（生物化学与分子生物学专业论文）日本囊对虾中三个免疫相关基因的研究.pdf

厦门大学博士学位论文摘要 摘要 本研究小组在前期的工作中利用抑制性差减杂交( s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 的方法，得到了许多与日本囊对虾 ( m a r s u p e n a e u sj a p o n i c u s ) 天然免疫相关的基因，本论文选取了其中的三个 进行深入的研究。 膨舻卜j ( 彪j a p o n i c u sk u n i t z t y p ep r o t e a s ei n h i b i t o r - 1 ) 是在微生 物( 细菌和酵母) 胁迫后表达上调的一个基因，编码的蛋白由一个信号肽和一 个k u n i t z 结构域组成。通过筛选日本囊对虾c d n a 噬菌体展示库，发现由毕赤 酵母系统表达的重组蛋白m j k p i - 1 能够与内源的胰蛋白酶相互作用，并通过体 外的胰蛋白酶抑制实验得以证实。 m j - d w d ( 彪j a p o n i c u s d o u b l e w a pd o m a i n s ) 基因是从抗病虾血细胞 差减文库中克隆到的，编码的蛋白含有一个整合素结合位点k g d ( l y s g l y a s p ) 和两个w a p ( w h e ya c i d i cp r o t e i n ) 结构域。通过实时定量p c r 发现，在新制 备的抗病虾中g j - d w d 基因的表达保持在一个较高的水平；另外在w s s v 感染早 期，正常虾中m j - b w d 基因表达也明显上调。进一步研究发现，毕赤酵母系统 表达的重组蛋白m j d w d ，能够特异性地抑制枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶活性。 结果表明，m j k p i 一1 和m j d w d 都属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，我们推测它 们是通过丝氨酸蛋白酶抑制活性在对虾的天然免疫中起作用。 礁j t c t p0 m j a p o n i c u st r a n s l a t i o n a l l yc o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i n ) 基因也是从抗病虾血细胞差减文库中克隆到的。为了研究妒t c t p 基因的表达 调控机制，我们克隆了它的启动子，并在昆虫细胞中进行了活性验证。同时我 们还发现扩t c t pm r n a 和鼠的t c t pm r n a 一样会形成高度稳定的二级结构。 有趣的是鼠的t c t pm r n a 形成的二级结构已被证实能够结合并激活抗病毒过 程中一个重要的激酶p k r( d o u b l e - s t r a n d e dr n a d e p e n d e n tp r o t e i n 1 厦门大学博士学位论文 摘要 k i n a s e ) 。另外，我们还利用原核表达的r m j t c r p 蛋白筛选了w s s v 全基因组 的噬菌体展示库。这些结果将有助于我们更好地理解t c t p 在对虾抵抗病毒感 染过程中的作用。 关键词：日本囊对虾；天然免疫；免疫相关 2 厦门大学博士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t s s h ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) t e c h n i q u ew a sr e c e n t l y u t i l i z e dt oi s o l a t ed i f f e r e n t i a l l yt r a n s c r i b e dg e n e sb e t w e e nt h en o r m a l a n dm i c r o b ec h a l l e n g e do rv i r u s r e s i s t a n ts h r i m pi no u rl a b ，l e a d i n g t ot h ed is c o v e r yo fm a n yg e n e sw it hp o t e n ti a li m m u n er e l e v a n c e t h r e e o ft h e mw i t hh i g hi n t e r e s tw e r ec h o s e na n dc h a r a c t e r i z e di no u rs t u d y 酗j k p i 一1 、弘j a p o n i c u sk u n i t z t y p ep r o t e a s ei n h i b i t o r - 1 、) g e n ew 。