（生物化学与分子生物学专业论文）no对造血细胞的影响.pdf

浙 江 大 学 硕 士 论 文 核细胞，分别用 c f u - g m和 c f u - e培养液调整细胞数为 1 .0 x 1 0 6 个/ m l ， 加入不同浓度的s n p ， 在2 4 孔板上培养， 第7 , 1 0 , 1 4 天计数克隆数.结果表明，s n p能在体外抑 制正常造血干姐 细胞的克隆形成能力，并成剂量依赖性 ( i 检验 p 0 .0 5 ) .) - - ( 二)流式细胞仪检测 s n p对 h l - 6 0细胞周期的影响 浓度的s n p 与 h l - 6 0 细胞培养 2 4 0 , 8 , 1 6 , 2 4 h .离心收集细胞， 小时2 m m o 1 / l 。 白 不 同 s n p 作用 7 0%冷乙醉固定 2 4小 时， 加 d n a - p r e p k i t中 染色，流式细胞仪检测。在本次实 验中，由 于凋亡细胞数随着s n p 浓度的提高或者作用时间 的 延长逐 渐增加， 使处于g 声, 期 细胞、 s 期、 g z / m期的 细胞数都绝对下降， 但是在三者相对比较时，g a g ， 的细 胞数成上升趋势，而 s期、 g ,/ m 成下降趋势。也可以说 s n p 作用于h l - 6 0 细胞 后使 得g d g ， 期细胞增多， 而s 期、 g z / m期细胞减少。并成剂量、时间 依赖性。 表明n o能 抑 制h l - 6 0 细胞的d n a复制及有丝分裂来抑制 h l - 6 0细胞 生长。 、一 ( 三 ) s n p 诱 导 h l -6 。 细 胞 凋 亡 检 测 。 蜘 胞 凋 亡 过 程 中 ， 激 活 内 源性 d n a 内切酶，在核小体单位之间被随机切断，形 成 1 8 0 - 2 0 0 b p核小 体 d n a多聚 体。 在凝胶电 泳中表 现为 梯型 d n a图谱 ( d n a l a d d e r ) . d n a双链断裂会生成一 系列 d n a 3 - o h末端， 可被脱氧核糖核昔酸末端转移酶 ( t d t )的标记。由于凋亡细胞d n a裂解而大量丢失，可 在流失细胞仪检测时出现一个亚二倍体峰，又称细胞凋亡 峰 ( a p ) ，根据 a p峰可计算细胞凋亡的百分率。在细胞 凋亡过成中，细胞的形态也发生一定的改变，如核染色质 凝集、核碎裂、细胞质膜有表面突出，而呈发芽或发泡现 象。 胞质突起脱落而导致凋亡小体形成。 本次实验中，s n p 处 理h l - 6 0 细胞2 4 小时 后， d n a电 泳出 现典型的1 8 0 b p 倍数的梯状条带，而对照组则无d n a梯状条带，呈基因 浙 江 大 学 硕 士 论 文 ( 四) 组条带。 而在t u n e r l法中， 显微镜观察到棕色的细胞为 凋亡细胞，可看到核固缩和核碎裂，并可见到棕色的凋亡 小体.0 , 0 .5 , 1 , 2 m m o l / l s n p 作用2 4 h 后h l - 6 0 凋亡细 胞率分别为 1 % , 1 0 % 4 0 %, 8 0 %。 透射电 镜中观察到随 着s n p 作用时间的延长， 细胞形态变化愈加明 显， 核固 缩， 核边聚， 核碎裂，染色质凝聚，并可见到典型的半月型核。 s n p可影响细胞周期，诱导出现细胞凋亡群体，亚二倍体 峰 细 胞 比 例 随 时 间 、 浓 度 的 增 大 而 明 显 上 升 . 厂 h l - 6 0 细 胞 增 殖 抑 制 检 测( m “法 ， 。 ( 以 m t t 为 底 物 ， 活 细胞线粒体中 琉拍脱氢酶使外源性黄色的m t t 还原成蓝紫 色的难溶性结晶物 ( f o r m a z a n ) ，并沉积在细胞内，而死细 胞无此功能。 在不同浓度s n p 作用2 4 h 后h l - 6 0 细胞中加 入mt t 。 培养继续4 小时。 吸取上清夜， 加入1 5 0 u l 二甲 亚枫，5 7 0 n m处测定o d。本次实验结果表示n o对h l - 6 0 细 胞 增 殖 有 显 著 的 抑 制 作 用 ， 并 成 明 显 的 剂 量 一 效 应 关 系 。 卜钾 浙 江 大 学 硕 士 论 文 abs t ract n i t r i c o x i d e ( n o ) i s a r e a c t iv e m o l e c u l e t h a t h a s m u l t i p l e b i o l o g i c e ff e c t s . n o m o d u l a t e s t h e f o r m a t i o n o f e r y t h ro i d a n d m y e l o i d c o l o n ie s . n o c a n t h e re f o r e ,p l a y a d i s p e n s a b l e r o l e m o d u l a t i n g t h e g r o w t h a n d d i ff e re n t i a t i o n o f h e m a t o p o i e t i c s t e m / p r o g e n i t o r c e l l s . mo r e a n d mo r e e v i d e n c e s h o ws t h a t no i s a s s o c i a t e d wi t h h e m a t o p o i e t i c s y s t e m d y s fu n c t i o n . g a m m a - i r r a d i a t i o n、b e n z e n e a n d d e r i v a t i v e s a c c e l e r a t e