（分析化学专业论文）吸收、荧光和共振瑞利散射光谱法测定秋水仙碱、白藜芦醇和胃蛋白酶的新方法研究.pdf

摘要 吸收、荧光和共振瑞利散射光谱法测定秋水 仙碱、白藜芦醇和胃蛋白酶胞新方法研究 分析化学专业研究生江珊珊 指导教师刘绍璞教授 摘要 ，本文主要研究秋水仙碱、白藜芦醇等药物与染料、无机酸根、氨基酸等小分 子以及与胃蛋白酶等大分子相互作用时对吸收光谱、荧光光谱和共振瑞利散射光 谱的影响。研究了适宜的反应条件，影响因素及分析化学性质，发展和建立了测 定上述药物和胃蛋白酶的一些新分光光度法、荧光法和共振瑞利散射法。主要研 究内容如下： ( 1 ) 秋水仙碱水解产物某些酸性磺酞类染料体系：共振瑞利散射法测定秋水仙 碱 在p h2 9 4 6b r 缓冲溶液中，秋水仙碱的水解产物( h c o l ) 能与溴酚蓝 ( b p b ) 、溴甲酚绿( b c g ) 、溴百里酚i l k ( b t b ) 和百里酚蓝o m ) 等酸性磺酞类染料 ( a s p d ) 反应形成1 ：1 的离子缔合物，此时将引起共振瑞利散射( r r s ) 的急 剧增强，并产生新的r r s 光谱。秋水仙碱水解产物与溴酚蓝、溴甲酚绿、溴百里 酚蓝和百里酚蓝形成离子缔合物的最大散射波长分别位于3 2 7 ，3 1 1 ，3 0 5 和3 0 6n m 处。散射增强( x i ) 与秋水仙碱浓度在一定范围内成正比，不同体系对于秋水仙 碱的检出限分别为1 2 3 ，1 5 1 ，1 6 4 和2 0 0n g m e = 1 ) 。研究了适宜的反应条件， 考察了共存物质的影响，表明方法有较好的选择性。基于秋水仙碱水解产物与酸 性磺酞类染料离子缔合物的反应，发展了一种较灵敏，且简便、快捷测定秋水仙 碱的新方法。方法用于片剂、黄花、血清和尿样中秋水仙碱的测定，获得了满意 的结果。 ( 2 ) 秋水仙碱三种氨基酸体系：荧光猝灭法测定秋水仙碱 在p h1 2 - 3 6 的h c l 一n a a c 酸性介质中，秋水仙碱与酪氨酸( t y r ) 、色氨 酸( t i p ) 和苯丙氨酸( p h e ) 具有荧光的3 种氨基酸发生相互作用，此时将导致 这些氨基酸的荧光发生猝灭，最大猝灭波长分别位于位于3 5 0n m 、3 0 4 衄和2 8 4 西南大学硕士学位论文 h i l l 。在一定范围内其荧光猝灭程度分别与秋水仙碱的浓度成正比，三种体系的荧 光猝灭值( f ) 分别在0 0 5 5 0p g m l 、o 0 6 5 5 , t g m l 和0 3 - 1 0p g m l 范围内与 秋水仙碱的浓度成正比，因此可用于秋水仙碱的测定。其中以酪氨酸( t y r ) 体系 灵敏度最高，而苯丙氨酸( p h e ) 体系灵敏度较低，本文重点研究了酪氨酸作探针 荧光猝灭法测定秋水仙碱的适宜条件，影响因素，提出了一种新的利用氨基酸荧 光猝灭反应测定痕量秋水仙碱的新方法。 ( 3 ) 秋水仙碱磷钨杂多酸：共振瑞利散射和共振非线性散射法测定秋水仙碱 在0 4 m o l l 的h 2 s 0 4 介质中，秋水仙碱能与磷钨杂多酸反应形成缔合产物。 此时将引起共振瑞利散射( r r s ) 、二级散射( s o s ) 和倍频散射( f d s ) 显著增 强，并且出现新的散射光谱。其最大r r s 、s o s 和f d s 波长分别位于3 8 1n n l 、7 5 0 n m 和3 9 0h i l l 附近。在一定范围内，三种散射增强( a m s 、a l s o s9 7 a i f d s ) 与秋水 仙碱浓度成正比，方法具有高灵敏度，三种方法对于秋水仙碱的检出限分别在8 n g m l ( r r s ) 、1 9n g m l ( s o s ) 和2 8n g m l ( f d s ) ，均可用于痕量秋水仙碱的测定。 本文研究了秋水仙碱与磷钨杂多酸的反应对r r s 、s o s 和f d s 光谱特征和强度的 影响，考察了适宜的反应条件，并以r r s 为例考察了共存物质的影响。据此，利 用秋水仙碱与磷钨杂多酸的反应发展了一种用共振光散射技术、灵敏度高、简便、 快速测定秋水仙碱的新方法。 ( 4 ) 秋水仙碱胃蛋白酶体系：共振瑞利散射法测定胃蛋白酶 在p h l 9 3 8 的酸性介质中，秋水仙碱的水解产物f h c o l ) 与胃蛋白酶 ( p e p s i n ) 反应形成结合产物，能引起共振瑞利散射( r r s ) 的显著增强，并产生新 的r r s 光谱。最大的r r s 峰位于4 0 6n 1 a 处，另一散射峰位于2 8 2n m 处，其散射 强度( 4 ，) 与胃蛋白酶的浓度成正比，常见的金属离子以及一定量的其他蛋白酶和 血清蛋白不干扰，方法具有良好的选择性，其线性范围在0 0 1 8 3 5 t g m l ，反应 具有较高灵敏度，对胃蛋白酶的检出限为5 4n g m l 。基于上述研究，发展了一种 用r r s 技术高灵敏，高选择性，且简便测定胃蛋白酶的方法。文中还对反应机理 进行了讨论。 ( 5 ) 白藜芦醇- h a u c h 体系：共振瑞利散射和共振非线性散射法测定白藜芦醇 在p i l l 2 1 4 的碱性介质中，白藜芦醇与h a u c h 的反应将引起共振瑞利散射 ( r r s ) 、二级散射( s o s ) 和倍频散射( f d s ) 显著增强，并且出现新的散射光 摘要 舅i i i 。i 皇量曼皇曼曼鼍舅量量量曼曼 谱。其最大r r s 、s o s 和f d s 波长分别位于3 9 6 姗、5 4 0i l m 和3 9 3n m 附近。在 一定范围内，三种散射增强( a r r s 、a i s o s 和a i r d s ) 与白藜芦醇浓度成正比，方法 具有高灵敏度，三种方法对于白藜芦醇的检出限分别在8 1n g m l ( r r s ) 、2 2 4 g m l ( s o s ) 和1 5 3n g m l 0 m s ) ，均可用于痕量白藜芦醇的测定。