a s o r i g i n a l l yi d e n t i f i e db ys s ha so n eo ft h o s eg e n e st h a ti n v o l v e di nt h e r e s p o n s eo f 彪j a p o n i c u sh e m o c y t e st om i c r o b i a lc h a l l e n g e i te n c o d e s as i g n a lp e p t i d ea n dak u n i t zd o m a i n t h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tm j k p i - 1 e x p r e s s e db ypp a s t o r i sw a sf o u n dt oi n t e r a c tw i t he n d o g e n o u st r y s i n ( t r y p s i no f 膨j a p o n j c u s ) ，w h i c hw a si d e n t i f i e db yu s i n gp h a g e - d i s p l a y t e c h n i q u e f u r t h e rp r o t e a s ei n h i b i t i o na s s a yd e m o n s t r a t e dt h a tt h e r m j k p i 1 w a sa b l et o c o m p l e t e l yi n h i b i tt r y p s i na c t i v i t ya tt h e m o l e c u l a rr a t i o no f1 ：1 t h em j - d 肋( 彪j a p o n i c u s d o u b l e w a pd o m a i n s ) g e n ew a so r i g i n a l l y f o u n du p r e g u l a t e di nh e m o c y t e so ft h ev i r u s r e s i s t a n ts h r i m pb ys s h i te n c o d e san o v e lp r o t e i nc o n t a i n i n gap u t a t i v ei n t e g r i nb i n d i n gm o t i f k g d ( l y s g l y - a s p ) a n dd o u b l ew a pd o m a i n s u s i n gr e a l - t i m ep c r ，m j - d y d g e n ew a sr e c o n f i r m e dt ob em a i n t a i n e da tah i g hl e v e li nt h en e w l y p r e p a r e dv i r u s r e s i s t a n ts h r i m p ，w i t han e a r l y5 - f o l di n c r e a s ec o m p a r e d t ot h en o r m a ls h r i m p i na d d i t i o n ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fm j - d w d g e n e w a so b s e r v e dt ob ed r a m a t i c a ll yu p 。r e g u l a t e dd u r i n gt h ee a r l yp h a s eo f w s s vi n f e c t i o n m o r e o v e r ，t h er e c o m b i n a n tm j d w dp r o t e i nw a ss h o w nt o b ea b l et oi n h i b i tt h ep r o t e a s e ( s ) a c t i v i t yo f 显s u b t i l i so b v i o u s l y t h e s er e s u l t ss u g g e s t e db o t hm j k p i 一1a n dm j d w db e l o n gt os e r i n e p r o t e a s ei n h i b i t o r s ：t h e ym a yp a r t i c i p a t ei nt h es h r i m pi n n a t ei m m u n i t y t h r o u g ht h e i rp r o t e a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e s 必，。聊p ( 彪j a p o n i c u st r a n s l a t i o n a l l yc o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i n ) g e n e 3 w a sd r a m a t i c a l l yu p 。