i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ( in o s ) e x p r e s s i o n i n t h e b o n e m a r r o w c e l l s . c d 3 4 c e l l fr o m p a t i e n t s w i t h a p l a s t i c a n e m i a i n c r e a s i n g e x p r e s s i o n o f in o s i n r e s p o n s e t o y - i n t e r f e r o n a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a i n d u c e s i t s a p o p t o s i s . i n h i b i t i o n o f in o s a c t i v i t y b y n o - m o n o m e t h y l - l - a r g i n i n e ( l - n m m a ) c a n n o t o n l y r e v e r s e s u c h e ff e c t , b u t s u p p r e s s y - i n t e r f e r o n a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a i n d u c i n g a p o p t o s i s . wh a t i s m o r e , n o c a n s t i m u l a t e p 5 3 g e n e m u t a t i o n i n s o m e l i n e c e l l s , s u g g e s t i n g t h e n o i n d u c e s a p o p t o s i s r e s u l t i n g f r o m d n a d a m a g e a n d s u b s e q u e n t a c c u m u l a t i o n o f p 5 3 . e x c e p t a b i l i t y o f s u p p r e s s i n g n o r m a l h e m a t o p o i e t i c c e l l s， n o c a n i n d u c e s t h e l e u k e m i a c e l l d i ff e r e n t i a t i o n . f l u o r i d e ( n a f ) , r e t i n o ic a c i d a n d v i t a m i n d 3 u p r e g u l a t e l e u k e m i a c e ll s e x p r e s s i n g in o s a n d i n o s i n h i b it o r c a n p r e v e n t t h e m t o s u p p r e s s le u k e m i a c e l l s . i n o r d e r t o t e s t i 勿n o m a y b e t h e d i r e c t m o l e c u l e t h r o u g h w h i c h o t h e r f a c t o r s c o n t r ib u t e t o t h e i n it i a t i o n a n d p r o g r e s s o f t h e h e m a t o p o i e t i c d i s e a s e . i n i n v i t r o c u l t u r e we e x a mi n e no e ff e c t i o n o n t h e n o r ma l mi c e h e m a t o p o i e t i c c e l l s a n d h u m a n m y e l o i d le u k e m i a h l - 6 0 c e l l s , h o p i n g t o p r o v i d e t h e o r y b a s i s f o r n o d o n o r s t o b e u s e d i n c l i n i c a l t h e r a p y . we u s e s o d i u m n i t r o p r u s s i d e ( s n p ) a s n o s o u r c e b e c a u s e o f i t s c a p a b i l i t y o f re l e a s i n g n o i n s o l u t i o n ， ( 1 ) a g a r s e m i s o l i dc u l t u r e e x a mi n e s s np i n h i b i t i o n o n f o r m i n g u n i t - g r a n u l o m a c r o p h a g e ( c f u - g m) a n d c o l o n y c o l o n y 浙 江 大 学 硕 士 论 文 f o r m i n g u n i t - e r y t h r o c y t e ( c f u - e ) . h e m a t o p o i e t i c s t e m / p ro g e n i t o r c e l l s c a n f o r m c o l o n y in s e m i s o l i d