本文研究了白藜 芦醇与h a u c h 的反应对r r s 、s o s 和f d s 光谱特征和强度的影响，考察了适宜 的反应条件，并以r r s 为例考察了共存物质的影响，表明方法有良好的选择性。 据此，利用白藜芦醇与氯金酸的反应发展了一种用共振光散射技术、灵敏度高、 简便、快速测定白藜芦醇的新方法。方法用于虎杖中自藜芦醇的测定，获得了满 意的结果。 ( 6 ) 白藜芦醇高锰酸钾体系：分光光度法测定白藜芦醇 在p h1 8 2 5 的酸性介质中，高锰酸钾与白藜芦醇发生氧化还原反应，高锰 酸钾溶液褪色，最大褪色峰位于5 2 5 衄处白藜芦醇在0 - 2 2 x 1 0 5m o l l 的浓度 范围内遵守比尔定律，表观摩尔吸光系数c 为3 2 7 x1 0 4i ( m o l c m ) 。方法快速、 简便，具有较高的灵敏度，可用于某些天然药物中白藜芦醇的分光光度测定。 关键词：共振瑞利散射法荧光法分光光度法秋水仙碱白藜芦醇胃蛋白酶 a b s t r a c t s t u d i e so nt h en e wm e t h o d sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no f c o l c h i c i n e ，r e s v e r a t r o la n dp e p s i nb ya b s o r p t i o n ， f l u o r e s c e n c ea n dr e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g s p e c t r o m e t r y s p e c i a l t y ：a n a l y t i c a lc h e m is t r y a u t h o r ：s h a n s h a nj i a n g s u p e r v i s o r ：p r o f s h a o p ul i u a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nm a i n l ys t u d i e dt h ee f f e c t so ft h ei n t e r a c t i o n so fc o l c h i c i n ea n d r e s v e r a t r o lw i t hs o m ed y e s ，i n o r g a n i ca c i d ，s o m ea m i n oa c i da n dp e p s i no nt h e a b s o r p t i o n , f l u o r e s c e n c ea n dr e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s )s p e c t r a t h e o p t i m u m r e a c t i o n c o n d i t i o n s ，i n f l u e n c i n g f a c t o r sa n d a n a l y t i c a lp r o p e r t i e sw e r e i n v e s t i g a t e d s o m e1 1 c ws p e c t r o p h o t o m e t r i e ,f l u o r e s c e n c ea n dr e s o n a n c er a y l e i g h s c a t t e r i n gm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc o l c h i c i n e s ，r e s v e r a t r o la n dp e p s i nw e r e e 恣t a b l i s h e d b e l o w sa r ct h es p e c i f i cr e s e a r c hc o n t e n t s ： 1 c o l c h i c i n e - a c i ds u l f o n e p h t h a l e i nd y e ss y s t e m s i np h2 9 4 6b rb u f f e rs o l u t i o n , t h eh y d r o l y z e dp r o d u c to fc o l c h i c i n er e a c t e d w i t hs o m ea c i ds u l f o n e p h t h a l e i nd y e ss u c ha sb r o m o p h e n o lb l u e ( b e b ) ，b r o m o c r e s o l g r e e n ( b c g ) ，b r o m o t h y m o lb l u e a n dt h y m o lb l u e ) e t c t o f o r m i o n a s s o c i a t i o nc o m p l e x e s a sar e s u l t ，t h er e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n gf r r s ) w a s e n h a n c e dg r e a t l y , a n dan e wr r ss p e x t n n na p p e a r e d t h em a x i m u mr r ss i g n a l so f f o u ri o n a s s o c i a t i o nc o m p l e x e sw e r el o c a t e da t3 2 7 ，3 1 1 ，3 0 5a n d3 0 6r i m , r e s p e c t i