（农业生物环境与能源工程专业论文）诸葛菜组培苗生长的动态监测及激素的影响.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 由于国内外对组培苗及其根系在无菌状况下的定量描述甚少，而激素又是公 认为影响组培苗生长和光合作用关键因素之一，适宜的激素配比直接影响到组培 苗工厂化运行。在利用图象处理的技术无菌动态的检测组培苗及其根系的生长和 在改进在线检测光合速率的方面，做了一些基础性和开拓性的探讨。本研究的主 要内容包括如下： 1 由于组培苗生长的环境很特殊，它的根系生长发育状况很难动态的监测。 为了在无菌状况下动态地监测组培苗根系生长情况，利用图象处理技术对组培苗 根系图片进行了分析，获取图象分析长度，分析图象分析长度值偏小原因，得出 修正模型s = h r l 。相关性分析表明，根的图象分析长度与人工测量长度具有极好 的线性相关关系( r 2 = 0 9 9 3 ，n = 2 2 ，p o 0 0 1 ) 。可以用l o g i s t i c 方程来拟合图象分析 长度观察值，得到图象分析长度y 与时间x 的指数方程为y = l ( 1 a + d c o x ) ) ，a 值代 表组培苗根系的最大生长长度，b 值代表指数增长系数。 2 由于组培苗生长的环境不同于一般的大田植物，对它的生长发育情形了解 甚少。为了无菌动态地描述组培苗生长发育情况，利用图象处理技术对组培苗地 上部分图片进行分析，获取图象分析生物量。相关性分析表明，利用两参照物获 取的组培苗图象分析生物量与人工测量生物量具有极好的线性相关关系 ( r 2 = 0 9 1 0 8 ，n = 2 9 ，p 0 0 0 1 ) 。也可以用l o g i s t i c 方程来拟合图象分析生物量观察值， 得到图象分析生物量y 与时间x 的指数方程为y = l ( 1 a + d c o x ) ) ，a 值代表组培苗的 最大生长量，b 值代表指数增长系数。 3 设定7 组不同浓度的n a a 和6 - b a 配比对诸葛菜组培苗光合作用的影响。 通过对组培苗的自养能力、羧化效率、暗呼吸速率等指标的考察，得出0 1 m g l d n a a + 2 m g l 一6 b a 的激素配比使得诸葛菜组培苗的自养能力达到最大值为2 0 9 4 1 u m 0 1 k g 1 m i n 1 ，羧化效率达到0 0 2 9 且暗呼吸速率达到最大为3 8 4 0 u m 0 1 k g - 1 m i n 一；0 1 m g l dn a a + 2 m g l 。16 - b a 的激素配比被认为是影响诸葛菜组培苗 光合作用的最优激素配比。 4 利用图象处理的方法可以无菌动态地监测组培苗根系的生长发育获取组培 江苏大学硕士学位论文 苗根系的对数生长期。1 2m s 加入0 0 5m gl 。1n a a , 0 5m gl 1i b a 和0 0 0 3m gl 。1 g a 3 的激素配比使得诸葛菜组培苗根系形成时间最早为1 0 6 5 天以及根系在对数 生长期内生长速率最大为2 1 0 3 ，通过对组培苗根系形成时间和根系在对数生长期 内的生长速率的比较，得出诸葛菜组培苗根系生长的最优激素配比1 2m s 加入 0 0 5r a gl dn a a , 0 5m gl 1i b a 和0 0 0 3 m gl g a 3 。 5 利用图象处理的方法可以无菌动态地监测无根组培苗的生长发育获取组培 苗的对数生长期。m s 培养基中加入o 1 0m g l 。1 n a a 和2 0 0m g l 6 b a 的激素配比 使得诸葛菜组培苗长势很好而且生长量达到最大，对数生长期持续的时间为1 9 6 6 天且在对数生长期内指数增长系数最大为0 9 1 3 。通过不同的激素配比对诸葛菜组 培苗的对数生长期持续的时间、对数生长期内的指数增长系数以及最大生长生长 量的比较，得出适合诸葛菜组培苗生长发育的最佳激素配比为m s 培养基中加入 0 1 0m g l 。1 n a a 和2 0 0m g l 6 b a 。 关键词：激素，图象处理，动态监测，光合作用，对数生长期，指数增长系数， l o g i s t i c 方程 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t a sa th o m ea n da b r o a do n ，p l a n t l e t nv i t r oa n di t sr o o t sa r er a r e l yd e s c r i b e d q u a n t i t a t i v e l yi ns t e r i l ec o n d i t i o n s ，p l a n th o r m o ni sa l s or e c o e n i z e da so n e o ft h ek e y f a c t o r sw h i c ha f f e c t st h eg r o w t ha n dp h o t o s y n t h e s i so fp l a n t l e ti nv i t r o ，t h ea p p r o p r