（分析化学专业论文）基于无机纳米材料构建电流型甲胎蛋白免疫传感器的研究.pdf

k j | t 目录 嬲煳必 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章绪言1 1 1 甲胎蛋白( a f p ) 1 1 1 1 甲胎蛋白( a f p ) 简介1 1 1 2 甲胎蛋白的检测方法：l 1 1 3 甲胎蛋白抑制p t e n 的生物学功能1 1 2 电化学免疫传感器2 1 2 1 电流型免疫传感器的简介3 1 2 2 电流型免疫传感器中抗原( 抗体) 的固定方法3 l - 3 纳米材料在生物传感器方面的应用3 1 3 1 金纳米粒子在生物传感器中的应用4 1 3 2 磁性f e 3 0 4 纳米粒子在生物传感器中的应用5 1 4 本论文的思路7 第二章基于纳米金与牛血清白蛋白一二氧化钛复合物固定甲胎蛋白免疫传感器的 研究8 2 1 实验部分8 2 1 1 仪器与试剂8 2 1 2 牛血清白蛋白( b s a ) 一二氧化钛( t i 0 2 ) 复合物的制备9 2 1 3 纳米金的制备9 2 1 4 免疫传感器的制备9 2 1 5 测定方法一9 2 2 结果与讨论1 0 2 2 1 电极在不同修饰过程的电化学表征l o 2 3 实验条件的优化1l 2 - 3 1 缓冲溶液p h 的优化1 1 2 3 2 孵育温度的优化- 1 1 2 3 3 孵育时间的优化1 2 2 4 免疫传感器的性能j 一12 2 4 1 线性范围和检测限1 2 2 4 2 免疫传感器的选择性13 2 4 3 免疫传感器的稳定性1 3 2 5 结论。13 第三章纳米金和磁性纳米复合物构建无试剂电流型免疫传感器的研究。1 4 3 1 实验部分1 4 3 1 1 仪器与试剂。1 4 3 1 2 磁性f e 3 0 4 纳米颗粒的制备1 5 3 1 3f e 3 0 4 硫堇纳米复合物的制备一1 5 3 1 4 免疫传感器的制备1 5 3 1 5 检测定方法。1 6 3 2 结果与讨论1 6 3 2 1 免疫传感器在组装过程中的循环伏安表征1 6 3 3 实验条件的优化1 8 3 3 1 缓冲溶液液p h 的优化18 3 3 2 孵育时间和孵育温度的优化18 3 4 免疫传感器的性能1 9 3 4 1 免疫传感器对a f p 抗原的响应性能一1 9 3 4 2 免疫传感器的选择性和稳定性2 0 3 4 3 免疫传感器的初步应用2l 3 5 结论2 l 第四章基于碳纳米管l - 半胱氨酸f e 3 0 4 a u 纳米复合材料电流型甲胎蛋白免 疫传感器的研究2 2 4 1 实验部分2 2 4 1 1 仪器与试剂2 2 4 1 2d m f - m w n t s 纳米复合物的制备2 3 4 1 3f e 3 0 4 a u 复合纳米粒子的制备2 3 4 1 4 免疫传感器的制备一2 3 4 1 5 检测方法2 4 4 2 结果与讨论2 4 4 2 1 不同纳米材料的透射电镜( t e m ) 分析2 4 4 2 2 疫传感器的电化学特性2 5 4 3 实验条件的优化2 7 4 3 1 缓冲溶液p h 的优化2 7 4 3 2 孵育时间及孵育温度的优化2 7 4 4 传感器的性能2 8 4 4 1 免疫传感器的对a f p 抗原的响应性能2 8 4 4 2 免疫传感器的选择性和稳定性2 8 4 5 结论2 9 参考文献3 0 作者硕士期间发表的学术论文3 4 墅i 谢3 5 两南大学硕十学伊论文 摘要 基于无机纳米材料构建电流型甲胎蛋白免疫 传感器的研究 分析化学专业硕士学位申请人朱宇萍 指导教师袁若教授 摘要 甲胎蛋白( a f e t o p r o t e i n ，a f p ) 是肝癌细胞表达的高特异性蛋白质，很多肝癌病人 ( 7 0 8 0 ) 在发病期间都有a f p 基因高表达的特征。传统的医学理论认为a f p 基因的高表 达是肝癌发生过程中的一个伴随现象，是肝癌发生的特异性肿瘤标志物。新的研究结果表明 细胞外的a f p 能与其受体结合，介导生长信息的传递；细胞内的a f p 不仅能抑制凋亡信号的转 导，而且也能促进生长信号的传递，这是a f p 具有抗凋亡和促进增殖功能的新发现，该研究结 果赋予a f p 新功能的认识和寻找到治疗肝癌的新靶点。因此，开发新型的a f p 检测方法具有重 要的理论意义和现实的应用价值。 电化学免疫传感器是将电分析技术与特异性免疫反应相结合，用于监测抗原一抗体反应的 生物传感器。电流型免疫传感器是电化学传感器中技术最为成熟的一种。与其他电化学免疫 传感技术相比这一方法无需分离、洗涤，可实现简便、快速免疫分析。本文利用无机纳米材 料表面官能团密度大、吸附能力强、达到吸附平衡的时间短等诸多优点，结合金纳米粒子制 备纳米复合材料并用于构建电流型甲胎蛋白免疫传感器。该免疫分析方法较传统测定a f p 的方 法，更简便、更快速。 本论文主要研究以下几个方面： 1 基于纳米金与牛血清白蛋白二氧化钛复合物固定甲胎蛋白免疫传感器的研究 二氧化钛纳米粒子与常规材料相比具诸多优点，如：无毒，优良的电学性能，良好的热 稳定性，不强的吸湿性，以及良好的成膜性等。本文将二氧化钛纳米粒子溶于氨基化溶剂牛 血清白蛋白中制得牛血清白蛋8 - - - 氧化钛纳米复合物。实验结果表明，利用该纳米复合物修 饰金电极能够人量吸附生物亲和性好、比表面积大的纳米金颗粒，并通过纳米金成功固定甲 胎蛋白抗体。