v e l y t h ei n t e n s i t i e so fr r sw e r ep r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fc o l c h i c i n e a n dt h e d e t e c t i o nl i m i t sf o rc o l c h i c i n ew e r e1 2 3 ，1 5 1 ，1 6 4a n d2 0 0n g m l , r e s p e c t i v e l y t h e o p t i m u mc o n d i t i o n sa n dt h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so ft h er e a c t i o nw a 屯i n v e s t i g a t e d a s e n s i t i v e ，s i m p l ea n df a s tm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc o l c h i c i n eb yt h er r s t e c h n i q u ew a sd e v e l o p e d i tw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc o l e h i c i n ei nt a b l e t , h e m e r o c a l l i s ，s e r u ma n du r i n es a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s v 西南大学硕士学位论文 2 c o l c h i c i n e s o m ea m i n oa c i d ss y s t e m s i np h1 2 3 6n a a c - h e la c i d i cm e d i u m ，c o l c h i c i n e ( c o l ) r e a c t e dw i t h t y r o s i n e ( t y r ) ，t r y p t o p h a n ( t r p ) a n dp h e n y l a l a n i n e ( p h e ) t of o r mc o m p l e x e sr e s u l t i n gi n t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go ft y r , t r pa n dp h e n em a x i m u mf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g w a v e l e n g t hw e r ea t3 5 0n n l ，3 0 4 r i ma n d2 8 4 n m f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gi n t e n s i t i e s ( 明 w e r ep r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fe o l c h i c i n ei nt h er a n g e so f0 0 5 - 5 0 ，0 0 6 - 5 5 a n d0 3 1 毗g m l , a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tf o rc o 1 c h i c i n ew e r e1 5 1 ，1 9 8a n d1 0 1 7n g m l , r e s p e c t i v e l y a m o n gt h r e es y s t e m s ，t h es e n s i t i v i t yo ft y r - c o ls y s t e mw a st h eh j 【g h e s t ， a n dt h a to ft h ep h e - c o ls y s t e mw a st h el o w e s t t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa n dt h e i n f l u e n c i n gf a c t o r so ft h et y r - c o lr e a c t i o ns y s t e mw e r ei n v e s t i g a t e d as e n s i t i v e ， s i m p l ea n df a s tf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc o l c h i c i n ew a s d e v e l o p e d 3 c o l c h i c i n e t u n g s t o p h o s p h o r i ca c i ds y s t e m i nh 2 s o , im e d i u m ，c o l c h i c i n ea n dt u n g s t o p h o s p h o r i ca c i d w h i c hc o u l dr e a c tt or e s u l ti nt h e e n h a n c e m e n to ft h er e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s ) ，s e c o n d - o r d e rs c a t t e r i n g ( s o s ) a n df r e q