i a t e h o r m o na s s e m b l yd i r e c t l yi m p a c t so nt h ec o m m e r c i a lo p e r a t i o no fp l a n t l e ti nv i t r o t h i s s t u d y , w h i c hw a si nt h eu s eo fi m a g ea n a l y s i st e c h n o l o g i e ss t e r i l ed y n a m i cm o n i t o r i n go f p l a n t l e t i nv i t r oa n di t sr o o tg r o w t h ，i m p r o v i n go n - l i n et e s t i n go nt h eb a s i so f p h o t o s y n t h e t i cr a t e ，h a sd o n es o m eb a s i ca n dp i o n e e rd i s c u s s t h em a i nc o n t e n to ft h i s s t u d yi n c l u d e s t h ef o l l o w i n g ： 1 a st h ee n v i r o n m e n to fp l a n t l e ti nv i t r og r o w t hi sv e r ys p e c i a l ，i t sd i f f i c u l tt o g r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fr o o t sd y n a m i cm o n i t o r i n go ft h es i t u a t i o n 。i m a g ea n a l y s i s l e n g t ho fp l a n t l e ti nv i t r or o o ti sm e a s u r e da n dd e s c r i b e dd y n a m i c a l l yt h eg r o w t ha n d d e v e l o p m e n tu n d e rs t e r i l i z e dc o n d i t i o n ，i sa c q u i r e dt h r o u g ht h ea n a l y s i so nt h ei m a g e f r o mp l a n t l e ti nv i t r or o o t a n a l y s i st h er e a s o nf o ri m a g ea n a l y s i sm a s st o os m a l l ，g a i n c o r r e c t i v em o d e l ：s = h r l t h er e s u l tf r o mc o r r e l a t i o na n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e p l a n t l e ti nv i t r oi m a g ea n a l y s i sl e n g t ho fr o o ta p p e a r e das i g n i f i c a n tp o s i t i v el i n e a r c o r r e l a t i o nw i t hi t sm a n u a ll e n g t h ( r 2 = 0 9 9 3 ，n = 2 2 ，p 0 0 0 1 ) t h el o g i s t i ce q u a t i o n m a yf i tf o rt h eo b s e r v e dv a l u ef r o mt h ep l a n t l e ti nv i t r oi m a g ea n a l y s i sl e n g t ho fr o o t i m a g ea n a l y s i sl e n g t ho fy a n dt i m exi n d e xe q u a t i o ni sy = 1 ( 1 a + d ( b ) ) ，w h e r ea v a l u em e a n st h eb i g g e s tg r o w t hl e n g t ho fp l a n f l e ti nv i t r or o o t s ，a n dbv a l u em e a n s e x p o n e n t i a lg r o w t hf a c t o r 2 a st h ee n v i r o n m e n to fp l a n f l e ti nv i t r og r o w t hi sd i f f e r e n tf r o mt h eg e n e r a lo f t h ed a e j e o np l a