m e d i a w i t h c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r ( c s f ) . c f u - g m a n d c f u - e c o u n t i n g b y m i c ro s c o p i c o b s e r v a t i o n s h o w s t h e n u m b e r a n d d i ff e re n t i a t i o n a b i l it y o f h e m a t o p o i e t i c p ro g e n it o r c e l l s . t h e m o n o n u c l e a r c e l l s ( m n c ) a t a d e n s i ty o f 1 0 6 / m l w it h r ic h h e m a to p o i e t i c c e ll s i s o l a t e d fr o m n o r m a l m i c e b o n e m a r r o w c e l l s ( b m c ) a ft e r g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n a re c u lt u re d i n s e m i s o l i d m e d i a , t r e a t e d w it h n o - d o n a t i n g a g e n t s n p ( 0 .5 m m o l / l t o 2 m m o l/ l ) . a t d a y s 7 , 1 0 , 1 4 o f c u lt u re , w e c o u n t c o l o n i e s . s n p d e c re as e s c f u - g m a n d c f u - e f o r m a t i o n i n v i t ro i n a d o s e - d e p e n d e n t f a s h i o n . b u t a t l o w c o n c e n t r a t i o n o f 0 .5 m m o l / l , t h e re i s n o s i g n i f i c a n t d i ff e re n c e c o m p a r e d w i t h c o n t r o l . ( 2 ) t h e e ff e c t o f s n p o n t h e c e l l c y c l e d i s t r i b u t io n o f h l - 6 0 c e l l s i s e x a m i n e d b y f l o w c y t o m e t r y ( f c m ) . h l - 6 0 c e l l s a re t r e a t e d w i t h s n p o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n f o r 2 4 h h l - 6 0 c e l l s a re t rea t e d wi t h 2 mmo 1 几 s np a n d c o l l e c t c e l l s a t i n d i c a t e d t i me p o i n t s ( 8 h , 1 6 h , 2 4 h ) . t h e d n a c o n t e n t i s a n a ly s e d a ft e r p i d y e i n g . i n t h e t e s t , w e fi n d t h e m o re s n p a n d t h e l o n g e r t i m e o f t h e s n p e ff e c t i n g o n h l - 6 0 c e l l s , t h e m o re a p o p t o t i c c e l l s . t h e i n c re a s i n g l e a d s t o a b s o l u t e l y d e c re as in g o f t h e c e l l s i n g o / g , s t a g e , s s t a g e a n d g z / m s t a g e . b u t i f w e d i s re g a r d a p o p t o t i c c e l l s ,t h e p e r c e n t a g e o f c e l l s i n g o / g , p h a s e s h o w s i n c re as i n g t r e n d w h i l e t h a t i n s p h a s e , g z / m p h as e s h o w s d i s c re a s i n g t re n d . s o w e c a n s a y n o i n h i b i t h l - 6 0 c e l l s g r o w t h t h ro u g h s u p p re s s i n g d n a re p l i c a t i o n a n d m i t o s i s . ( 3 ) s n p e ff e c t o n h l - 6 0 c e l l s a p o p t o s i s i s e x a m i n e d . a p o p t o s i s i s a n a c t i v e m o d e o f