 况下。用水相皂化代 p a l m e rd n 2 0 ，产品纯度高，收率也较高各所用络合形成剂有：有机 素碱土金属盐。一般用卤盐络合，卤盐有氯化钙、溴化 、溴化镁、氯化亚铁等，络合反应溶剂有用石油醚的， 温度亦各异。其中，此法可考虑在不严重影响收率的情 替醇相皂化，减轻溶剂回收的麻烦。可适当降低成本。 等人在2 0 0 2 2 0 下从馏出物中通过甲醇转酯化作用， 6 第一章文献综述 分离出甾酵混合物，与甲醇分离后，在转酯化产物中加入一种非质子传递溶 剂使之溶解，再加入氯化钙和一定量质子溶剂后，在馏出物中加a - - 烷基酮 分离出加合物并分解回收游离甾醇。r i t c h i e a s h 讧”证”等人用和低碳醇的 混合物进行皂化，再加入饱和溴化钙溶液，过滤回收固体甾醇复合物，用乙 醇将甾醇从复合物中分解出来 1 2 3 干式皂化法 这种方法的工艺是： 去钙皂 f 脱臭馏出物一千式皂化一粉碎膏状物一萃取一浓缩一甾醇租制 品一洗涤去杂一脱水一甾醇精制品 此工艺用熟石灰或生石灰在6 0 9 0 c 皂化后直接用机器粉碎膏状物，避 免了一些麻烦的干燥操作程序。此外，采用乙醇作为抽提剂进行低温浸出， 一方面可节省大量乙醇。另一方面生产工艺安全无毒。改善其工艺条件以提 高比例的试验正在进行之中心”。 1 2 4 吸附法 工艺过程： 非甾醇杂质 f 脱臭馏出物一吸附柱一溶剂洗脱一甾醇租制品一乙醇重结晶一 躇醇精制品 b a r d e r “等人采用不同的吸附荆分离馏出物中的甾醇，得到的甾醇纯度 较高。如采用合成的无活性多孔碳分子筛，其平均孔径大于2 0 a ，一般为 青岛大学硕士学位论文 3 0 9 0 a ，表面积大于3 0 0 m 2 g ，- - 觥j 7 0 0 1 1 0 0 m 2 g ，用含碳焦化聚合物或碳 化树脂选择性吸附甾醇，洗脱剂用芳香烃吸附剂采用活性碳分子筛，其孔径 范围为1 5 2 0 a ，表面积为3 0 0 1 5 0 0 m 2 g ，选择性吸附所有甾醇而排除其它物 质，洗脱剂用芳香烃，吸附剂采用硅酸镁分子筛，则洗脱剂用甲基叔丁基醚， 吸附前需要去除原料中的酸性物质，可通过液液萃取实现，其中萃取剂二 甲基亚枫和正己烷分别从柱子的顶部和底部进去，而料液从柱子中部进去。 1 2 5 色谱分离法 v a nd a m “钉等人采用柱色谱分离方法从大规模的含甾醇的原料中进行商 业化生产，提取甾醇原料为动物或植物油脂的皂化物和重酯化物，色谱柱填 充物为硅酸铝、硅酸镁或硅胶，柱色谱可分离出至少一种甾醇，溶剂和洗脱 剂组成相同，主要是芳香烃或脂肪烃和环脂烃的混合物，对于胆甾醇，原料 为羊毛脂皂化后的醇混合物或用碳数更低的醇重酯化后的酯混合物，原料量 是填充刺的4 0 0 1 6 ，填充剂为硅胶，室温下色谱分离后( 重结晶前) 纯度可达6 7 以上，洗脱剂为c 6 c 9j 旨肪烃和碳原子更少的脂肪酮或酯，其中烃类占总体 积的8 0 9 8 ，如9 5 庚烷和5 丙酮，最后对沈脱物进行重结晶，可使甾醇达 到药用纯度【2 6 1 1 27 。 1 2 6 酶法 加拿大s u r e s hr a m a m u r t h i 和a l a n r mc c a r d y 采用丹麦哥本哈报 n o v o l n d u s t r i a s 生产的一种固定化非特异性脂肪酶对脱臭馏出物的酯化过 程进行催化，使脂肪酸甲酯的转化率达9 6 5 ，从而提高了v e 和甾醇的比例， 其处理方法是m m ： 脱臭馏出物一酶催化酯化一脱溶一真空蒸馏一甾醇和v e 一分离 该研究的目的就是为了克服溶剂浸出，化学处理及分子蒸馏提取v e 和甾 醇回收率低的缺点，可回收得原料中9 0 上的甾醇和v e ，而且酶处理条件 温和，原料亦不需任何预处理，可以认为是提取甾醇和v e 的一个新的发展方 向。 