n t , i t sg r o w t ha n dd e v e l o p m e n ts i t u a t i o ni sk n o w nv e r yl i t t l e i m a g e a n a l y s i sm a s so fp l a n t l e t nv i t r oi s u s e dt om e a s u r ea n dd e s c r i b ed y n a m i c a l l yt h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n tu n d e rs t e r i l i z e dc o n d i t i o n ，w a sa c q u i r e dt h r o u g ht h ea n a l y s i s o nt h ei m a g ef r o mp l a n t l e t nv i t r o t h er e s u l tf r o mc o e l a t i o na n a l y s i si n d i c a t e dt h a t t h ep l a n t l e ti nv i t r oi m a g ea n a l y s i sm a s s ，w h i c ho b t a i n e df r o mt w oc o n t r o l s ，m a n i f e s t e d as i g n i f i c a n t p o s i t i v e l i n e a rc o r r e l a t i o nw i t hi t sm a n u a lm a s s ( r z = 0 9 1 0 8 ，n = 2 9 ， p 0 0 0 1 ) t h el o g i s t i ce q u a t i o nm a y f i tf o rt h eo b s e r v e dv a l u ef r o mt h ep l a n t l e t nv i t r o i m a g ea n a l y s i sm a s s i m a g ea n a l y s i sm a s so fy a n dt i m exi n d e xe q u a t i o ni sy = 1 ( 1 a + d ( b ) ) ，w h e r eav a l u em e a n st h eb i g g e s tg r o w t hm a s so fp l a n t l e t nv i t r o ，a n db m 江苏大学硕士学位论文 v a l u em e a n se x p o n e n t i a lg r o w t hf a c t o r 3 t h eg r o w t ho fp l a n t l e ti nv i t r or e l i e so i lp h o t o s y n t h e s i st op r o v i d ei t so w l l e n e r g y ，p h o t o s y n t h e s i s o f p l a n t l e t nv i t r od i r e c t l y a f f e c t si t so w ng r o w t ha n d d e v e l o p m e n t ，a n dp l a n th o r m o n i sa ni m p o r t a n tf a c t o rw h i c ha f f e c t e dp h o t o s y n t h e s i so f p l a n f l e t nv i t r o t h ea u x i na s s e m b l yo f0 1 m g l 。1n a aa n d2 m g l 16 - b am a k e s p h o t o s y n t h e t i cr a t eo fo r y c h o p h r a g m u sv i o l a c e u sp l a n t l e ti nv i t r or e a c ht h em a x i m u m f o r2 0 9 4 1u m 0 1 k g - 1 m i n 1 ，c a r b o x y l a f i o ne f f i c i e n c yr e a c h0 0 2 9 ，a n dd a r kr e s p i r a t i o n r a t er e a c ht h em a x i m u mf o r3 8 4 0u m 0 1 蚝一1 m i n 一1 ；t h ea u x i na s s e m b l yo fo 1 m g l 吐 n a aa n d2 m g l 6 - b ai st h em o s ta d v a n t a g e o u sf o rp h o t o s y n t h e s i so fo r y c h o p h r a g m u s v