u e n c yd o u b l i n gs c a t t e r i n g ( f d s ) a n da p p e a r a n c eo fn e ws c a t t e r i n gs p e c t r a t h e m a x i m u ms c a t t e r i n gp e a k sw e r ea t3 8 1m nf o rr r s ，7 5 0 n mf o rs o sa n d3 9 0 啪f o r f d s ，r e s p e c t i v e l y t h ee n h a n c e dr r s ，s o sa n d f d si n t e n s i t i e sw e r e d i r e c t l y p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o n so fc o l c h i c i n e t h ed e t e c t i o nl i m i t sf o rc o l c h i c i n eo ft h e r r s ，s o sa n df d sm e t h o d sw e r e8 n g m l , 1 9 n g m la n d2 8 n g m l t h e s em e t h o d s c o u l db eu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t so fc o l c h i c i n e i nt h i sw o r k ，t h e e f f e c t so ft h er e a c t i o no fc o l c h i c i n ew i t ht u n g s t o p h o s p h o r i ca c i do nr r s ，s o sa n df d s s p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c s ，i n t e n s i t i e s a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d m e a n w h i l e ，t h ei n f l u e n c e so fc o e x i s t i n gs u b s t a n c e sw e r et e s t e d b a s e do nt h ea b o v e r e s e a r c h e s ，as e n s i t i v e ，s i m p l ea n dr a p i dm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t s o fc o l c h i c i n eb yr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u ew a sd e v e l o p e d i tc o u l db ea p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no fc o l c h i c i n ei nt a b l e t ，5 e n l ma n du r i n ew i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s v i a b s i 。r a c l 。 4 c o l c h i c i n e p e p s i ns y s t e m i np h1 9 3 8a d ds o l u t i o n ，t h eh y d r o l y z e dp r o d u c to fc o l c h i c i n e ( h - c o l ) r e a c t e dw i t hp e p s i nt of o r mab i n d i n gp r o d u c tl e a d i n gt ot h eg r e a te n h a n c e m e n to f r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s ) a n da p p e a r a n c eo fan e wr r ss p e c t r u m n e m a x i m u mr r sp c a 】( w a sl o c a t e da t4 0 6 n m ，a n das m a l l e rs c a t t e r i n gp c a l cw a sa t2 8 2 n m n ei n t e n s i t i e so fl 佩s ( 卸w e r ep r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp e p s i ni nt h er a n g e o f0 0 1 8 - 3 私g 皿l lt h er e a c t i o nh a da1 l i g hs e n s i t i v i t y , a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t sf o r p e p s i nw a s5 4 n g m ln em e t h o da l s oh a dg o o ds e l e c t i v i t y t h e r e f o r e ，as e n s i t i v e ， s i m p l e a n df a s tm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp e p s i nb yr r