利用此法研制的甲胎蛋白电流型免疫传感器对甲胎蛋白抗原有很好的电流响应， 在最优实验条件下，其检测范同为0 0 1 8 0 0n g m l ，检出限为0 0 0 3n g m l ，实现了对甲胎蛋 白抗原的定量分析。该免疫传感器制作简单、成本节约、环保、灵敏性高。 2 纳米金和磁性纳米复合物构建无试剂电流型免疫传感器的研究 i 两南人学硕十学伊论文摘要 四氧化二铁纳米粒子是一种典型的磁性纳米材料，具有易分离、易富集、易提取的优点， 常用于制备生物感器。本文首先制备了具有易丁磁性分离、硫革( t h i o n i n e ，t h i ) 包覆的四氧 化三铁( f e 3 0 4 ) 纳米复合物。通过静电吸附和共价键合作用，将n a t i o n 、硫苇包覆的f e 3 0 4 复合纳米粒子层层修饰剑玻碳电极表面，最后利用纳米金吸附甲胎蛋白抗体( a n t i a f p ) ，从而 制得了灵敏度高、稳定性好的无试剂电流犁甲胎蛋白免疫传感器。实验通过透射电子显微镜 ( t e m ) 对该复合纳米粒子进行了表征，并用循环伏安法考察了电极的电化学特性。实验结果 表明，f e 3 0 4 硫堇复合纳米粒子修饰的电极在实验过程中呈现出良好的氧化还原活性，省去了 在测试底液中加入电活性物质的步骤。与类似方法相比，该传感器引入的四氧化三铁纳米粒子 能显著降低检测下限。并且利用f e 3 0 4 顺磁性，还能达到多次回收再生，既节约成本又环保。 3 基于碳纳米管l 一半胱氨酸f e a o 。 a u 纳米复合材料的电流型甲胎蛋白免疫传感器的研 究 将d m f ( n ，n 一二甲基甲酰胺) 分散的多壁碳纳米管( m w n t s ) 修饰在金电极表面，再将修 饰电极依次沉积纳米金、l 一半胱氨酸，并通过半胱氨酸中的巯基吸附f e 3 0 4 a u 纳米复合材料， 最后固载甲胎蛋白抗体( a n t i a f p ) ，以牛血清白蛋白( b s a ) 封闭非特异性吸附位点，成功 构建了高灵敏、稳定的新型电流型甲胎蛋白免疫传感器。实验通过扫描透射电子显微镜( t e m ) 对d m f m w n t s 和f e 3 0 4 a u 复合纳米粒子进行了表征。与传统使用纳米金颗粒固定抗体的方 法相比，f e 3 0 4 a u 复合纳米粒子能显著增加甲胎蛋白抗体的吸附量，提高免疫传感器的灵敏 度。同时，该传感器的制备方法不需要标记生物分子，也无需竞争或者夹心反应，只需在传 感器表面进行常规的免疫反应，测量其电流响应信号即可。在优化的实验条件下，该免疫传 感器对甲胎蛋白抗原的检测范围为0 1 1 5 0n g m l ，检出限为o 0 3n g m l 。该免疫传感器选择性 好、稳定。 关键词：甲胎蛋白纳米金磁性纳米粒子免疫传感器 i i 两南人学硕+ 学伊论文 a b s t r a t s t u d i e so ne l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r s b a s e do n i n o r g a n i c 州a n o m a t e n a i s1 0 r lt n 仅一f e t o p r o t e i n a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：y u p i n gz h u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rr u o y u a n a bs t r a c t t h ee x p r e s s i o no fa l p h a - f e t o p r o t e i n ( a - f e t o p r o t e i n , a f p ) i nh e p a t o m ac e l l si sah i g hs p e c i f i c p r o t e i n m a n yh c cp a t i e n t s ( 7 0 - 8 0 ) i nt h ei n c u b a t i o np e r i o dh a v et h ec h a r a c t e r i s t i c so fh i g ha f p g e n ee x p r e s s i o n t h et r a d i t i o n a lm e d i c a lt h e o r yh o l d st h a th i 【g he x p r e s s i o no fa f pg e n ei sap r o c e s s o fl i v e rc a n c e ra s s o c i a t e dw i t ht h ee p i p h e n o m e n o n ，a n di sd e e m e da sal i v e rc a n c e r - s p e c i f i ct u m o r m a r k e r i ti sr e p o r t e dt h a tt h ea f pe x t r a c e l l u l a rb i n dt oi t s r e c e p t o ra n dm e d i a t et h eg r o w t ho f i n f o r m a t i o nt r a n s f e r c e l l sw i t h i nt h ea f pc a nn o to n l