i o l a c e u sp l a n t l e ti nv i t r o 4 t h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o do fr o o ti ns t e r i l i z e dc o n d i t i o nw a sa c q u i r e db y a n a l y z i n gt h ei m a g ef r o mp l a n t l e t nv i t r or o o t s t h ee a r l i e s to c c u l t e l l c et i m eo fr o o t si s 1 0 6 5d a y sa n dg r o w t hr a t ed u r i n gt h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o do fr o o t sr e a c h e st h e m a x i m u mf o r2 1 0 3 c m d a y ，w h i c hr e s u l t e df r o m1 2m sm e d i u ms u p p l e m e n t e d 丽t h 0 0 5m g1 。1n a a , 0 5m g1 1i b aa n d0 0 0 3m gl - lg a 3 。t h r o u g ht h ep l a n t l e ti nv i t r or o o t f o r m a t i o nt i m ea n dg r o w t hr a t ed u r i n gt h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o do fr o o t so f c o m p a r i s o n ，t h ea u x i na s s e m b l yo f0 0 5m g i 1n a a , 0 5m gi 。1i b aa n d0 0 0 3m g1 1 g a 3 i st h em o s ta d v a n t a g e o u sf o rr o o tg r o w t ho fo r y c h o p h r a g m u sv i o l a c e u sp l a n t l e ti n v i t r o 5 t h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o do fp l a n t l e t nv t r oi ns t e r i l i z e dc o n d i t i o nw a s a c q u i r e db ya n a l y z i n gt h ei m a g ef r o mp l a n t l e t i n v i t r o o r y c h o p h r a g m u sv i o l a c e u s p l a n t l e t nv i t r og r o w nv e r yw e l la n dg r o w t hr e a c h e dt h em a x i m u m ，t h ed u r a t i o nt i m eo f t h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o dw a s1 9 6 6d a y s ，a n dt h em a x i m u me x p o n e n t i a lg r o w t h f a c t o rd u r i n gt h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o dw a su pt o0 9 1 3 ，w h i c hr e s u l t e df r o mm s m e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h0 1 0m e ：。1 n a aa n d2 0 0m e ：。1 6 - b at h r o u g hi nv a d o u s a u x i na s s e m b l yo ft h ed u r a t i o nt i m eo ft h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o d ，o fe x p o n e n t i a l g r o w t hf a c t o rd u r i n gt h el o g a r i t h mg r o w t hp e r i o d ，o ft h em a x i m u mg r o w t hm a s so f c o m p a r i s o n ，t h ea u x i na s s e m b l yo f0 1 0m g l 1 n a aa n d2 0 0m g l 6 - b ai st h em o