矗 第一章文献综述 1 3 植物甾醇的分析方法 植物甾醇通常采用显色法、红外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色 谱法、气相色谱法进行分析。 1 3 1 特殊试剂显色法”盯 将甾醇样品溶于氯仿中，沿管壁缓缓加一滴浓硫酸，发现加有浓硫酸的 甾醇样品呈现分层现象，接界面显玫瑰红色。将甾醇样品溶于乙酸酐后，滴 加一滴浓硫酸。发现溶液呈现绿色。 1 3 2 薄层色谱法( t l c ) 阻“ 薄层层析法是将固定相于玻璃等载板上涂布成均匀的薄层。将被分离的 物质点在薄层的一端，置于展开室中，展开剂( 流动相) 借毛细管作用从薄层 点样的一端展开到另一端，在此过程中不同物质可以得到分离，分离的原理 随所用的固定相不同而异，基本上与柱色谱相同，也可分为吸附薄层法、分 配薄层法、离子交换薄层法以及凝胶薄层法等。 薄层层析中物质之所以能在吸附剂的薄层上分离，是因为在吸附剂的表 面及其孔隙的表面存在许多活性点，被吸附物质的量以及被吸附的牢度在恒 定条件下取决于活性点的强度( 单位面积的表面能量) 以及数日( 每单位重量 的表面积) 。活性点的强度及数目较大时，吸附剂的活度就高，吸附削的保 留能力也较高，被吸附物质的比移值r r 就较小，不同物质在吸附剂上被吸附 的能力不同，因此就可以彼此分离。 薄层活度的大小受大气相对湿度的影响，因为吸附剂表面能可逆地吸附 分。若大气湿度过大，薄层活度过低，影响分离效果时，则必须将薄层板在 点样前根据活度要求在一定温度下活化。薄层活度并非越大越好，一般薄层 在1 0 5 1 2 0 ( 2 干操o 5 1 h 即可。但是活化后的薄层板在点样过程中在短短的几 分钟内就可与环度中的相对湿度达到平衡，因此能在恒温恒湿条件下进行吸 o 青岛大学硕士学位论文 附薄层分离是最理想的。 薄层色谱法的主要参数是比移值，即组分在色谱体系中的保留行为，反 映组分与固定相作用力的大小，是色谱过程热力学特性的参数，一般用比移 值( r 0 来表示。 1 3 3 高效液相色谱法( h p l c ) h p l c 分析，由于甾醇各组分结构极其相似，所以选择能使各种甾醇达 到完全分离的最佳色谱条件是关键。再加上甾醇是非水溶性物质，所以选择 反相液相色谱作流动相，多采用甲醇一水作流动相，分离效果较好。 许多文献己经报道了高效液相色谱对各种体系中的甾醇的分析结果，对 于h p l c ，甾醇不需要衍生化即可直接进样，操作简便，精确度较高，重现性 好，若采用其制备色谱还可收集分离到各单一甾醇的标准品“”n ”。正相高 效液相色谱( n p h p l c ) 和反相高效液相色谱( r p h p l c ) 常用于分离分析动植 物细胞的中性和极性油脂。正相h p l c 是将脂类混合物分成几大类，而反相 h p l c 则是进一步将每一大类中各种脂类物质分离开。 在前二十年里，有大量报道关于正相h p l c 分离中性脂类或者同时分离 中性和极性脂类，多种检测器技术也应用于其中，对于分析绝大部分为脂类 的混合物而言，紫外检测器( u v ) 最为常用，波长范围2 0 5 2 1 5 n m ，同时可结 合梯度洗脱或者程序控制流速，也有紫外- 二极管阵列检测器( u v p a d ) 在 1 9 0 3 5 0 a m 或者2 0 0 4 0 0 n m 与梯度洗脱结合应用。 