yi n h i b i t et h ea p o p t o s i ss i g n a lt r a n s d u c t i o n , b u ta l s o p r o m o t et h e t r a n s m i s s i o no fg r o w t h s i g n a l s ，w h i c hd i s p l a yn e wd i s c o v e r i e s o f a n t i - a p o p t o s i sa n dp r o m o t i n gp r o l i f e r a t i o nf o ra f p ，t h i ss t u d yh a v ee n d o w e da f pn e wc o g n i t i o no f f u n c t i o n a l i z a t i o na n dn e wt a r g e tf o rt r e a t i n gl i v e rc a n c e r t h e r e f o r e ，t h ed e v e l o p m e n to fn e w d e t e c t i o nm e t h o d sf o rd e t e c t i o no fa f pi so fi m p o r t a n tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a la p p l i c a t i o nv a l u e e l e c t r o c h e m i c a li m m t m o s e n s o ri sb a s e do nt h ec o m b i n a t i o no fe l e c t r o a n a l y s i s t e c h n o l o g ya n ds p e c i f i ci m m u n o r e a c t i o n a m o n gv a r i o u se l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r s ， t h ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o ri st h em o s ts o p h i s t i c a t e db e c a u s ei t , a v o i d ss e p a r a t i o n ，w a s h i n g , r e a l i z e se a s i l y ，a n da c h i e v e sr a p i di m m u n o a s s a yc o m p a r e dw i t ho t h e re l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y s e n s i n gt e c h n o l o g y i no u rw o r k , w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c ta m p e r o m e t r i ca f pi m m u n o s e n s o rb y u t i l i z i n gi n o r g a n i cn a n o m a t e r i a lf o rt h e i ra d v a n t a g e ss u c ha st h ea d s o r p t i o na b i l i t y ，t h es u r f a c ew i t h f u n c t i o n a lg r o u pd e n s i t y ，s h o r tt i m et or e a c he q u i l i b r i u m t h ep r e p a r e di m m u n o s e n s o re x h i b i t m u c h e a s i e rp r o c e s sa n dh i g h e rs e n s i t i v i t yc o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a lm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fa f p t h em a i nw o r k sa n dc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 a ni m m u n o s e n s o rf o ra f pa n t i g e nb a s e do ng o l dn a n o p a r t i c l e sa n dt i t a n i c o x i d e - b s ac o m p o s i t e t i t a n i co x i d en a n o p a r t i c l e so w nm a n ya d v a n t a g e sc o m p a r e dt oc o n v e n t i o n a lm a t e r i a l s ，s u c ha s ， n