r e g u l a t e di nh e m o c y t e so f t h ev i r u s 。r e s i s t a n t s h r i m p i no r d e rt ob e t t e ru n d e r s t a n dt h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n 文m j t c t pg e n ee x p r e s s i o n 。i t sc o m p l e t eg e n o m i cs e q u e n c e w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e dh e r e w i t h i nt h e p r o m o t e rr e g i o n ，m a n y t r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n g s i t e sw e r ef o u n d ，s h o w i n gt h a tt h e e x p r e s s i o no fm j t c t pi st i g h t l yc o n t r o l l e d t h ep r o m o t e ra c t i v i t yh a d b e e nt e s t e di nh i g h f i v ec e l l s 。m o r e o v e r 。w ef o u n dt h a tt h e 酗j t c t p m r n a i sh i g h l ys t r u c t u r e d ，w h i c hi sv e r ys i m i l a rt ot h es i t u a t i o ni nm o u s e t c t p m r n a ，i n d i c a t i n gi t sp o t e n t i a lt ob i n da n da c t i v a t ep k r i na d d i t i o n ， t h ep u r i f i e dr m j t c t pe x p r e s s e di nec o l iw a su s e dt os c r e e na g a i n s t t h ew s s vg e n o m i cp h a g e d is p l a y1i b r a r yt ol o o kf o ri t sp a r t n e ri nv i v o t h e s er e s u l t sw i l lb em u c hh e l p f u lf o ru st of u r t h e ru n d e r s t a n dt h er o l e s t h a ts h r i m pt c t pg e n ep l a y si nt h eh o s td e f e n d i n gs y s t e ma g a i n s tv i r a l i n f e c t i o n s k e y w o r d s ：m a r s u p e n a e u sj a p o n i c u s ；i n n a t ei m m u n i t y ：i m m u n e r e l e v a n t 4 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：1 2 ：l ，丹丹 2 p 口譬年5 月j 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名： 导师签名： 阮哥丹 弦加 日期：知0 8 年罗月，c f 日 日期y 厂钞月矽日 厦门大学博士学位论文前言 - 上- ! 鱼 刖 昌 1 对虾的养殖现状 对虾在分类上属于节肢动物门，有腮亚门，甲壳纲，软甲亚纲，十足目， 游泳亚目，对虾科，对虾亚科，对虾属，是温暖浅海最占优势的甲壳动物。 对虾养殖业是中国海水养殖的重要产业，对虾养殖产量和养殖规模曾在八 十年代末至九十年代初居于世界前列，年产量达2 0 万吨，年产值近百亿元， 产生了显著的经济效益和社会效益。我国当前的对虾养殖品种主要有斑节对虾 ( p e n a e u sm o n o d o n ) 、南美白对虾( l it o p e n a e u sv a n n a 历e i ) 、中国对虾( p e n a e u s c h i n e n s i s ) 和日本囊对虾( m a r s u p e n a e u sj a p o n i c u s ) 等【1 捌。 1 9 9 3 年养殖对虾病害的爆发性流行，导致整个对虾养殖产业的严重减产。 1 9 9 4 年全国养殖对虾产量仅有6 万吨；不仅对虾养殖业本身经济损失巨大，而 且相关的对虾加工和外贸出口等行业也受到严重影响。