由于操作简便，运用广泛，如今反相柱和极性流动相是高效液相色谱中 最常用的。较旱地被用于研究分析游离辔醇和甾醇衍生物，在反相桂上这些 物质的保留特性与分子结构之间的关系得到了研究。 总结常用于分析体系中甾醇的h p l c 条件1m 3 6 1 主要有： 1 0 第一章文献综述 1 ) 色谱柱：反相c 1 8 和c 8 柱、正相硅胶柱 2 ) 检测器：紫外检测器( u v ) 、光散射汽化检测器( e l s d ) 、示差折光检测器 ( r i ) ，其中紫外检测器波长有2 0 5 - 2 1 0 n m ，2 1 5 n m 2 5 4 n m 等。 3 ) 流动相：对于反相柱，主要为甲醇，添加少量改性剂如水、乙睛、四氢吠 喃。对于正相柱，主要为正己烷，添加少量改性剂如异丙醇、乙醚。 1 3 4 气相色谱法( g c ) 采用g c 分析，除了将样品衍生化或经t l c 预处理，对于一般的样品现 在大多直接对植物甾醇进行定性和定量分析。特别是毛细管柱气相色谱分析 技术比较成熟，快速可靠，适用于日常的分析检测工作。定性分析采用标准 品保留时间，定量分析采用内标法。不同的仪器条件下，可用胆甾醇或角鲨 烷作为内标物。 随着高灵敏度，高选择性检测器的研制成功，多种高温固定相的合成和 应用，各种柱制备技术的开发以及样品衍生化技术的迅速发展，给气相色谱 法在甾醇分析创造了更为有利的技术条件。由于甾醇分子量较高，分子中含 有极性基团，沸点比较高，难以气化，高温下不稳定，使得游离甾醇难以直 接进行气相色谱分析，因此要将甾醇转化为适当的衍生物，增加其挥发性和 稳定性，降低气化点，从而可以改善气相色谱峰的对称性和其他色谱性能。 更为重要的是，衍生化的作用在于可以使空间结构相似，差别很小，难以分 离的不同甾醇分离开，从而可以定性定量分析混合甾醇样品中所含甾醇的种 类和组分含量。化学衍生方法主要有酞化、酯化、烷基化法“。 1 4 植物甾醇的吸收与分布 人体不能合成植物甾醇，只能从食物中摄取植物f i 醇，但食物中植物甾 醇的吸收率很低平均在5 左右。而胆甾醇的吸收率超过4 0 。 青岛大学硕士学位论文 动物实验的结果表明n ”，不同种类的植物甾醇在肠道中的吸收率不同。 菜油甾醇比b 一谷甾醇吸收要好，而豆甾醇的吸收最差，这是因为其侧链的 变化可影响其从肠绒毛膜细胞和刷状缘细胞的吸收。一般来说，随着c ：。位侧 链上c 原子数目的增多，其吸收率呈下降趋势。化学形式上的变化也可影响 到各种植物甾醇的吸收，b 一谷辔醇双键被饱和转变为谷甾烷醇后几乎不能 被吸收，菜油甾醇的双键被饱和后几乎不能被吸收，但是菜油甾醇的双键被 饱和后吸收率增加。大量的研究证据表明h ”，是否容易被酯化是各种植物甾 醇是否容易被肠道吸收的基础。还有研究证明雌性动物比雄性动物的吸收更 好。未被吸收或体内代谢后的植物甾醇则可经肠道细菌转化，形成一系列代 谢产物如粪f 醇和粪甾酮等排出体外。 吸收后的植物甾醇与脂蛋白一起在血液中运输。然后选择性的分布到 身体各个部位。一般肝脏，肾上腺，卵巢，睾丸等脏器中植物甾醇含量很高。 这一分布也许提示其可能被用来作为甾醇激素的前体。 1 5 植物甾醇的主要功能 植物f 醇具有独特的生理功能“，例如曾被广泛研究的植物甾醇生理功 能研究主要以降胆固醇效果为主，然而也有一些其它生理功能的报道”。