c e l l s d e a t h o f s t e re o t y p i c a l m o r p h o l o g i c c h a n g e s , s u c h as n u c l e o p l a s m i c a n dc o n d e n s a t i o n , a n d t h e f o r ma t i o n o f e x t e n s i v e me mb r a n e b l e b s a n d n o v e l 浙 江 大 学 硕 士 论 文 s t r u c t u re s k n o w n a s a p o p t o t i c b o d i e s . d u r i n g t h e p ro c e s s o f c e l l s a p o p to s i s ， c a t / m e- d e p e n d e n t e n d o n u c le a s e s w h ic h in t ro d u c e d o u b l e - s t r a n d e d b re a k s a t i n t e m u c l e o s o m a l re g i o n s o f m a t u re d n a a re a c t i v a t e d , re s u l t i n g i n t h e a p p e a r a n c e o f l a d d e re d e l e c t r o p h o re t i c p a tt e rn s o f o l i g o n u c l e o s o m a l d n a fr a g m e n t s o n c o n v e n t i o n a l a g a r o s e g e l s . 3 - 0 h t e r m i n a l p ro d u c e d b y d n a s t r a n d b re a k i n g c a n b e l a b l e d b y t h e t e r m i n a l d e o x y n u c le o t i d y l t r a n s f e r a s e ( t d t ) . a p o p t o t i c c e l l s l o s e d n a re s u l t i n g a p o s i t i o n o f s u b - g i ( a p o p t o t i c p e a k ) i n f c m a n a l y s i s . a p re p re s e n t s t h e p o s i t i o n o f t h e a p o p t o t i c c e l l s . i n t h e t e s t , h l - 6 0 c e l l s c u l t u re d i n t h e p re s e n c e o f s n p s h o w d n a l a d d e r b a n d o n a g a r o s e g e l s w h i l e t h e u n t re a t e d c e l l s s h o w g e n o m i c d n a b a n d . i n s t i t u t d t - a p o p t o s i s a s s a y w e c o u n t s t a i n e d c e l l s a n d o b s e r v e t h e a p o p t o t i c b o d i e s u s i n g a l i g h t m i c ro s c o p e . s n p ( o m m o u l t o 2 m m o l 几)i n c re as e s a p o p t o t i c c e l l s f ro m 1 % t o 8 0 %. t h ro u g h t r a n s m i s s i o n e l e c t ro m i c r o s c o p e w e o b s e r v e c e l l s t r e a t e d w i t h s n p a p p e a r t y p i c a l m o r p h o l o g ic c h a n g e s , s u c h as c o n d e n s a t i o n o f n u c le a r c h ro m a t i n a n d n u c l e a r f r a g m e n t a t i o n . a t s t a g e s d u r i n g s n p t re a t m e n t , t h e re i s a lm o s t l in e a r i n c re as e i n t h e p ro p o rt i o n o f a p o p t o t i c c e l l s a s d e t e r m i n e d b y d e t e c t i o n o f a p w i t h f c m a n a l y s i s ( 4 ) m t t e x a m i n e s s n p s u p p re s s i n g h l - 6 0 c e l l s g ro w t h . t h e a s s a y i s b a s e d u p o n t h e c a p a c i t y o f s u c c i n a t e d e h y d ro g e n a s e i n