st e c h n i q u ew a s d e v e l o p e d i na d d i t i o n ，t h er e a c t i o nm e c h a n i s mw a sd i s c u s s e d 5 r e s v e r a t r o l - h a u c hs y s t e m l l lp h1 2 - 1 4b rb u f f e rm e d i u m , r e s v e r a t r o l ( r e s ) a n dr l a u c l 4c o u l dr e a c tw i t he a c ho t h e rt o r e s u l ti nt h eg r e a te n h a n c e m e n to ft h er e s o n a n c , er a y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s ) ，s e c o n d - o r d e r s c a t t e r i n g ( s o s ) a n df r e q u e n c yd o u b l i n gs c a t t e r i n g ( f d s ) i n t e n s i t i e sa n da p p e a r a n c eo f n e ws c a t t e r i n gs p e c t r at h em a x i m u mr r s ，s o sa n df d ss c a t t e r i n gp e a k sw e r ea t3 9 6 n m ，5 4 1 r i ma n d3 9 3n l 1 t h ee n h a n c e dr r s ，s o sa n df d si n t e n s i t i e sw e r ed i r e c t l y p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o n so fr e s v e r a t r o lt h ed e t e c t i o nl i m i t sf o rr e s v e r a t r o lo f r r s ，s o sa n df d sm e t h o d sw e r e8 1 n g m l , 2 2 4n g m la n d1 5 3 n g m l , t h e s e m e t h o d sc o u l db eu s e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t so fr e s v e r a 仃o li nt h i sw o r k , t h ee f f e c t so ft h er e a c t i o no fr e s v e r a t r o lw i t hh a u c h o nr r s ，s o sa n df d ss p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s ，i n t e n s i t i e sa n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d m e a n w h i l e ， t h ei n f l u e n c e so fc o e x i s t i n gs u b s t a n c e sw e r et e s t e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e m e t h o dh a dag o o ds e l e c t i v i t y b a s e do nt h ea b o v er e s e a r c h e s ，ah i g hs e n s i t i v e ，s i m p l e a n dr a p i dm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t so fr e s v e r a t r o lb yr e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n gt e c h n i q u eh a sb e e nd e v e l o p e d rc o u l db ea p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f r e s v e r a t r o li np o l y g o n u mc u s p i d a t u ms a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s v i i 西南大学硕士学位论文 6 r s v e r a t r o l - p o t a s s i u mp e r m a n g a n a t es y s t e m i np h1 8 - 2 5b rb u f f e rm e d i u m ，t h e r ew a sao x i d a t i o n - r e d u c t i o nr e a c t i o nb e t w e e n p o t a s s i u mp e r m a n g a n a t e ( k m n 0 4 ) a n dr e s v e r a t r o l ( r e s ) ，w h i c hr e s u l t e di nt h ef a d i n go f k m n 0 4 n em a x i m u mf a d i n gw a v e l e n g t hw a