s t a d v a n t a g e o u sf o rg r o w t ho fo r y c h o p h r a g m u sv i o l a c e u sp l a n t l e t nv i t r o k e yw o r d s ：a u x i n ，a n a l y s i so nt h ei m a g e ，d y n a m i cm o n i t o r i n g ，p h o t o s y n t h e s i s ，t h e l o g a r i t h mg r o w t hp e r i o d ，e x p o n e n t i a lg r o w t hf a c t o r ，l o g i s t i ce q u a t i o n i v 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文 的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密函。 学位论文作者签名：啤擗指导教师签名： 泛双 v 咣年6 月1 5 日7 呓年易月侈日 独创性声明 本人郑莺声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：许爻力平 日期：矿年6 月多日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 随着我国人民生活水平日益提高，人们对花卉、药材等优质种苗的需求逐渐增 加，从而促进了组培育苗技术的发展和规模化、集约化、专业化的组培苗大量快速 繁殖的生产需求。目前，由于无菌动态监测手段的缺乏，人们不能定量地分析微环 境因素对组培苗生长和光合作用的影响，无法动态地描述组培苗生长发育情况，严 重制约着组培育苗生产的进一步发展。而激素是影响组培苗生长及其光合作用的关 键因素之一，适宜的激素和对应的浓度配比能促进组培苗及其根系的生长发育。因 此，有必要对影响组培苗生长和光合作用的激素和组培苗及其根系的生长发育情况 进行研究。 1 1 植物组织培养与育苗技术在生物工程中的地位与应用 目前，植物组织培养在遗传育种、种质资源保护、组培脱毒快繁等方面得到广 泛应用n 1 。植物细胞在分子水平上的研究，如细胞器移植、基因工程、蛋白质工程 等，将为植物细胞工程的研究注入新的活力，这将使植物组织细胞培养技术的研究 和应用向更新、更高的水平发展。在组培快繁方面，由于采用组织培养技术生产的 种苗不仅成功地实现了病原菌脱毒，同时也实现了具有优良遗传特性的高品质苗的 周年循环生产，因此，许多重要的园艺作物( 如兰、草毒、甘薯等) 、工艺作物、药 用植物以及造林用树木等种苗的大量快繁基本上都实现了组织培养。自2 0 世纪8 0 年代以来，以商品化为目的的组培苗生产以2 0 - - , 3 0 的速度逐年递增乜1 。植物产生 新个体的繁殖方式有多种，但基本可以分为两类：一类是有性繁殖；另一类是无性 繁殖。植物的无性繁殖在人类的经济生活中占有极其重要的地位。无性繁殖在保持 异交植物的优良种性，在后代整齐一致方面，具有有性繁殖无法比拟的优点。将植 物组织培养技术用于植物的无性繁殖，形成了一种新型的无性繁殖育苗方法，一般 称为组培育苗n 1 。组培育苗技术是植物组织培养在生产上应用最成功、最广泛的领 域。植物的快速繁殖是采用生物工程技术中的植物组织和细胞培养技术，在一定的 时间内从一个外植体( 用于植物组织培养的离体组织、器官或细胞，称为外植体。 外植体包括茎尖、根、茎、叶、花器官以及它们形成的体细胞胚等材料) 繁殖出比 江苏大学硕士学位论文 常规繁殖多几百倍，甚至千万倍与母体遗传形状相同而且健康的小植株，其标准可 达到大田生产种苗的要求。与常规无性繁殖相比，组培快繁育苗具有很多优势，如 繁殖系数大、繁殖速度快、组培苗整齐一致、能获得脱毒幼苗、组培苗能完善表达 母本的全部遗传信息，保持基因的同一性和一致性。组培育苗的这一特性有如下应 用：使得有现代生物基因工程获得的新品种的大量稳定繁殖、大规模推广应用成为 可能；可以大大简化繁杂的育种制作过程，降低育苗成本。 组培快繁育苗已成为植物良种繁育的重要手段，组培苗在园艺、农业和林业中 的运用正日益广泛和深入口3 。但组培苗生长的环境是非常特特殊的，目前，还无法 精确获悉组培苗在动态条件下生长发育的情况，这为组培苗工厂化带来很大的障 碍。 1 2 根系检测方法的研究进展 对植物根系测定方法的研究国内外已经有相关的报道了，大致可以归纳为( 1 ) 直接测量法：( 2 ) 网格交叉法：( 3 ) 根长测定仪：( 4 ) 图象分析法。