v i a b l e c e l l s t o re d u c e t h e t e t r a z o l i u m s a l t , 3 - ( 4 , 5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 - y l ) - 2 , 5 d ip h e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d e (m tt) t o a b l u e f o r m a z a n c r y s t a l s p ro d u c t . a ft e r 2 4 h o f i n c u b a t i o n w it h s n p , mt t i s a d d e d a n d t h e p l a n e i s i n c u b a t e d 4 h. t h e n d i s c a r d s u p e rn a t a n t b e f o re d i m e t h y l s u l f a t e i s a d d e d . t h e a b s o r b a n c e i s m e as u re d a t 5 7 0 n m u s i n g a n e l i s a re a d e r . w e f i n d s n p i n h i b i t t h e p ro l i f e r a t i o n o f h l - 6 0 c e l l s i n t h e c o n c e n t r a t i o n re l a t i n g f as h i o n . 浙 江 大 学 硕 士 论 文 序言 1 9 8 0 年f u n c h g o tt 与z a w a s z k i 在研 究乙 酞 胆 碱 ( a c h ) 的 血 管生 物学效应时发现.a c h具有舒血管作用，预先去除血管内膜后乙 酞胆碱的舒血管效应消失m 。从而推测，乙酞胆碱刺激内皮细胞 产生一种内 皮细胞 舒血 管因 子( e d r f ) 。 至1 9 8 7 年p a lm e r 和i g a n o 两小组证实 e d r f与一氧化氮为同一物质。进入 9 0年代，国际 有关 n o的研究跨入一个迅猛发展的阶段。 n o在多个系统的生 理、病理过程中所起的重要作用不断地得到阐明。而 f u n c h g o tt 和 f e r i d mu r i d也因研究n o的突出贡献获得 1 9 9 8 年的生理学和 医学诺贝尔奖。 n o是一种具有自 由 基、能调控生物反应的气体。 它在一氧化 氮合酶 ( n o s ) 作 用下，以l - 精氨酸 ( l - a r g ) 和分 子氧为 底物， 还原型尼克酞胺腺嗦吟二核昔酸 ( n a d h )为辅助因子提供电子。 由黄素单核昔酸 ( f mn) 、黄素腺嚓吟二核昔酸 ( f a d)和四氢 生物喋吟 ( b h 4 )传递电子，生成中间体对轻基 l - 精氨酸，最终 生成n o和l 一 瓜氨酸。目前至少发现了三种类型的n o s :源于神 经元( n o s , ) 和内 皮细胞( n o s , ) 的n o s 为构成型n o s ( c n o s ) , 其活性依赖于钙/ 钙调素的调节，作用迅速而短暂。巨噬细胞源性 n o s ( n o s 2 )为诱导型 n o s ( in o s ) ，其活性取决于基因转录 而不依赖于钙，作用缓慢持久，多种因素如细胞因子、细菌脂多 糖 ( l p s )可持续诱导产生高水平的 n o . n o 主要通过激活鸟嗓 吟环化酶促使 g t p形成环化 c g mp 。除此之外， n o还被发现有 许多功能。例如 n o能影响铁离子、 琉基基团、 o z . q一 、不饱 和脂肪酸等物质的运输。其中一些反应可导致 n o氧化为 n 口- 和 n o ， 一 以 终止 n o的 作用。另一些反应能引 起蛋白 质结构、功 能、催化能力的改变。 n o 充当细胞间的信使、自 体有效物质、 底物、神经递质、激素可被远程运输。因此它是一种具 “ 信号” 功能的独立分子u 1 n o是具多种功能的生物活性分子，也是造血祖细胞生长分 化不可缺少的调节因子。公认的n o作用机制是通过与含有铁硫 浙 江 大 学 硕 士 论 文 中心的蛋白 质中的 铁结合形成 f e - n o发挥细胞毒性作用。而n o 与超氧阴离子相互作用形成o n o o， 继而分别分解形成n o z 和经 自由基 ( o h ) ，它几乎可与所有的分子结合。 n o通过调节红系 和粒系集落形成的比 例， 从而影响造血干/ 祖细胞的生长分化3 越来越多的 证据表明很多造血系统疾病与n o有关。y 一 射线促进 骨 髓细 胞in o s 表 达4 ， 这 可能 与由 射 线 引 起的d n a 损 伤 有关. 苯及其衍生物不仅能促进骨髓细胞产生n o ，直接损伤造血细胞， 而且能 够 提高 骨髓细胞 对炎 性介质的 敏感性， 造成 继发 损伤5 . 再 障患者中高表达的i f n - y 和t n f - 0 能促进c d 3 4 细胞的i n o s 表 达，导致c d 3 矿 细胞凋亡数明显高于正常人。 n o s 抑制剂l 一 单甲 基一 精氨酸( l - n mm a ) 不仅能够逆转这种作用， 而且能够抑制i f n - y 和t n f - 0 诱导的细胞凋亡. 并且， n o能够引起p 5 3 基因突变， 使 d n a修 复 能 力 下降 ， 促使 造 血 干 细 胞 过 早 地 凋 亡 【6 7 8 。 在 骨 髓增生异常综合症 ( md s )中n o s表达增高，可见 n o涉及到 m d s的造血系统失调。 n o不仅能 够抑制正常的造血细胞而且参 与了某些诱导分化剂对恶性造血细胞的诱导。 