九十年代中后期，中国 大力加强了病害防治、养殖模式改造和新品种引进、改良等研究工作，养殖有 所好转，养殖业又出现新的高潮吲。 目前，已经报道的对虾疾病种类有数十种，病原种类包括病毒、细菌类、 真菌类、寄生虫类、原生动物类。迄今为止，已发现的对虾病毒有2 0 种之多， 引起我国虾病暴发流行的主要有下列几种病毒：对虾肝胰腺细小病毒 ( h e p a t o p a n c r e a t i cp a r v o v i r u s ，h p v ) 、对虾传染性皮下及造血组织坏死病 病毒( i n f e c t i o u sh y p o d e r m a la n dh a e m a t o p o i e t i cn e c r o s i sv i r u s ，i h h n v ) 、 对虾杆状病毒( b a c u l o v i r u sp e n a e i dc o u c h ，b p ) 、斑节对虾杆状病毒( p e n a e u s m o n o d o nb a c u l o v i r u s ，m b v ) 、黄头杆状病毒( y e l l o wh e a db a c u l o - - l i k ev i r u s ， y b v ) 、对虾白斑综合症病毒( w h i t es p o ts y n d r o m ev i r u s ，w s s v ) 、淋巴器官 细小样病毒( l y m p h o i do r g a np a r v o l i k ev i r u s ，l o p v ) 、对虾t a u r a 综合症 病毒( t a u r a sy n d r o m ev i r u s ，t s v ) h ，5 】等，其中白斑综合症病毒是危害最大的 虾病毒之一【6 】。 2 对虾白斑综合症病毒( w hit es p o ts y n d r o m evir u s ，w s s v ) w s s v 是一种有囊膜的环状双链d n a 病毒，属于n i m a v y r i d a e 科， 厦门大学博士学位论文前言 w h i s p o v i r u s 属，具有非常广泛的宿主谱【7 1 ，传染力强，致死率高，是目前己 测序的最大的动物病毒之一。虽然该病毒与昆虫杆状病毒的形态相似，但它的 基因组序列和预测的蛋白质序列与已知的昆虫杆状病毒几乎没有同源性。生物 信息学分析w s s v 所有的o r f s ，发现大部分o r f s 编码的蛋白和数据库中的蛋白 几乎没有同源性，仅有少数基因与其它病毒或生物的已知蛋白质或结构域有较 高的同源性，大部分是一些与核苷酸代谢和d n a 复制有关的酶类【8 】。 w s s v 的结构蛋白主要包括膜蛋白和核衣壳蛋白。v p 2 8 是w s s v 中含量最丰 富的结构蛋白之一，最早由v a nh u l t e n 等从纯化的病毒中分离鉴定，w e s t e r n b l o t 分析显示v p 2 8 定位于w s s v 的囊膜部分【9 】。z h a n g 等通过病毒的d n a 和e d n a 文库，也发现了v p 2 8 基刚1 0 】。进一步研究发现，宿主感染w s s v 后6h 和1 8h 才能检测到低水平v p 2 8 基因和v p 2 8 蛋白，推测v p 2 8 属于w s s v 晚期基因【l 0 1 。 在我们的实时定量p c r 实验中，v p 2 8 基因被用作w s s v 在对虾体内感染复制的 指标。 3 对虾的免疫系统 免疫系统是生物所具有的防御系统，由具有免疫功能的器官、组织、细胞、 免疫效应分子和有关的基因组成，保护机体免受病原体、有害异物等致病因子 的侵害。免疫系统的这种功能是长期进化和适应发展形成的。被称之为半免疫 防御功能的无脊椎动物的免疫系统只生成原始的、非特异性的、半免疫形的防 御系统【1 1 1 。 对虾的免疫是由体壁( 甲壳) 的防护阻挡作用构成机体的第一道防线，当 异物突破第一道防线后或经食道，鳃等与外界相通的器官或体腔进入机体后， 通过血淋巴的循环进行滤过作用【1 2 】，这种滤过作用将异物固定在一定的组织器 官内，以免扩散。最后在血细胞，淋巴细胞，血清免疫因子的联合作用下，这 些部位的病原或异物被杀死，清除或随蜕皮排出体外，达到抗感染或免除疾患 的目的【1 3 l 。对虾的免疫系统主要包括免疫器官、免疫细胞和各种免疫因子。 3 1 免疫器官 3 1 1 甲壳 对虾的甲壳( 体壁) 是覆盖在虾体表面的一层较坚硬的结构，与其它虾类 6 厦门大学博士学位论文前言 相比体壁更薄些，肉眼所见为透明或半透明的。主要的化学成分是几丁质及其 结合钙。对虾的甲壳充当外骨骼，起支持和保护作用，在对虾的非特异性免疫 过程中主要起机械阻挡的作用。 3 1 2 腮 对虾的腮为枝腮型结构。腮腔中充填的和自由流动的是血淋巴，腮腔和腮 丝顶端的囊状结构都可贮存被滤过的物质，血细胞主要位于腮丝中间组织，这 些血细胞正常情况下不游出腮丝腔。 3 1 3 血窦 对虾的血液常被称为血淋巴，主要是因为它是开放式循环，血液和体液混 在一起，合称血淋巴。血淋巴靠三角形的心脏输送到各血窦，对虾血窦的实质 是充满血淋巴的腔。