有 关植物甾醇降血清胆固醇效果的动物实验，很早就有人报道。1 9 5 2 年，首次 报道植物甾醇降低人体血清胆固醇的效果。抗癌效果是植物甾醇生理性质中 另较为突出的。此外，植物甾醇的甾族结构类似于雌激素荷尔蒙的结构， 这表明植物甾醇可能具有雌激素的活性，植物甾醇的这种活性用浓度很低的 b 一谷甾醇在老鼠身上得到了验证。一些植物甾醇，例如p 一谷甾醇，具有抗 炎活性，在脂肪酸的合成中具有抗老化的作用。其它些植物搿醇具有调节 脂肪腺分泌的功能，常用于前列腺癌的治疗。此外，还分别有人报道植物甾 醇具有一定的抑制血小板凝聚效果、抗细菌以及抗霉菌、抗癌活性和抗朋，瘤 活性“。 第一章文献综述 1 5 1 植物瑙醇安全性 美国食品和药物管理局( f d a ) 赋予植物甾醇以“一般认为安全( g r a s ) ” 认可，因此食用植物甾醇基本上是安全的。上世纪7 0 年代曾在临床中发现遗 传性谷甾醇血症，这一遗传缺陷使血液中谷甾醇和菜油甾醇含量显著升高， 易导致动脉粥样硬化，使心肌梗塞可在年龄很小时便可发生。因此，只有高 植物甾醇血症或高植物甾烷醇血症患者才需要避免食用含有植物甾醇食物。 在一项长达1 3 n 大鼠经口毒性实验中，除发现血液胆固醇降低外，研究人员 并没有发现大鼠发生病理性交化。实验结果认为膳食中含l 植物甾烷醇无 副作用，这一浓度相当于0 5g 植物甾烷醇k g 体重d 。此用量实际上远远 超出临床实验中所得出降低胆固醇成人每日摄入2g 左右植物甾醇需用量。 而在另一项对大鼠进行两代遗传实验中，食物中含有高达4 3 8 植物辔烷 醇酯( 相当于2 5 植物甾烷醉) 不会对生育、幼仔成活率、幼仔体重或幼 仔体重变化产生任何副作用。在一项对大鼠进= f y 9 0 d 亚慢性经口毒性实验中， 植物甾醇酯不会对大鼠产生任何器官毒性，并由此得出无副作用剂量为6 6 g f f 物甾醇酯k g 体重或相当于4 1g 植物淄醇k g 体重“。 1 5 2 植物甾醇的降胆固醇作用 人类最早认识植物甾醇的功能作用是从其降低血液中胆固醇开始的，但 对其作用机理还不是很清楚，许多研究者认为主要有三种可能性：植物甾酵 能阻碍胆固醇溶于胆汁酸微胶束；在微绒毛膜吸收胆固醇时与胆固醇相互竞 争而阻碍胆固醇的吸收：阻碍小肠上皮细胞内胆固醇酯化，抑制对乳糜微束 吸收，因而也抑制向淋巴输出h ”。 早于1 9 5 2 年，曾通过试验获知摄入植物甾醇对高胆固醇患者降低胆固 醇有效，试验研究表明，若i i 型高胆固醇患者r 服3 6 克富含8 一谷甾醇的檀 物 ；5 醇，数月后其血中胆固醇浓度可下降1 0 ，同时表明其主要仅下降低密 度脂蛋白( l d l ) 胆固醇量，而对高密度脂蛋白( h l d l ) 胆固醇和中性脂肪( 甘油 t 3 青岛大学硕士学位论文 三脂) 量几乎无影响。另据试验，菜籽甾醇也具有与b 一谷甾醇相同效果，不 过经动物试验表明，菜油甾醇和海藻内岩藻甾醇的降胆固醇效果较弱“”。 1 5 3 其他 经动物试验发现，b 一谷甾醇可抑制化学致癌剂诱发大肠癌，这可能与流 入大肠胆汁酸有关，因b 一谷甾醇具有抑制胆汁酸作用，能使癌细胞增殖减 少。另有报道，对志愿者进行为期3 4 周高剂量植物甾醇酯食用实验，对其 粪便中胆酸及甾醇含量( 包括胆固醇、植物甾醇酯及其代谢产物) 进行检测， 发现虽然粪便中甾醇含量升高，但具有潜在致畸作用4 一胆甾烯3 酮含量却仍 维持在正常水平之内，证明植物甾醇不会提高甾醇代谢水平，实际上会降低 胆酸代谢物浓度，从而减少大肠癌发生几率。