如郑纯辉等人( 2 0 0 4 ) h 1 在基于地理信息系统的植物根系分析方法一文中提出了应用地理信息系统软件 ( a r c i n f o ) 借助图象处理的方法来分析根系，使对根长和根的面积测量避免了人为 因素的干扰精确度得以提高；近几年，国外已经成功地把图象处理软件应用到对野 外植物根系生长发育状况的检测，如：美国的b e n j a m i n 等人( 2 0 0 4 ) 陆3 提出了把豌 豆的根系从地下取出洗净，应用扫描仪获取根系图片然后利用图象处理软件分析得 出豌豆根系的表面积；奥地利的h i m m e l b a u e r 等( 2 0 0 4 ) 畸1 用两种不同的图象分析 系统测量根的长度、直径以及表面积，提出了通过扫描图象再加之应用r o o t e d g e 和v i n r i - i i z o 两种软件进行图象分析，并与人为的直接测量进行比较，得出了对于 根长的测量人为的直接测量和图象分析处理相差不大，而对于根的直径测量图象分 析的精度就很高同时w i n r h i z o 软件在根系的直径上分析效果比r o o t e d g e 更好， 但都不适宜高速扫描，使之误差增大；又如芬兰的v a n n i n c n ( 2 0 0 0 ) n 1 通过动力学 的间隔流动分析了根系的存活率和死亡率，其中如果根系的腐烂速率和活根的生长 趋势知道，那么我们可以通过他们之间的关系间接地求出根系的死亡率和总的生长 率：再如日本的k i m u r a ，( 幺0 0 1 ) 跚对已洗的根系通过n i h 图象处理方法测量根系的 长度和直径提出了根系的直径大小与根序成反比，即根序越高根的直径越小。 2 江苏大学硕士学位论文 国内外对组培苗根系生长发育状况的检测主要是依靠肉眼观察或人为破坏性 检测，无法动态地描述组培苗的生长发育状况。如杨振德等人( 2 0 0 3 ) 阳1 对百部组织 培养中不定根的诱导中对百部组培苗的根系检测分析了其根系的根数和平均根长 都是在人为的肉眼观测和游标卡尺的度量得出：又如韦梅琴等人( 2 0 0 4 ) n 伽在三种植 物生长调节剂对蒲公英试管苗生根影响中所述采用游标卡尺对组培苗根的直径测 定。利用图象处理技术对组培苗的根系进行检测目前还未见到有此相关报道。 1 3 组培苗检测方法的研究进展 传统组培苗检测方法和根系一样都是通过人为破坏性测量而获得，利用图象处 理技术获得组培苗生长参数值目前鲜有报道，图像处理技术已广泛地应用到生物学 的研究和农业生产中n 1 1 刀。在植物的组织培养的研究中，图像处理技术已经被用来 微繁小植株、细胞和组织生长的评估以及逆境对组织培养物生长的影响的监测n 如 悖1 。s m i t h 等人利用图像处理技术无菌检测生长在试管中的组培苗的生长和发育， 以及盐分逆境对组培苗生长发育的影响啪3 ；o l o f s d o t t e r 利用图像处理技术无菌检测 生长在培养皿中的胡萝卜的愈伤组织的生长n 引；i b a r a k i 和k e n j i 利用图像处理技术 无菌检测和评价悬浮培养的细胞生长状况位；s u p a l k o v a 等利用包括图像处理技术 在内的众多技术手段检测云杉体细胞胚状体的生长发育受到重金属污染物的影响 陇1 ；b u e n r o s t r o n a v a 等甚至利用图像处理技术来监测生长在培养皿中的培养物的基 因表达呦1 。赵玉国等人嗍1 在植物组织培养试管苗无菌检测技术一文中提出了利用图 象处理技术获得组培苗生长质量，使得组培苗在无菌生长的状态下其生长的质量被 检测出，但该方法的精度不高且受组培苗自身的制约。目前，国内外将图像处理技 术应用在对组培苗的生长发育动态过程的监测则很少。 1 4 激素对组培苗光合速率影响的研究进展 由于在小容器内测定光合作用难，在大田内使用的光合速率测定系统无法在此 测定，且激素对大田植物的光合作用的影响已经有了相关报道，江力等人乜5 1 用6 一 苄基腺嘌呤( 6 b a ) 和脱落酸( a b a ) 两种激素分别处理烟草，发现加入6 - b a 的 烟草瞬时光合速率得以提高而且延长了烟草的光合功能期，而加入a b a 的烟草瞬 时光合速率反而下降而且光合功能期大大的缩减；徐铠等人啪1 在对盐胁迫下的草莓 3 江苏大学硕士学位论文 施加赤霉素和水杨酸时发现，赤霉素和水杨酸可以缓解草莓的盐害，有助于提高在 盐胁迫下草莓的净光合速率以及增加叶绿素含量；k u m a r 等人乜7 3 在对干旱条件下的 棉花施加外源激素吲哚乙酸( i a a ) 、赤霉素( g a 3 ) 和铲苄氨基嘌呤( b a p ) 可 以提高棉花的净光合速率以及羧化效率；p a n d e y 等人例在对干旱条件下的棉花进 行研究时也得到相似的结果，且加入外源激素a b a 和乙烯( e t h ) 时却降低棉花 叶片气孔导度减小棉花叶片的气体对外交换能力，降低了在干旱条件下棉花的净光 合速率；s i n g h 等人船叫在高温条件下对西红柿施加外源激素表油菜素内酯( e b r ) 时发现外源激素e b r 不仅可以提高高温条件下西红柿的净光合速率而且还可以促 进西红柿组培苗的生长发育；m u l l i g a n 等人侧在对p h a s e o l u sv u l g a r i sl 植物进行研 究时发现施加外源激素g a 。可以提高该植物的净光合速率并解释了因为g a 3 可以提 高p h a s e o l u sv u l g a r i sl 植物茎干的同化作用的运输以至可以增大植物的净光合速 率；一般来说，外源激素6 - b a 、g a 3 、n a a 、i a a 可以阻止植物体叶绿素的减少， 而乙烯和a b a 可以加速植物体叶绿素的减少口。