虾的血窦在全身形成网络，进行动静脉血的交换，交换的 过程中异物被限制在血窦中。此时，血细胞的数量会明显增加，吞噬作用也加 强，会表现出炎症反应，吞噬后的产物、毒物等主要通过蜕皮清除。 3 1 4 淋巴器官 相比前两种滤过作用，淋巴器官的滤过作用则表现为专一的滤过杀菌功 能，吞噬后的残余物是通过输出淋巴管被排到肝胰脏。 3 2免疫细胞 3 2 1 血细胞 虾类的免疫功能主要是通过血细胞来完成。它既是免疫细胞的担当者，又 是体液免疫的提供者。关于血细胞的分类和命名，目前尚无统一标准，一般根 据血细胞在光镜下有无颗粒、颗粒多少及颗粒大小分为无颗粒细胞( 透明细 胞) 、小颗粒细胞( 半颗粒细胞) 和颗粒细胞【1 4 】。而无颗粒细胞又具有两种不 同的形态，一种具有巨噬细胞的性质，另一种具有类似淋巴细胞的性质并称之 为浆样细胞【1 5 】。 研究表明，三种血细胞因含有不同的免疫酶而具有不同的免疫功能，其中 无颗粒细胞具有吞噬功能，“浆样细胞”在接受抗原刺激后，在内质网中有免 疫物质合成，并以细胞表面形成泡状突起的方式进行释放。小颗粒细胞具有活 跃的胞吐作用、细胞毒作用、识别异物以及贮存和释放的酚氧化酶原的能力， 是防御反应之关键细胞。颗粒细胞虽无吞噬能力，但同样具有细胞毒作用和释 7 厦门大学博士学位论文前言 放的酚氧化酶原的能力，如用活化的酚氧化酶系统的组分处理可迅速使之发生 胞吐作用并释放出有活性的酚氧化酶参与体液免疫【l6 1 。 3 2 2 淋巴细胞 淋巴细胞指淋巴器官中的血细胞。用w r i g h t 和g i e m s a 染色都可将淋巴细 胞分为3 种：淋巴细胞a 、b 、c 。淋巴细胞a 呈圆形，是最主要的淋巴细胞， 占淋巴细胞总数的6 0 左右，有很强的吞噬活性。淋巴细胞b 呈圆形，成熟后 多为椭圆形，占淋巴细胞总数的3 0 - - 4 0 。淋巴细胞c 是最大的也是数量最 少的一种淋巴细胞，占淋巴细胞总数的5 左右，细胞呈圆形或不规则形，具 有嗜天青颗粒，可释放到细胞外。 3 3 甲壳动物中的各种免疫因子 3 3 1 凝集素 目前一般认为在无脊椎动物体液中不具免疫球蛋白等高度特异性免疫因 子，因此，对外界异物分子不可能通过抗原抗体结合反应来实现。已有的资料 证明，凝集素在对虾等无脊椎动物的体液反应中起着极为重要的作用 1 1 9 】。 甲壳动物的凝集素主要有两种：一种是存在于血清中的可溶性的凝集素； 可以同异物分子表面的糖基决定簇结合，从而导致异物颗粒的凝集；另一种凝 集素分子则存在于透明细胞等血细胞里或结合在细胞膜表面，血细胞可通过这 种凝集分子同异物分子表面进行结合，以便对异物的进一步吞噬或包囊。 进行凝集活动是甲壳动物血淋巴透明细胞的主要免疫机能之一。在对外来 入侵活动进行的识别、防御、凝集、吞噬、包囊及其随后的创伤修复等一系列 反应中，凝集素协同其它各种免疫因子共同发挥作用，在这一过程中，凝集素 的主要作用可能是使血淋巴中的异物分子发生凝集，从而使这些病原体丧失进 一步侵染机体和在组织中扩散的能力，以达到免疫防御的目的【2 0 】。另外，血淋 巴中凝集素还具有重要的调理作用，可以将结合的异物分子传递给血细胞，在 异物分子同血细胞之间进行联结，由血细胞来完成最终的吞噬和灭杀作用，从 而大大增强血细胞的吞噬作用的发挥【2 1 1 。 3 3 2 酚氧化酶( p 0 ) 和酚氧化酶原( p r o p 0 ) 激活系统 酚氧化酶原激活系统( p r o p h e n 0 1 0 x i d a s es y s t e m ) 在无脊椎动物中起着 重要的异物识别和防御功能必2 4 1 。甲壳动物的p r o p o 激活系统是由丝氨酸蛋白 8 厦门大学博士学位论文刖舌 酶和其它因子组成的一个复杂的酶级联系统。当病原体侵入机体后，其结构成 分如细胞壁中的葡聚糖作为非己信号按定顺序激活丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋 白酶随后又激活p r o p o ，将其转变为有活性的p o ，其活性形式是一种能将酚氧 化成醌的氧化还原酶。在没有任何酶催化的情况下，能自发形成最终产物黑色 素。黑色素及其中间代谢产物是高活性的化合物，可能通过抑制胞外的蛋白酶 和几丁质酶而影响微生物的生长。 p r o p o 的激活过程类似于高等动物的补体激活途径，其作用包括释放调理 素、促进血细胞的吞噬和包囊，产生多种因子介导凝集和凝固及产生杀菌物质 等，p r o p o 系统的成分直接参与了动物细胞间的信息传递。1 9 9 1 年，a s p d n 等 从螯虾( p a c i f a s t a c u sl e n i u s c u l u s ) 血细胞中提纯到p r o p o ，该酶原由一条 单一的多肽链构成，同时a s p d n 等从血细胞中还分离出酚氧化酶原激活酶 ( p r o p h e n o l o x i d a s ea c t i v a t i n ge n z y m e ，p p a ) ，该酶是一种丝氨酸蛋白酶， 分子量为3 6k d a ，可通过蛋白水解作用将7 6k d a 的p r o p o 裂解为6 0 与6 2k d a 的两个具p o 活性的酶分子，而商品胰蛋白酶裂解p r o p o 生成一6 0k d a 的酶分 军 2 5 1 j o 以l - d o p a 为受体，检测p 0 催化的产物在4 9 0 n m 的吸光值，即可以了解p r o p o 系统被活化的程度。