sa t5 2 5n m ，a n dt h ea p p a r e n tm o l a r a b s o r p t i v i t y ( e 5 2 5 ) w a s3 2 7 x 1 0 4l m o l c r l l ah i g hs e n s i t i v e ，s i m p l ea n df a s t m e t h o dw a se s t a b l i s h e da n dc o u l db ea p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fr e s v e r a t r o li ns o m e n a t u r a lm e d i c i n e s k e y w o r d s ：r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ；f l u o r e s c e n c e ；s p e c t r o p h o t o m e t r y ； v i i i c o i c h i c i n e ；r s v e r a t r o l ；p e p s i n 独创性声明 学位论文题目：丞蝗：蕴毖塑基塑盟型邀蕴左遭鎏型宝熬壅地蕉 自鏊苣醒狸置蛋自鳖鲍堑左洼丑究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论 文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注对本研究及 学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感 谢。 学位论文作者：夕：习- j 签字日期： 2 d 了年j 月 牛日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查5 2 9 和借阅。 本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：；) 芍呵 签字日期：二呷年5 月叶日 撇名：吝忙落 第一章绪论 第一章绪论 第一节秋水仙碱的性质、应用及常用分析方法 1 秋水仙碱的结构、性质及应用 c h 3 c h 3 d h 3 c 秋水仙碱的结构 秋水仙碱也称秋水仙素( c o l c h i c i n c ) ；是一种重要的酰胺基类生物碱。因最初 从百合科植物秋水仙( c o l c h i c u ma u t u m n a l c ) 的球茎中提取出来，故也称秋水仙碱。 秋水仙碱是一种典型的丝分裂酶素【1 】，可以通过抑制细胞的有丝分裂和d n a 的合 成，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙碱引起的不正常分裂， 称为秋水仙碱有丝分裂( c m i t o s i s ) 。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但 细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。自1 9 3 7 年美国学者布莱 克斯利( a e b l a k e s l e e ) 等，用秋水仙碱加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以 后，秋水仙碱就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种的工作中。同时 它能抑制癌细胞的生长，临床中主要用作抗癌药物，对乳腺癌，宫颈癌，食道癌， 肺癌，皮肤癌，鼻咽癌有一定疗效。此外它还有抗免疫和抗突作用，可用作治疗 急性痛风性关节炎，三叉神经痛，腰椎间盘突出。 2 秋水仙碱的主要分析方法 目前，对秋水仙碱的分析方法主要有分光光度法，荧光分析法，电化学分析法， 薄层色谱扫描法和高效液相色谱( i - i p l c ) 等。其中分光光度法由于方法简便，准 确度高，作为药典法在药物分析中仍被广泛使用。但该方法灵敏度低，难于满足 痕量分析的要求，而且在紫外区进行测定，选择性不理想，仅适用于组成简单且 含量较高的样品分析。近年来有人利用毛细管电泳芯片和薄层色谱( n c ) 分离 后再用紫外分光光度法进行检测，灵敏度和选择性均奄石定提高，但方法不够简 西南大学硕士学位论文 便快捷。用荧光法测定秋水仙碱的方法不多，主要是利用秋水仙碱水解产物与金 属离子( 如l a ，c a ) 形成荧光配合物的荧光分析法，方法灵敏度较高，但其选择 性和分析应用都还有待进一步研究。h p l c 法有很好的分离效果，适用于多组分同 时测定，但常用的紫外检测器灵敏度较低，近年来利用h p l c 质谱( m s ) 联用技 术使灵敏度得到进一步提高，检出限可达0 6k t g m l 甚至更低。电化学方法研究较 多的是伏安法( 吸附伏安，差示脉冲伏安及循环伏安法等) 和极谱法( 如脉冲极 谱和示波极谱等) ，它们通常较简便，但灵敏度或选择性方面有待进一步提高。 2 1 分光光度法 紫外分光光度法利用秋水仙碱分子结构中的共轭体系在紫外光区的吸收特 性，直接在特定的波长处测定吸收度，通过吸收度与溶液浓度的关系来计算含量。 方法由于方法简便，准确度高，作为药典法在药物分析中仍被广泛使用。2 0 0 5 年 药典方法【2 】也采用滴定法测定秋水仙碱的含量，取秋水仙碱样品，加水溶解并定量 稀释制成每1m l q h 含1 0 g 的溶液，在3 5 0n m 处测定吸光度，按吸收系数为4 2 5 进 行计算。 h 等【3 l 采用毛细管电泳微芯片紫外可见分光光度法分离检测包括秋水仙碱在 内的四种剧毒生物碱，并将光学电池用于微芯片上，使吸光率变为原来的5 倍，方 法在5 0 5 0 0m g l 的范围内呈现良好线性关系，起检测下限为2 m g l 。 