而o u z o u n i d o u 等人口2 3 发现外源激 素g a a 和i a a 在对向日葵处理时确实可以提高向日葵的光合作用并且降低铜元素 对向日葵的毒害作用。但是，激素对组培苗光合作用影响的研究相关的报道甚少。 1 5 激素对组培苗根系影响的研究进展 人们对吲哚丁酸( i b a ) 、n a a 、g a 3 这三种激素对植物根系影响的研究可以 追溯到上世纪3 0 年代3 | ，i b a 作为一种天然的生长激素已经广泛地运用到促进植 物的生根研究当中n 引。目前国内外对组培苗根系的影响因子的研究大多集中在组培 苗根系所需要的激素上。而影响组培苗根系的激素种类也颇多有n a a 、i a a 、生 根粉( a b t ) 、多效唑( m e t ) 、a g n 0 3 、i b a 、乙烯等纠。p a n 和g u i 报道中指 出植物根部可以分泌出g a 3 随着浓度的升高生根的数量也在增加h 2 l ；针对不同的 组培苗激素的影响是各异的，激素的配比也因组培苗的不同而差异很大。i b a 对许 多的植物的根系的诱导效果都比i a a 强阻3 ”，如i b a 在处理苹果组培苗生根所需最 合适浓度1 0 0 m g l h 4 1 而i b a 处理猕猴桃组培苗生根所需要的最合适浓度在 0 7 m g l m 。有些组培苗在生根时单独使用一种激素比混合使用多种激素的效果显 著汹1 ，而有些组培苗多种激素的混合使用却比单独使用任何一种激素效果更加明显 e 4 7 4 江苏大学硕士学位论文 1 6 激素对组培苗生长影响的研究进展 ， 组织培养技术经过将近一个世纪的发展，变得更加成熟化、普及化。而作为影 响组织培养技术的关键因素之一的激素对组织培养技术的发展起了至关重要的作 用。对植物的组织培养来说，施加的激素种类和浓度的不同，组培苗生长也是各异 的。而影响组培苗生长的激素大部分为n a a 、6 b a 、i b a 、i a a 、二氯苯氧乙酸 ( 2 ，4 。d ) 等在k a m o 等人的报道中指出在培养基中加入n a a 可以形成组培苗的 不易碎的愈伤组织啪1 ：而在s t a d e n 的报道中n a a 是不能促进芽的增殖m 1 ，在 e p a m i n o n d a s 的报道中6 - b a 与玉米素( z t ) 的混合使用可以促进组培苗芽的增殖 酬；但对于不同种植物6 - b a 对其的影响差别很显著，在v i e i t e z 等人的报道中6 - b a 的使用是不能促进q u e r c u sr u b r a 组培苗芽的增殖的陆，而在r o m a n o 等人的报道中 6 一b a 的使用却能够促进o u e r c u ss u b e r 组培苗芽的增殖的哺副。 1 7 本研究的目的和内容 随着人们对组织培养技术的不断深入研究，对组培苗的需求也日益增大，组培 苗的工厂化、商业化进程正在不断的完善，而组培苗生长发育和光合作用的好坏是 影响组培苗工厂化进程的最关键的因素，激素作为对组培苗生长和光合作用的最大 影响因素之一一直被人们所关注。本研究在总结相关的研究基础上，致力于研究激 素对诸葛菜组培苗生长和光合作用的影响以及进一步优化组培苗光合速率的测定 方法等问题，尝试新的思路和研究方法：开辟了利用图象处理方法检测组培苗及其 根系动态的生长发育状况，建立组培苗及其根系在动态无菌条件下的生长发育模型 的新篇章，同时也在动态无菌的条件下获取了组培苗生长的质量和组培苗根系生长 的长度。通过激素对组培苗生长和光合速率的影响，找到有利于诸葛菜组培苗生长 发育的最佳激素配比，以达到在今后工厂化育苗时降低成本增加效益。 本研究的主要研究内容包括： ( 1 ) 利用图象处理技术对组培苗根系进行无菌动态地监测，试图证明把图象 处理技术应用到对组培苗根系的无菌动态监测是可行的。 ( 2 ) 利用图象处理技术对无根组培苗进行无菌动态地监测，获取组培苗在无 菌状况下的生长量，试图证明利用图象处理技术对组培苗进行无菌动态的监测的可 5 江苏大学硕士学位论文 行性。 ( 3 ) 设置不同的激素配比研究激素对诸葛菜组培苗光合作用的影响，通过比 较激素对光合速率、羧化效率、暗呼吸速率等参数值的影响，找到有利于诸葛菜组 培苗光合作用的激素配比。 ( 4 ) 设置不同激素配比研究对诸葛菜组培苗根系生长的影响，通过激素对诸 葛菜组培苗根系形成的时间以及在对数生长期内的生长速率的参数值影响，找最有 利于诸葛菜组培苗根系生长的激素配比。 ( 5 ) 设置不同的激素配比研究激素对诸葛菜组培苗生长的影响，通过激素对 组培苗的最大生长量、对数生长期持续的时间以及在对数生长期内的指数增长系数 的参数值影响，找到最有利于诸葛菜组培苗生长的激素配比。 6 江苏大学硕士学位论文 第二章组培苗根系的无菌动态检测方法 组织培养技术是目前对植物资源的一种有效的繁殖技术。无菌动态地描述组培 苗根系的生长发育状况对组培苗的工厂化、商业化的进行起着举足轻重的作用。培 养基的筛选、环境条件的调控、定单花卉的生产都需要掌握组培苗根系的生长发育 规律，了解外在因素对组培苗根系的生长发育的影响。依靠肉眼观察或人为破坏性 检测已经无法动态地描述组培苗根系的生长发育状况。