研究结果表明，p r o p o 系统可以被1 3 1 ，3 一葡聚糖伫2 1 ，脂多 糖( l p s ) 2 6 1 ，肽聚糖( p g ) 【2 7 1 ，胰蛋白，十二烷基硫酸钠，加热或钙浓度下降 所活化【2 引。 p r o p o 系统必须被调节控制，避免系统中活性物质的毒性，特别是p 0 能产 生高毒性中间物。几种能防止p p a 过度活化的蛋白酶抑制剂 2 9 , 3 0 1 和一个能直接 抑制p o 活性的p 0 抑制剂( p o i ) 3 1 , 3 2 1 已在几种节肢动物中被发现。螯虾中最 有效的p p a 抑制剂是p a c i f a s t i n 3 ”，它包括一个含有九个蛋白酶抑制剂亚单位 的轻链( 4 4 k d ) 和一个含有三个转铁蛋白结构域的重链( 1 0 5 k d ) ，两链由一个 肽键连接，形成一种新的蛋白酶抑制剂，命名为p a c i f a s t i n 样的丝氨酸蛋白 酶抑制剂，它存在于许多昆虫中，能抑制p r o p o 系统 3 4 , 3 5 】。九个蛋白酶抑制剂 亚单位彼此同源，并与蚱蜢l o c u s t a 历i g r a t o r i a 的蛋白酶抑制剂同源，它们 都富含c y s ，与其它的蛋白酶抑制剂明显不刚3 3 1 。 3 3 3 溶血素 9 厦门大学博士学位论文前言 关于甲壳动物溶血素的报道较少，仅在对虾、龙虾、蟹等动物内有所发现。 溶血素也是无脊椎动物免疫防御系统中的一种重要的非特异性免疫因子，其作 用可能类似脊椎动物的补体系统，可溶解破坏异物细胞，参与调理【3 6 1 ，并可能 与无脊椎动物体液的杀菌作用以及酚氧化酶原的激活系统有关3 7 1 ，由于其在免 疫防御中发挥着重要的作用，因此其活性也被用来检测对虾等甲壳类动物健康 状况的一项定量指标。 3 3 4 溶茵酶 溶茵酶广泛存在于各种动物的血细胞和血液中，在免疫活动中发挥着重要 的作用。溶菌酶是一种碱性蛋白，主要杀死革兰氏阳性菌，其作用机制主要在 于它能够破坏溶解细菌细胞壁中的肽聚糖成分，作用位点在n 一乙酰葡萄糖胺和 n 一乙酰胞壁酸之间的b - 1 ，4 糖苷键，从而使细菌的细胞壁破损、细胞崩解。 近几年，人们已陆续从中国对虾、日本囊对虾、南美白对虾等体内检测到溶菌 活性因子的存在。 。 3 3 5 抗菌肽 抗菌肽是对原核细胞有特异性抗性的小分子，已被认为是非特异性免疫系 统的重要成分网。d e s t o n m i e u x 从对虾( p e n a e u sv a n n a m e i ) 的血淋巴中分离 3 种不同的抗茵肽，并证明其分子量为5 5 6 6k d ，由颗粒细胞的颗粒合成和 分泌，并对革兰氏阳性菌和真菌具有明显的抗菌活力，而且经微生物刺激后，其 在血浆中的含量明显提耐3 9 , 4 0 】。 3 3 6 最新研究进展 3 3 6 1 血蓝蛋白 血蓝蛋白( h e m o c y a n i n ) 是在软体动物和节肢动物血淋巴中发现的存在于 细胞外，负责氧的运输的一类巨大的蛋白质。在甲壳动物中，这种氧的转运 储藏蛋白在肝胰腺中表达并以很高的浓度定位于血浆中，占了血浆总蛋白的 9 0 9 5 4 1 1 。血蓝蛋白是一种多功能的蛋白，已有报道，这种呼吸色素可以作 为储藏蛋白，渗透物旧和抗菌肽的前体( p r e c u r s o r ) 4 3 , 4 4 1 在体内起作用。近 来研究报告表明，节肢动物的血蓝蛋白不仅是氧的携带者，还可以起到缓解和 调节渗透压，携带蜕皮激素的作用，并且还有可能作为表皮的一部分起作用【4 5 1 。 更重要的是对虾的血蓝蛋白还被证明具有抗病毒活性 4 6 , 4 7 】。 i o 厦门大学博士学位论文 前言 3 3 6 2 受体 3 3 6 2 1t o li 样受体 t l r 因与果蝇的t o l l 高度同源而得名，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分 组成。t o l l 样受体通过与各种病原相关模式分子模式( p a t h o g e na s s o c i a t e d m o l e c u l a rp a t t e r n s ，p a m p ) 的识别和特异结合，广泛参与各种天然免疫应答 【4 引。研究人员已陆续克隆到南美白对虾( l y t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 、斑节对 虾( p e n a e u s m o n o d o n ) 和日本囊对虾( m a r s u p e n a e u s j a p o n i c u s ) 的t l r 【4 9 5 1 1 。 3 3 6 2 2 整合素 i n t e g r i n 是细胞膜表面的一类重要的细胞黏附分子，由不同的qb 亚基组 成的异源二聚体。q 和b 亚基均由细胞膜外区、胞浆区及穿膜区三部份组成。 