o n - t o x i c ，e x c e l l e n te l e c t r i c a lp r o p e r t i e s ，g o o dt h e r m a ls t a b i l i t y ，w e a km o i s t u r ea b s o r p t i o na n dg o o d i i i 两南：学硕十学伊论文a b s t r a t f i l m f o r m a t i o n ah i 曲l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa f pi s d e v e l o p e db a s e do nt h ec o m p o s i t eo f b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n dt i 0 2 ( b s a t i 0 2 ) w h i c hi s e m p l o y e dt ol i n kg o l dn a n o p a r t i c l e s ( n a n o a u ) f o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fa n t i - a f et h er e s u l t s s h o wt h a tt h ei m m u n o s e n s o rp r e s e n t sh i g h l ys e n s i t i v i t y ，g o o ds e l e c t i v i t ya n dab r o a dl i n e rr e s p o n s e f r o m0 01 8 0n m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 0 0 3n g m l 2 s t u d yo nt h es e l fa s s e m b l yr e a g e n t l e s sa m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rb a s e do ng o l d n a n o p a r t i e l e sa n dm a g n e t i cn a n o c o m p o s i t e f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s ，at y p i c a lm a g n e t i cn a n o - m a t e r i a l s ，a r ep r o v e dt ob ee a s yt os e p a r a t e ，b e e n r i c h e d ，a n de x t r a c tt h ea d v a n t a g e so fb i o s e n s o r sc o m m o n l y p r e p a r e d a n e wr e a g e n t l e s s a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rw a ss u c c e s s f u l l yf a b r i c a t e d b a s e do nt h ea f e t o p r o t e i na n t i b o d y ( a n t i - a f p ) m o l e c u l ec o u p l e da tf e 3 0 4 t h i o n i n ea n dg o l dn a n o p a r t i c l e s f i r s t l y ，m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s a n d f e 3 0 4 。t h i o n i n en a n o p a r t i c l e s w e r e p r e p a r e d t h e n ，f e 3 0 4 t h i o n i n e n a n o p a r t i c l e sw a sa s s e m b l e do nn a t i o nm o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ev i ae l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o n a n dc o v a l e n tb o n d i n g f i n a l l y ，g o l dn a n o p a r t i c l e sw e r ea b s o r b e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ef o rt h e i m m o b i l i z a t i o no fa n t i - a f p t h ep r o p o s e di m m u n o s e n s o rp o s s e s s e dh i i g h s e n s i t i v i t ya n dg o o d s t a b