植物甾醇对乳腺癌、胃癌等疾 病也有一定的抑制作用。乳腺癌：研究者认为植物甾醇可延缓乳腺肿瘤的生 长和扩散。植物甾醇的抗乳腺癌症的作用可能与其具有某些雌素活性有关。 其他癌症：d es t e f a n i 研究证明摄入较多植物甾醇可降低胃癌发生的危险性。 d cs t c f a n ie 研究则证明植物甾醇的摄入量与肺癌发生率之间呈负相关系“”。 植物甾醇组分中的p 一谷甾醇有类似于氢化可的松一样有较强的抗炎 作用，豆甾醇也有一定的消炎作用，且无副作用，因而植物滔醇可作为辅助 抗炎症药物而长期使用，还有类似于阿司匹林的退热镇痛作用，这些在临床 上引起广泛关注。一般临床应用的抗炎药物多具有致溃疡性，而谷甾醇服用 量高至3 0 0 m g k g 也不会引起溃疡。 由于植物搿醇的乳化性、保湿性等理化性质和具有调节和控制反相膜流 动性的能力，使植物 ；醇被用作头发和皮肤调节剂、皮肤再生细胞促进剂和 头发生长促进剂，也可作为皮脂腺调节剂和抗老化因子。植物 醇对人体具 有重要的生理活性作用，其乳化性能好而且稳定，特别是谷甾醇对皮肤有很 高的渗透性，2 和5 的乳剂能降低脂蛋白，增强脂肪酶活性，对皮肤由于 太阳光线偏振光作用而产生的红斑有防御作用，能抑制皮肤炎症，保持皮肤 1 4 第一章文献综述 表面的水分，防止皮肤老化等，因此可以作为皮肤营养剂用于许多化妆品中。 在农业中，植物甾醇可以作为大规模合成农业除草剂和杀虫剂原料。另 外，植物甾醇由于其乳化性能好，还可用于纸张的精压加工，印刷行业作为 油墨颜料的分散剂，纺织工业作为柔软剂等“”。 1 6 国内对甾醇的研究概况 我国是制油和油脂消费大国，油脂工业副产物中蕴藏着极为丰富的植物 甾醇资源，国内外一些研究者对油脂脱臭馏出物、米糠油下脚，谷维素皂脚 等植物甾醇资源进行了含量分析、提取开发等工作。随着人民生活水平的提 高，油脂精炼工业飞跃发展，按精炼能力与植物甾醇含量估算，我国油脂生 产厂家仅脱臭馏出物中就蕴藏植物甾醇总量近1 0 0 0 t 。目前，国际上商品植 物甾醇的7 0 以上来源于大豆油脱臭馏出物。另一方面，植物甾醇众多生理 功能的被发现并在其应用领域拓展。因此，对我国特有资源进行保护性开发 愈加显得迫切和必要。在这方面我国有许多优势，除了传统的主油料产品大 豆，菜籽、棉籽等资源外，菜籽饼、塔尔油等亦是亟需大力开发利用的植物 甾醇资源。此外。许多野生油料作物资源也应引起重视和关注，它们中有可 能是某个特定植物甾醇的原始富集源，从而大大有利于基因工程技术的后续 工作。特别值得指出的是，具有中国特色的中草药中有许多富含植物甾醇而 且对药效有较确切的贡献，例如天门冬、黄柏、蒲黄、冬虫夏草等。 从国内外研究结果分析，从三个“e ” 即e f f i c i e n t ( 高效) 、 e c o n o m i c a l ( 经济性) 和e n v i r o m e n tp r o t e c t ( 环境保护) 的角度出发，研究 普适的提纯方法，有利于提高植物甾醇生产的综合效益“盯拍“。