b o d o k i 等【4 】采用薄层色谱分光光度法以氯仿、丙酮、二乙基胺( 5 - 4 ：1 ) 为 流动相对生物样品中的秋水仙碱进行分离，在3 5 0l 吼处测定秋水仙碱进行检测， 其对秋水仙碱的检测范围在5 0 - 6 0 0n g m l 。 2 2 荧光法 蔡毓琼等【5 】应用薄层分离后荧光光度法对植物样品及制剂中秋水仙碱的含量 进行测定。利用二乙胺一乙醇( 1 ：1 ) 薰3 0 m i n 显色，在荧光灯下r f = 0 5 处呈亮蓝 色，荧光在2 , 1 时内稳定。该测定方法的线性范围为2 0 - 1 0 0 m g ，测定的变异系数 为6 。 h u a 掣6 】通过荧光和紫外可见吸收光谱研究了秋水仙碱与人血清蛋白( i - t a s ) 之 间的相互作用。研究表明：秋水仙碱浓度由0 - 3 6 x1 0 巧m o l t l 范围内变化时，h a s 的荧光发生猝灭，1 扫3 3 8n l l l 移至3 2 9n m 。根据f o r s t e r 非辐射能量转移机理， 求得h a s 与秋水仙碱之间距离r = 3 3 9 2n l n ；能量转移效率e = 0 2 5 0 。 2 第一苹绪论 童量量鲁鲁皇曼舅舅邑量鼍喜鼍i 一_ ； 一ii i 量曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼量量量皇曼曼曼曼曼曼量 h u a 等【7 1 以荧光猝灭法研究了秋水仙碱与牛血清蛋白( b s a ) 的相互结合作用， 文中求算了在不同温度下体系的热动力学参数：a h ，a g ，a s 。实验表明：秋水仙 碱浓度由0 3 6 x1 0 s m o l l 范围内变化时，h a s 的荧光发生猝灭，由3 4 2 衄 蓝移至3 3 3 5 衄。根据f o r s t e r 非辐射能量转移机理，求得h a s 与秋水仙碱之间距离 r = 3 7 0 3 衄；能量转移效率e = 0 2 9 2 。 李桂枝等【8 】发现仙碱在硫酸溶液中水解后产生弱的稳定的荧光。在p h4 - - 一p h 6 范围内，镧( i i i ) 离子可与水解秋水仙碱发生络合反应，络合后荧光强度增加了6 倍。最大激发及发射波长为2 4 6 姗和4 3 0 衄。在0 1 - - 1 0m v i j * 度范围内，荧光强 度与浓度有良好的线性关系。方法已用于片剂中秋水仙碱含量的测定，测定下限为 0 1m v l ，相对标准偏差为4 3 。 刘永明等1 9 l 利用荧光光谱法和分光光度法研究了水溶液中秋水仙碱与牛血清 白蛋f l ( b s a ) 的相互结合反应。研究表明：二者以摩尔比1 ：1 牢固结合，其平衡常 数= 1 9 2 x1 0 5l d m o l 。根据f o r s t = ：i f - - 辐射能量转移机理，求算了给体( b s a ) 与受体( 秋 水仙碱) 间距离r = 3 6 3a m 和能量转移效率e = 0 1 7 。实验表明：秋水仙碱与牛血清白 蛋白的相互结合作用为单一的荧光静态猝灭过程。 喻东等【1 0 1 采用紫外光谱法和荧光光谱法研究了秋水仙碱与胃蛋白酶的结合作 用。观测到秋水仙碱使胃蛋白酶的紫外吸收峰增强，特征荧光峰淬灭。s t e 舶一 v o l m e r 淬灭曲线显示，秋水仙碱对胃蛋白酶的荧光淬灭很可能是一个单一的静态 淬灭过程。当x = = 2 9 5 姗时，秋水仙碱可以淬灭胃蛋白酶中9 5 5 的t i p 残基。 赵巍等【l l 】采用紫外光谱法和荧光光谱法研究了秋水仙碱与牛胰蛋白酶的相互 作用。观测到秋水仙碱使胰蛋白酶的特征荧光峰猝灭。根据s t e 加v r o l m e r 猝灭曲 线显示，秋水仙碱对胰蛋白酶的荧光猝灭机制属于静态猝灭，猝灭常数k q 为6 6 0 1 0 1 2 ( t o o 【d s d 秋水仙碱与胰蛋白酶的结合常数为1 0 6 x 1 0 4 l t o o l ，结合位点 数为1 ，作用力类型主要为疏水作用力。 刘永明等【1 2 】发现秋水仙碱在热的氢氧化钾溶液中水解后产生弱的稳定的荧 光。钙( ) 离子可与秋水仙碱的水解产物发生结合反应，络合后荧光强度显著 增强。最大激发及发射波长为2 4 8 皿和4 6 0b i l l 。在0 1 - - - 5m 觥度范围内，荧光 强度与浓度呈良好线性关系。方法用于片剂中秋水仙碱的含量测定，得到了满意 结果。 3 西南大学硕七学位论文 黄新河等1 1 3 】采用紫外光谱法和荧光光谱法研究了秋水仙碱与牛血清白蛋白 ( b s a ) 的结合作用。观测到在p h7 4 3 条件下秋水仙碱使b s a 的紫外吸收峰增强， 特征荧光峰淬灭。s t e m m v o l m e r 淬灭曲线显示，秋水仙碱对b s a 的荧光淬灭很可 能是一个单一的静态淬灭过程。当沁x = 2 9 5b i l l 时，秋水仙碱可以淬灭b s a 中9 7 1 的t r p 残基。 马君燕等【1 4 】采用紫外、荧光和圆二色光谱研究了秋水仙碱与人血清白蛋白之 间的相互作用。结果发现秋水仙碱使人血清白蛋白的紫外吸收增强，特征荧光峰 猝灭，并且随温度升高猝灭常数k s v 降低。求算了不同温度下秋水仙碱与人血清 白蛋白相互作用的平衡常数与结合位点数。根据v a n th o f f 方程计算出a h = 1 1 1 6 6 k j m o l ，a s = 5 1 1 5 0 7j ( m o l k ) ，得出二者之间的作用力主要是静电作用力。 圆二色光谱测得加入秋水仙碱后人血清白蛋白的a 2 螺旋降低，二级结构改变，表 明秋水仙碱对人血清白蛋白的荧光猝灭机制属于形成配合物所引起的静态猝灭。 2 3 电化学法 z h a n g 1 5 】以循环伏安法、线性扫描伏安法和差示脉冲法研究了修饰乙炔黑双 十六烷基磷酸盐o 墟d h p ) 膜的秋水仙碱的电化学行为。研究表明：与未修饰的g c e 电极上的信号相比，修饰有a b d h p 的g c e 电极上的信号得到极大的改善，峰电流 显著增强显示了经a b d h p