i l i t y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) w a su s e dt oi n v e s t i g a t e t h en a n o p a r t i c l e s c o m p o s i t ea n ds t e p w i s ef a b r i c a t i o np r o c e s so ft h ei m m u n o s e n s o ri sc h a r a c t e r i z e db yt h ec y c l i c v o l t a m m e t r y s t h er e s u l t ss h o wt h a lf e 3 0 4 t h i o n i n em o d i f i e di m m u n o s e n s o rs h o w e dag o o d r e d o xa c t i v i t y ，a v o i d i n gt h ea d d i n go ge l e c t r o a c t i v em a t e r i a l s n c o m p a r e dw i t ht r a n d i t i o n a lm e t h o d s ， t h ep r o p o s e dn a n o m a t e r i a l s b a s e di m m u n o a s s a yd i s p l a y st h el o w e rd e t e c t i o nl i m i ta n dt h eh i g h e r s e n s i t i v i t y 3 a ni m m u n o s e n s o rf o ra f pa n t i g e nb a s e do nm c n t s l - c y s t e i n ea n da u f e 3 0 4 n a n o c o m p o s i t e d m fd i s p e r s e dm w n t sw a sf i r s t l ym o d i f i e do ne l e c t r o d es u r f a c e ，w h i c hw a si nf u r t h e r e l e t r o d e p o s i t e d an a n o a ul a y e rf o ri m m o b i l i z a t i o no fl c y s t e i n e s u b s e q u e n t l y f e a 0 4 a u n a n o c o m p o s i t e s w e r ea b s o r b e do nt h em o d i f i e de l e c t r o d es u r f a c eb yt h es h a ub o n df o ri n c r e a s i n g t h es p e c i f i cs u r f a c ea r e aa n df u r t h e ri m m o b i l i z i n ga n t i - a f p f i n a l l y ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a su s e dt ob l o c kt h en o n s p e c i f i ca d s o r p t i o ns i t e so ft h ei m m u n o s e n s o rt oo b t a i nah i g h l ys e n s i t i v e a n ds t a b l ei m m u n o s e n s o r e x p e r i m e n t sb yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) a r ec a r d e do u t t oc h a r a c t e r i z et h ep r e p a r e dm w n t sa n df e 3 0 4 a uc o m p o s i t en a n o p a r t i c l e s c o m p a r e dw i t ht h e i m m u n o s e n s o rb a s e do nt h eg o l dn a n o p a r t i c l e st oi m m o b i l i z e t h ea n t i b o d i e s ，t h ep r o p o s e dm e t h o d c a ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h ea d s o r p t i o nc a p a c i t yo fa l p h a - f e t o p r o t e i na n t i b o d yt oi m p r o v et h e s e n s i t i v i t yo fi m m u n o s e n s o r m e a n w h i l e ，t h es e n s o rd o e sn o tr e q