i n t e g r i n 分子在体内分布广泛，其配基主要有r g d ( a r g g l y a s p ) 、k g d ( l y s g l y - a s p ) 、d l i r l 、d g e a 等短肽序列。i n t e g r i n 不仅介导细胞与细胞间、 细胞与细胞外基质之间的相互作用，还是许多病毒的细胞受体，参与病毒对宿 主细胞的吸附、吸附后感染过程。已发现人肠道弧病毒、腺病毒、人体免疫缺 陷病毒( h i v 一1 ) 等均能利用i n t e g r i n 作为病毒受体或是辅助受体进入宿主细 胞【5 2 , 5 3 1 。 w s s v 的多种结构蛋白也含有i n t e g r i n 的结合配基。l i 等用体外重组表达 的日本囊对虾b i n t e g r i n 细胞膜外功能区对w s s v 基因组m 1 3 噬菌体展示库进 行筛选，结合免疫共沉淀实验证实w s s v 的膜蛋白v p l 8 7 能与b i n t e g r i n 结合。 v p l 8 7 含有两个i n t e g r i n 的结合基序( r g d 和k g d ) 。通过进一步的人工感染实 验发现i n t e g r i n 、i n t e g r i n 的抗体以及人工合成的r g d 三肽能够抑制w s s v 的 感染。因而，l i 等认为对虾中的i n t e g r i n 也参与了w s s v 的感染【5 4 】。 3 3 6 3 小分子g t p 结合蛋白 小分子g t p 结合蛋白家族由r a s 、r h o r a c c d c 4 2 、r a n 、s a r a r f 、r a b 等 亚家族组成，每个亚家族在细胞中起着不同的作用。这些小g 蛋白是依靠它们 的附属蛋白调控的，称为鸟核苷酸交换因子( g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g e f a c t o r s ，g e f s ) ，它可以催化小g 蛋白转换g t p 结合形式，即活化态。当小g 蛋白处于活化态时，小g 蛋白可以和不同的下游效应分子相互作用，进而执行 不同的细胞生理功能。 厦门大学博士学位论文 前言 3 3 6 3 1r a n g t p a s e r a n 是一种主要分布于细胞核内的小分子蛋白质，分子量为2 5k d a 。分子 结构分析表明，该蛋白属于原癌基因r a s 大家族中的一员，因而命名为r a n ( r a s - r e l a t e dn u c l e a rp r o t e i n ) 。h a n 等人发现r a n 基因在抗病对虾中上调 表达，并发现肌球蛋白( m y o s i n ) 与r a n 蛋白存在相互作用，而m y o s i n 与肌 动蛋白( a c t i n ) 存在相互作用，进一步用对虾血细胞吞噬实验证实r a n 蛋白 调控吞噬活性，推测r a n 在抗病毒免疫过程中发挥作用的可能途径之一是 r a n - m y o s i n - a c t i n - 细胞吞噬【5 5 】。 3 3 6 3 2r a b g t p a s e r a b 蛋白是细胞内囊泡运输的分子开关，与其上游调控因子和下游特定的 效应因子相互作用，在囊泡的形成、转运、粘附、锚定、融合等过程中起重要 作用5 6 1 。w u 等人发现在受到w s s v 刺激后对虾的r a b 的表达上调5 7 1 ，并发现r a b 蛋白与肌动蛋白( a c t i n ) 、原肌球蛋白( t r o p o m y o s i n ) 及w s s v 的膜蛋白v p 4 6 6 之间存在相互作用，进一步采用抗体抑制r a b 蛋白和r n a i 抑制r a b 基因的 表达，从两个方面都证明r a b 参与了血细胞的吞噬过程，推测r a b 蛋白参与 抗病毒免疫的可能途径也是通过与a c t i n 的互作，调控血细胞的吞噬活性5 8 1 。 4 实验室建立的三个重要平台 4 1 抑制性差减杂交技术( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 抑制性差减杂交( s s h ) 技术是一种比较和分离不同细胞系、不同组织间或 同一细胞系、同一组织在不同条件下有差别表达基因的方法。其基本原理是以 抑制p c r 为基础的d n a 差减杂交方法。所谓抑制p c r ，是利用链内退火优于链间 退火，比链间退火更稳定，从而使非目的系列片段两端反向重复系列在退火时 产生类似于“锅柄”的结构，无法与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段 的扩增。同时，该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链c d n a 在退 火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链c d n a 使原来在丰度上有差别的 单链e d n a 相对含量达到基本一致。 