可以用“转、 分、微”三个字来概括植物甾醇产品的深度开发现状与趋势，“转”即是将 植物甾醇转化为乙氧基化物、植物f ；烷醇、硫酸盐、植物络醇多塘、甾体激 素药物等形式，这方面现已有较多的工业例子，如药物合成工业中甾醇微生 物发酵降解制取4 a d 和a d d 的新工艺、化妆品工业中植物甾醇乙氧基化物乳剂 1 s 青岛大学硕士学位论文 的开发，以及当前在生理活性更强、更协调、稳定性更高、用途更广的衍生 物制备方面的开发研究；“分”则是开发出高效低成本分离混合植物甾醇技 术，进一步提高植物甾醇分子自身应用的针对性和产品附加值；“微”就是 和用液晶技术、脂质体制备技术、微胶囊技术等将植物甾醇及其产品粒子化， 成为适合某特定用途的形式，如在精密光学、医学生命科学领域中的产品拓 展，而且这种方式有时还可大大增加植物甾醇分子本身的生物活性，如在医 学生命科学中备受关注的脂质体制备多是采用胆固醇，现引入植物甾醇替代 胆固醇，不仅可以避免胆固醇摄人后的负面效应，有利于植物甾醇透过细胞 膜进人体相，而且还可观察到植物甾醇生物活性增加。 1 6 第二章植物甾醇定性定量分析 第二章植物甾醇定性定量分析 2 1 前言 利用分析化学所掌握的分析知识对实验中提取，纯化以及配比中得到的 植物甾醇进行定性与定量分析。有效的帮助实验过程中，实验条件的确定以 及修正，保证了实验工作的准确度，有效性。 由于各种植物甾醇结构上的相似性，在提纯植物甾醇的实验过程中，探 索出一条合适的定性定量方法尤为重要。天然产物的提纯工作，往往是通过 使用合适的溶剂将天然产物中的有效成份提取出来，提取的效果如何，伴随 提取出来的杂质有何性质，对进一步的纯化是否存在较大的干扰，这些现实 的实验问题都需要时刻通过分析手段来跟踪检测。充分考虑到现有的实验条 件和检测环境，制定出在此条件下最经济，便捷，高灵敏度，高准确性的实 验条件，实验才可以顺利进行下去，得到的数据才有科学性和实际应用价值。 定性分析：跟踪检测主要采用了特殊试剂显色法、薄层层析色谱法 ( t l c ) ：阶段性检测主要采用高效液相色谱法( h p l c ) 。 跟踪检测采用特殊试剂显色法与薄层层析色谱法，首先是因为实验步骤 比较繁杂，每一步都需要对实验过程进行检测确定提取，纯化工作所得产物 的成份。其次是因为这两种方法操作非常简便，检测成本很低，在实验室现 有条件下是最适宜的检测方式。根据对实验用原料的分析检测发现这2 种方 法也是相对比较准确的检测方式。大量检测均能保持良好的检测准确度和稳 定性。 定量分析：主要采用高效液相色谱法( h p l c l 应用高效液相色谱检测，分析混合植物甾醇总含量和混合植物甾醇中的 各种甾醇的含量，操作在常温下进行，样品不需要衍生化处理，方法快速简 1 7 青岛大学硕士学位论文 单，高效、高速，灵敏度亦很高，样品用量少，适用于微量分析而应用范围 更广结果可靠。采用面积归一法或外标法均可为络合水解法分离提纯植物甾 醇的研究提供快速准确的测定方法。考虑到实验室现有较好的相关设备和条 件，因此定量分析方法采用高效液相色谱法。 2 2 试剂 1 实验中制得植物甾醇 2 豆甾醇，9 5 ，s i g m a ，u s a 3 b 谷甾醇，9 5 ，西安蓝天生物制品有限公司 4 混合甾醇，9 5 ，西安蓝天生物制品有限公司 5 薄层层析板( 烟台市江友硅胶开发有限公司) 6 氯仿、乙酸酐、浓硫酸、冰醋酸，三氯化铁、正己烷、乙醚、丙酮、甲醇、 均为分析纯。 2 3 化学试剂特殊显色法 1 与浓硫酸的显色反应 分别取适量提取所得植物甾醇产品及植物甾醇标准品溶解于氯仿中，沿 管壁缓缓加入几滴浓硫酸，观察现象变化。 发现对于提取所得植物甾醇产品及植物箔醇标准品，试管中液体均呈分 层现象，且其接界面出现玫瑰红色，现象明显突出。操作简便明了。 分别取适量提取所得植物f ； 醇产品及植物 ； 醇标准品溶解于乙酸酐中， 沿管壁缓缓加入几滴浓硫酸，观察现象变化。 