u i r et h ep r e p a r a t i o no fl a b e l e d 两南，i 学硕十学伊论文a b s t r a t b i o l o g i c a lm o l e c u l e s ，a v o i dt h ec o m p e t i t i o no rs a n d w i c hr e a c t i o na n dm a k et h ee x p e r i m e n te a s i e r u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h es e n s o rh a sag o o dr e s p o n s et oa f p ，i nt h ed e t e c t i o nr a n g eo fo 1 15 0 n g m l ，a n dd e t e c t i o nl i m i to fo 0 3n g m l k e y w o r d s ：仅一f e t o p r o t e i n ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ；m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ； i m m u n o s e n s o r v 阳南大学硕t 学伊论文第一芎 第一章绪言 1 1 甲胎蛋白( a f p ) 1 1 1 甲胎蛋白( a f p ) 简介 甲胎蛋白( 0 c f e t o p r o t e i n ，a f p ) 是一种酸性糖蛋白。正常情况下，甲胎蛋白主 要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失。但当肝细胞发 生癌变时，将恢复产生甲胎蛋白的功能。7 0 8 0 的肝癌病人在发病期间都有a f p 基因高表达的特征，而且随着病情恶化a f p 在血清中的含量会急剧增加。目前认为， a f p 对于肝癌具有：确立诊断、早期诊断、鉴别诊断以及监测复发等价值，它可使 5 0 8 0 左右的肝癌获得诊断。其可靠性仅次于病理片诊断，也可作为疗效观察和 愈后判断的指标i l j 。 1 1 2 甲胎蛋白的检测方法 a f p 的诊断价值及其阳性率的高低，是随着检测方法的发展而改变的。1 9 7 0 年以前主要用双向琼脂扩散法，其阳性率虽不高，但诊断原发性肝癌的特异性却 较大。1 9 7 1 年之后，敏感的检测方法不断发展，其阳性率显著提高，但同时也会 发现大量非癌症肝病患者有a f p 的升高，因此说明a f p 的升高并非肝癌所特有。常 用检测a f p 的方法有：荧光分析法【2 ，3 1 、化学发光分析法【4 1 、酶联免疫法【5 1 、色谱分 析法、酶标电泳法、放射免疫法等1 6 j 。这些方法虽灵敏，但耗时长、操作繁琐、成 本高、专业技术性强、放射性废物难处理等。近年来，利用电流型免疫传感器来 检测a f p 的报道不断涌现，其低成本、操作简易、灵敏度高受到人们的广泛关注。 1 1 3 甲胎蛋白抑制p t e n 的生物学功能 李孟森【7 】等最新报道了a f p 与肿瘤细胞的恶性生长、转移和侵袭密切相 关，并且认为a f p 是肝癌细胞耐药的关键性细胞因子。研究结果显示a f p 是具有潜在的抗凋亡诱导作用的生物学性质。 p t e n 是水解3 一磷酸肌醇( p i p 3 ) 为2 一磷酸肌醇( p i p 2 ) 的磷酸酶，能 阻止3 一磷酸肌醇激酶( p 1 3 k ) 磷酸化蛋白激酶b ( p r o t e i nk i n a s eb ，p k b a k t ) ， 阻断p 1 3 k a k t 的信号传递，因而被认为是一个重要的抑癌基因。其表达下 降或功能的丧失是引起生长信号错误传递的分子基础，后果是导致癌细胞的 过度分裂。约有1 2 5 的肝癌病人的癌细胞里p t e n 基因关闭，而7 0 的病 人p t e n 基因开放并高表达。p t e n 蛋白合成量与正常组织没有显著性差别， 因而p t e n 在肝癌内丧失发挥抑癌作用可能是由于其功能失活导致的。研究 表明，细胞外的a f p 能与其受体结合，介导生长信息的传递；细胞内的a f p 不仅 能抑制凋亡信号的转导，而且也能促进生长信号的传递，这是a f p 具有抗凋亡和 阳南大学硕十学伊论文第一帚 促进增殖功能的新发现，该研究结果赋予a f p 新功能的认识和治疗肝癌找到新的 靶点。因此，对a f p 的检测具有重要的现实意义。 1 2 电化学免疫传感器 传感器是能感受规定的被测量并按照一定规律将其转换成可用信号( 主要是 电信号) 的器材或装置，它通常由敏感元件，转换元件及相应的机械结构和电子 线路所组成峭j 。传感器有多种类型，固定化的生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 作为敏感元件的传感器称为生物传感器【9 】， 即其敏感材料来自于生物体。基于抗体和抗原特异性结合形成稳定的免疫复合物， 将高灵敏度的传感技术与特异型免疫反应结合起来，用以检测抗原一抗体反应的生 物传感器称作免疫传感器。 电化学免疫传感器是将免疫技术和电化学检测相结合的生物传感器。其独到 之处，如可实现在体检测，不受样品颜色、浊度的影响( 即样品可以不经处理，不需 分离) ，所需仪器设备更简单1 1 0 , 1 1 】，能广泛应用于医学、食品、环境等的检测。