鉴于此，国内外学者把目光 转移到利用图像处理技术来无损、无菌监测组培苗根系的生长。 图象处理技术通过四十多年的发展已经成功地应用到工业、农业、林业等各个 行业中n 。目前，把图象处理的技术应用到农业中主要是对植物的根系检测嵋3 蠕3 、 水果 1 1 - 1 4 、茶叶n 鄙等品质检测等的研究上。在植物的组织培养中，图象处理技术的 应用主要是对植物细胞的探测n 8 1 和晶胚数量的检测n 引，而对组培苗应用图象处理技 术则很少汹厨1 ；目前，国内外对组培苗根系生长发育状况的检测主要是依靠肉眼观 察或人为破坏性检测，无法动态地描述组培苗的生长发育状况。近几年，国外已经 成功地把图象处理软件应用到对野外植物根系生长发育状况的检测，如：美国的 b e n j a m i n 畸1 等人提出了把豌豆的根系从地下取出洗净，应用扫描仪获取根系图片然 后利用图象处理软件分析得出豌豆根系的表面积；奥地利的h i m m e l b a u e r 1 等人用 r o o t e d g e 和w i n r h i z o 这两种不同的图象分析系统测量根的长度；日本的 k i m u r a 哺3 对已洗的根系通过n i h 图象处理方法测量根系的长度。而对组培苗根系的 生长发育状况无菌动态监测目前还是一片空白，制约了组织培养技术的发展，严重 影响组培苗工厂化、商业化运行。把图象处理软件应用到对组培苗根系的研究目前 还尚未见到有此报道。本研究利用图象处理软件对组培苗根系的图片进行图象分 析，获取组培苗根系长度，并与人为破坏性测量相比较，证明把图象处理软件应用 到对组培苗根系的检测是可行的，且真正意义上实现了组培苗根系在无菌动态的条 件下生长发育状况的监测。 2 1 材料和方法 2 1 1 材料 试验在江苏大学农业工程研究院的人工气候室内进行，室内温度、湿度及c o 。 7 江苏大学硕士学位论文 浓，叟均l u 涮。一! 内珏矗度控制祚2 5 ( ) 5 c ，( ：( ) ：浓度控制祚3 6 0um 0 1 m 0 11 ，窄4t 湿 度控制为4 5 t y o 。供试材料为诸葛菜纠l 培l i o 组培瓶玻璃制作的1 2 0 m i i 角培养瓶， 透光率人j ：8 5 。试验采川的赴普通l j 光灯卜培养的诸葛菜身i 培t ! j i ，光川期为光1 4 h ，暗1 ( ) h ，培养基为含： 糖m s 培养雎。 2 1 2 实验方法 2 1 2 1参照物的设置 取段7c m | j ：= 的| ， 线放置j ：盛仃生根培养桀的匀【培瓶 j ，以此作为根系图像 分析的参照物如图2 - 1 所示。 幽21纰培m 楸系i j 参_ 物对j c _ i 图 2 1 2 2 图像的获取和分析 墩4 i ， 长阶段的乍根纰土f l f l f f ，o = j 已改r 的参照物放置m d 水平f 征骨i ：进 j ： 拍照，利川5 0 0 ，像素的k o d a k 数码4 1 i 机对这螳楸系进 j ：拍照，保持物趴和；l7 7 c m ， 从4 i i l d 的们度进 j ：抽j ! c i 扶墩纰培1 i i f 根系l 刽”，利川图像分析软件s i g m a s c a npr ，扶 取它们的像素点祟积足i i 离。如i 劁2 2 所，j j ，红色轨迹即为通过s i g m a s c a np r o 分析 软件所袭针木的像索j _ 累移i 离。 像素点累积距离町从s ig m a s c a np r o 分析软件得h 的每。小段的像素点趴离求 和而得j i ：，如卜罔2l 参照物l ，i 线和组培l i i i 根系的每小段的像素点皿i 离如表2 。l 臣 江苏大学硕士学位论文 所示。 图2 - 2 纰培苗像索点累积距离图片 袭2 - 1 参照物和组培莆根系的每段像素点距离的原始数据 1 9 3 7 7 8 7 3 6 7 1 1 6 4 8 8 5 9 8 8 1 2 3 0 0 1 1 3 2 3 9 7 7 5 5 6 2 9 6 8 1 1 3 5 7 参照物( 白线) 的像9 9 4 1 2 8 素点累积距离 1 8 1 l l 3 1 7 6 5 3 3 0 6 i 7 7 8 8 5 3 4 9 8 6 4 1 2 3 l 3 9 1 1 5 2 3 0 2 2 2 2 4 7 2 3 2 i 6 4 8 组培曲根系的像素点 累积距离 苫 ， 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 江苏大学硕士学位论文 2 1 2 3 图像分析长度的获取 通过图象处理获得参照物和被测组培苗根系的像素点累积距离，与已知的7c m 长的白线参照物进行换算获取被测组培苗根系的图象分析长度，换算公式为：根系 的图象分析长度= 参照物实际长度x 根系的像素点累积距离参照物的像素点累积 距离。 如上图2 1 组培苗根系的分析长度= 7 x 3 2 1 6 4 8 9 9 4 1 2 8 ，得出组培苗根系的分 析长度= 2 2 6 5 ，即上图2 1 组培苗根系的图象分析长度为2 2 6 5 c m 。组培苗的根系的 人工测量的实际长度是通过直尺直接量取的。 2 1 2 4 组培苗根系的生长动态检测 将无根组培苗接种到1 2 m s 附加不同激素配比的培养基