发现对于提取所得植物甾醇产品及植物甾醇标准品，试管中液体均呈分 1 8 第二章植物甾醇定性定量分析 层现象，且其接界面出现绿色，现象明显突出。操作简便明了。 2 与三氯化铁乙酸浓硫酸溶液的显色反应 配制三氯化铁乙酸- 浓硫酸溶液：称取l g = 氯化铁六水合物，将其溶解于 l o m l 乙酸中，然后吸取1 o r a l - - - 氯化铁溶液至l o o m l 容量瓶中，用浓硫酸混合， 稀释至刻度即可。 将少量豆甾醇、混合甾醇标准品分别置于试管中，加入乙酸溶解，然后 加入三氯化铁乙酸浓硫酸溶液，观察现象变化：发现对于豆甾醇以及混合 甾醇样品，试管中液体的颜色均发生变化：豆甾醇显蓝色，而混合甾醇显蓝 色，再略变为紫罗兰色，符合文献所述1 3 6 i ，此法较为操作简便。 2 4 薄层层析法( t l c ) 2 4 1实验原理 薄层色谱是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术， 具有设备简单，操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻 片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂 展开而达到分离的目的。 通常用比移值( r f ) 表示溶质移动的相对距离，而溶质的比移值与其它色 谱技术中保留值相当，其定义是： 展开剂前沿与样品点中心问的距离 物质的比移值随化合物的结构、吸附剂、展开剂等不同而异，但在一定 条件下每一种物质的比移值都为一个特定的数值。故可利用一致色谱体系进 行分离后溶质斑点的r ，值与文献值对照来鉴别，也可在相同条件下分别测定 1 9 青岛大学硕士学位论文 已知和未知物质的比移值，再进行对照，视其r ，值是否相同来对未知物质进 行鉴别m 1 。 2 4 2 实验内容 1 分析准备 先将实验用薄层层析板分割成约为2 5 c mx5 c m 的小板待用。 取碘块2 ，3 块敲击成直径约为1 2 厘米的小块，放入广口瓶中，铺于广口 瓶底盖紧盖子备用。 取少许植物甾醇标准品，包含混合植物甾醇标准品和豆甾醇标准品分别 放入离心管中加入分析纯正己烷到点样管2 3 处，充分摇晃使加入其中的植 物f 醇标样充分的溶解。盖好盖子，贴好标签备用。 将适量分析纯的石油醚与丙酮从试剂瓶中移入滴瓶中备用。 2 ，分析过程 用胶头滴管取4 滴石油醚滴入展开缸中，盖好盖子，另用胶头滴管取l 滴 丙酮滴入展开缸中。盖好盖子充分摇匀。 用毛细管取待测溶液少许，轻轻在薄层层析板距底部约为5 m m 的水平位 置上靠左部和中部各点一个点。另取一新的毛细管取点样管中的标准植物甾 醇少许。点在同样水平靠右侧一个点，然后在中部已有点处重复点一次。应 控制点样力度适中，不应过大或过小。 将点过样的薄层层析板稍稍晾干，用镊子夹住上部倾斜放入展开缸中， 下部稍微进入展开剂且不能超过点样水平刀准。 迅速盖好盖子。观察展开剂逐渐的展开，应保持溶剂前沿在同一水平线 上慢慢上行。待溶剂前沿到距离薄层层析板上部约7 m m 处。迅速取下盖子用 2 0 第二章植物甾醇定性定量分析 镊子将薄层层析板取出斜放入碘瓶中。 在展开缸中加入适量溶剂清洗干净并晾干，盖好盖子。 放置约3 0 m i n 后，从碘瓶外可以观测到薄层层析板上逐渐有点析出。再 放置约3 0 m i n 板上的各点大小不在变化的情况下，将薄层层析板取出、观察， 然后照样纪录。 2 4 3 结果与讨论 因采用薄层层析板为成品，所以