电 化学免疫传感器按在免疫分析过程中是否使用标记物可分为标记型和非标记型免 疫传感器。标记型免疫传感器测定原理主要有夹心法和竞争法，其原理见图1 1 。 非标记型免疫传感器其原理见图1 2 ，按结构可分为结合型和分离型两种【1 2 】。按测 量信号可分为电流或安培型、电位型、电容性、电导阻抗型免疫传感器。其中电 流型( 安培型) 免疫传感器发展最迅速【m ，l l 】。 传 抗 抗 原 _ 臼争日 咱砸 标 t 己 的 抗 体 3 ：o _ _ o ： 伊j 【 ( a ) 夹- 心法 已知量的标记抗原 参1 2 芦 c o ) 竞争法 图1 1 标记型免疫传感器测定原理 f i g u r e 1 1t h ep r i n c i p l eo fl a b e l e di m m u n o s e n s o r 2 匿一 陲 两南，：学硕十学伊论文第一章 固体 电极 ( 电位变化) 光纤 ( 光纤化学 性质变化) 杰毫赫盛耋曼筏) 六( 勰， 图1 2 非标记型免疫传感器测定原理 f i g 1 2t h ep r i n c i p l eo fn o n l a b e l e di m m u n o s e n s o r 1 2 1 电流型免疫传感器的简介 电流型免疫传感器是在恒电压下检测传感器表面电活性物质的氧化还原电 流，电流的大小与电活性物质的浓度或生物敏感层的消耗率产率相关，产物浓度 与电流成线性关系。电流型免疫传感器利用电活性物质把生物亲和反应转换为电 流信号，研究免疫反应的稳态响应或暂态响应，灵敏度高【1 3 1 。 1 2 2 电流型免疫传感器中抗原( 抗体) 的固定方法 现在普遍认为电极表面的设计是提高电极寿命并增强反应信号的重要因素 【1 2 】。因此，抗原抗体固定方法的选择尤为重要。根据不同材质的电极表面选择合 适的固定方法，以保证兼顾抗原抗体在反应过程中的牢固、不脱落以及免疫生物 物质的活性、传感器的重现性、检测限和循环使用等性制14 1 。如，l o u i s t l 5 1 等在 用巯基烷烃保护金电极减少杂蛋白的非特异吸附又不降低其导电能力的同时，用 含巯基的硅烷作偶联剂将链霉亲合素定向固定在金电极表面的s i 0 2 层，使之能够与 生物素化抗原精确结合，效果很好。d i i k s m a m 】指出，如果使用短链的烷基硫醇效果 佳。l i u 1 7 】用高氟磺化阳离子树脂处理玻碳圆盘电极，结合多聚苯胺，偶联葡萄球菌 蛋白a ，定向固定兔i g g ，脲酶标记山羊抗兔i g g ，对兔i g g 的测定线性范围很宽( 5 0 20 0 0n m l ) 。 现主要的固定方法有：吸附法、电化学沉积法【18 1 、架桥化固定法( 交联法) 【1 9 之1 1 、 高分子载体包埋法【2 2 2 3 1 、共价键和法【2 4 2 5 1 、分子自组装固定法【2 6 2 7 1 。 1 3 纳米材料在生物传感器方面的应用 2 0 世纪6 0 年代，著名的诺贝尔奖获得者f e y n e m a n 曾预言：如果我们对物体 窿姑 西南：学硕十学伊论文第一章 微小规模上的排列作某种控制，我们就能使物体得到大量异常的特性，看到材料 的性能产生丰富的变化。预言中所指的材料即现在的纳米材料【2 8 】。如今，纳米材 料已经广泛应用于各行各业，己成为科研领域研究的焦点。 纳米粒子( n a n o p a t i c l e ) 是粒径为纳米级( 1 0 。9m ) 的超细颗粒，尺寸在1 1 0 0n l n 之间。它大于原子，小于通常的微粒，处在原子簇( c l u s t e r ) 和宏观物体交界的过渡 区域，介于微观与宏观之间，是一种典型的介观( m e s o s e o p y ) 系统。表面效应、小 尺寸效应、量子效应、宏观量子隧道效应四大特性决定了纳米材料表现出一系列 独特的电学、光学、热学、磁学、力学及催化性能【2 9 。3 0 1 。这些特性使得纳米材料 本身就是非常敏感的化学和生物传感器【3 。近年来，纳米材料被广泛应用于免疫 传感器的构建，大大改善传感器的响应性能，显示出了相当大的优势与广阔的应 用前景。 1 3 1 金纳米粒子在生物传感器中的应用 纳米金颗粒指直径在l 10 0n l t l 的微小金颗粒。胶体金溶液是指纳米金粒子在水 中分散的水溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。胶体金在标记 探针应用方面具有其独特的优势，可在不破坏生命物质结构和功能的前提下提供 光电检测信号，因此存在着广泛的应用前景【3 2 1 。 黎雪莲【3 3 j 等报道了基于多层酶纳米金固定甲胎蛋白免疫传感器( 图1 3 ) 。 利用自组装技术和静电吸附作用制得多层纳米金。该多层纳米金具有扩大电极比 表面积和增大抗体吸附量的功能，并很好地保持其生物活性。该传感器制作简便、 灵敏度高。 | 嚅嚣 n 甜d a u 荨鞲塞 r m o a u ) 2 嚣： 詈嚣塞 图1 3 免疫电极的组装过程 f i g 1 3p r e p a r a t i o np r o c e s so ft h ei m m u n o e l e c t r o d e 。【3 3 1 ，c o p y r i g h t2 0 0 6 化学学报 4 两南j j 学硕十学伊论文 第一章 h u i l a ns u 等【j 4 j 报道了以纳米金、硫堇、碳纳米管构建