其基本过程是：抽提两种不同细胞( t e s t e r 和d r i v e r ) 的差异m r n a ，反转录 成c d n a ，用r s ai 或h a ei i i 酶切，以产生大小适当的平头末端c d n a 片段，将 1 2 厦门大学博士学位论文前言 t e s t e re d n a 分成均等的两份，各自接上两种接头，与过量的d r i v e re d n a 变性 后退火杂交，第一次杂交后有4 产物：a 是单链t e s t e re d n a ，b 是自身退火的 t e s t e re d n a 双链，e 是t e s t e r 和d r i v e r 异源双链，d 是d r i v e re d n a 。第一次 杂交的目的是实现t e s t e r 单链e d n a 均等化( n o r m a l i z a t i o n ) ，即使原来有丰度 差别的单链e d n a 的相对含量达到基本一致，由于t e s t e re d n a 与d r i v e rc d n a 序列相似的片段大都和d r i v e r 形成异源双链分子c ，使t e s t e rd n a 中的差异表 达基因的目标e d n a 得到大量富集，第一次杂交后，合并两份杂交产物，再加上新 的变性d r i v e r 单链，再次退火杂交，此时，只有第一次杂交后经均等化和扣除的 单链t e s t e re d n a 和d r i v e re d n a 一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富 集了差异表达基因的c d n a ，产生了一种新的双链分子e ，它的两个5 端有两个 不同的接头，正由于这两上不同的接头，使其在以后的p c r 中被有效地扩增( 图 1 ) 。 本实验室何南海等人利用s s h 技术分析注射微生物悬液的和正常的日本囊 对虾间基因的表达差异，获得了2 5 个可能与免疫相关的基因，其中的8 个基 因是首次在对虾体内发现的，如3 3 6 3 1 中介绍的r a s 相关的核蛋白r a n ( r a s - r e l a t e dn u c l e a rp r o t e i n ，r a n ) 、生长因子结合蛋白g r b 、t g f - b 受 体作用蛋白等等【5 9 】。同样，用抗病对虾和正常对虾进行对比，发现其中的3 0 个基因可能参与了日本囊对虾的免疫反应。而其中的2 2 个基因( 或片段) 是 第一次在对虾中报道，如u b i q u i t i n 蛋白以及一些与高等动物的补体和细胞因 子具有一定同源性的基因( 片段) 【砌。3 3 6 1 中的血蓝蛋白、3 3 6 2 2 中 的i n t e g r i n 以及3 3 6 3 2 的r a b 也都是在s s h 结果中发现的。 厦门大学博士学位论文 前言 h 嘲蒯 幢岬1 翻_ 柚从伸i h 一哪t - 舢柚岫麓 e = , l = = 知= ：= = i 二= = = = = b 田 r 叫 固【毫= 南 固【= = 团 三三 团呻 回暑立= = = j n - - _ 。 l c im - - 3 。 团 三 i 一一 【3 l _ i _ i i 。 一：产- _ i _ _ 吒：_ r - - _ - i 叫二l i ) _ _ - _ - i 二：卜_ _ i _ _ - h - h a p h 一- p c r 0 棚憎轴 d 撕 呷岫- 二) b f 蝴籼一钾麒删 0u 枷 啊懈o j l - - 霄 _ _ _ _ _ 亡l ：1 啊喇_ _ - - - 一 u n d 亨【 - - - e a f _ 图i - s s h 操作示意图( c l o n t e c h ) 4 2 噬菌体展示技术( p h a g e d i s p i a yt e c h n o l o g y ) 噬菌体展示技术是1 9 8 5 年由s m i t h l 6 1 】建立。噬菌体展示技术是将目的基因 与编码噬茵体衣壳蛋白基因相连接，并插入到噬菌体表达载体上，使多肽以融 合蛋白的形式展示在噬菌体表面，被展示的多肽可保持相对独立的空间结构 和生物学活性。将展示文库( 即噬菌体展示肽库和噬菌体展示抗体库) 作为流动 相，将与预选择的融合蛋白有特异亲和力的靶物质固定在一个固相载体上，洗 去不能与固定相特异结合的蛋白，而将特异结合的蛋白洗脱下来，再进一步扩 增，进入下一轮淘筛( 图2 ) 。 1 4 量一 厦门大学博学位论! 噬菌体展示技术的操作路线便是通过p c r 方法获得目的基因如抗体全套 可变区基因，将扩增产物通过酶切连接反应重组到噬苗体载体，并通过与噬菌 体外壳蛋白形成融台蛋白，把目的基因如f a b 段，单链抗体s c f v 表达在噬菌体 表面，然后通过淘筛筛选出特异性蛋白最后通过大肠杆菌表达系统表达出特 异性蛋白。噬菌体展示技术的一个重要构成是噬苗体载体，有许多种噬菌体可 以作为载体运用于噬菌体展示：丝状噬菌体、x 噬菌体、t 4 噬菌体、t 7 噬菌体 6 瑚】。本实验杨海杰构建了日本囊对虾c d n a 的t 7 噬菌体展示库，可用于蛋白 相互作用的研究。 f f 【觋 垒垒q 壁q q 壁垒垒堂壁垒 t r a d e a c h d 目l _ 帅- d s e m n t e t