n a f 、维甲酸 ( r a) 和 维生 素d 3 抑 制恶 性 造血 细 胞时， 细 胞in o s 表 达 增高 9 io e in o s 的抑制剂能够阻断其作用， 可见n o介导了正常和非正常造血细胞 的损伤，这些促使我们从另一个角度去阐明某些造血系统疾病的 发病机制，最终为治疗这些造血系统疾病提供思路。为了更能说 明n o可能是其他因素引起造血系统疾病发生、 发展、 转归的直接 作用因子， 本课题采用体外培养法观察n o直接作用于正常小鼠 造 血细胞和人类淋巴 瘤细胞 h l - 6 0细胞株后各种指标的变化，包括 从形态学、生物化学、免疫化学、细胞生物化学等角度来观察n o 对正常造血细胞克隆形成能力、 h l - 6 0 细胞凋亡和细胞增殖能力的 影响。为 n o释放剂应用于造血系统疾病的临床治疗提供理论依 据。 浙 江 大 学 硕 士 论 文 实 脸 材 料 、主要仪器 1 .y j - 8 1 5 医用净化工作台:浙江大学医学院净化厂 2 .c o 2培养箱:日 本h i r a s a w a wo r k s mo d e l wj - 1 2 - f 3 . 相差倒置显微镜3 7 x a 4 . 流式细胞仪:美国c o u l t e r公司e p i c s - x l 型流式细胞仪 5 . 酶标仪:3 1 8 c型 上海三科仪器有限公司 6 . 电泳仪:p h a r m a c i a 7 . 高速台式离心机 ( h i t a c h i ) 8 . 凝 胶成像系统 ( s t r a t a g e n e ) 9 . l k b超薄切片机 i o o n m 1 0 .透射电镜:p h i l i p s e m 4 1 0 二、主要试剂及消耗品 1 .r p m i - 1 6 4 0 : g i b c o l i f e t e c h n o l o g i e s .i n c . 生产 2 .胎牛血清( f c s ) : 杭州四 季青生物工程材料研究所 3 . 牛血清白蛋白 ( b s a ) :上海丽珠东风生物技术有限公司 4 .2 - 疏基乙醉:上海化学试剂总厂 5 . 谷胺酞氨 ( g l n ) :中国科学院上海生物化学研究所 6 .r h u g m- c s f : 美国s c h e r in g - p l o u g h 7 .e p o :日 本麒麟公 司 8 .h e p e s : f a r c o公司 9 . 琼脂:s i g m a 公司 1 0 . d n a - p re p k i t 中 染液 ( 含r n a s e 和p i ) :美国c o u l t e r 公司 1 l .t u n e l法: 检测细胞凋亡试剂盒: 南京建成生 物工程研究所 1 2 . 酚/ 抓仿混合液 病理教研室 1 3 . 蛋白酶k: p r o m e g a 1 4 .t e 缓冲液( l 0 m m t r i s .c l p h = 8 .0 ; 1 m m e d t a ) 1 5 .2 0 % s d s s i g m a 公司 浙 江 大 学 硕 士 论 文 1 6 . ma r k e r:1 k b p rom e g a 1 7 .m t t : l 0 m g / m l 无菌p h 7 .2 p b s 溶液( 华美生物工程公 司) 1 8 . 二甲 基亚枫 s i g m a 1 9 .2 . 5 % 戊二醛 2 0 . 0 . 1 m p bs 2 1 . 1 %o s 0 4 2 2 .2 % 醋酸铀 2 3 .5 0 %. 7 0 %. 9 0 %, 1 0 0 %乙醇、1 0 0 %丙酮。 2 4 . 包埋剂 e p o n 8 1 2 2 5 . 硝酸铅 2 6 . 亚硝基铁氛化钠 s n p:昊江市青云精细化工厂 试剂均为化学纯或分析纯 三、材料: 1 . 标本来源: 引颈法杀死n i h雄性小鼠， 浸入7 5 %的乙 醇3 - 4秒钟，无菌取出股骨，将一头剪去，另一头插入针头用 r p m 1 1 6 4 0加压， 冲出 骨髓细胞。 淋巴 细胞分离液分离得 到单个核细胞 2 . h l - 6 0 细胞株 浙一医院血研所赠送 浙 江 大 学 硕 士 论 文 实 脸 方 法 一、造血祖细胞体外培养 ( 半固体培养法)l1 1 1 1 .培养体系: c f u - g m 培养体系:r p m1 1 6 4 0培养基中含 1 5% f c s , 2 m m o l / l g l n , 1 0 0 i u / m l g m- c s f( 美 国s c h e ri n g - p l o u g h 公司) 、 庆大霉素 5 0 i u/ ml , he p e s l 0 mmo l / l c f u - e培养体系:r p m1 1 6 4 0 培养基中 含1 5 % f c s , 2 m m o l / l g l n , 2 i u / m l e p o( 日 本麒麟公司) 、1 0 % b s a , 5 x 1 0 5 m m o l/ l 2 - 疏 基乙 醇、 庆大 霉 素 5 0 i u / m l , h e p e s i o m m o l 几 2 . 操作步骤 实验组加不同剂量的s n p ， 使最终浓度分别至0 . 5 , 1 .0 , 1 . 5 , 2 .0 m m o l / l 。 对照组加等量的r p m 1 1 6 4 0 。 用上述培养液调整小 鼠 骨髓单 个 核 细 胞 浓 度 至 l .o x 1 0 6 个 /m l , 0 .3 % 琼 脂， 置2 4 孔板中3 7 -c , 5 % c 0 2 、饱和湿度的 培养箱中 培养， 第7 , 1 0 , 1 4天计数克隆数， 观察不同浓度的s n p对小鼠 造血祖细胞集 落形成的影响。 二、h l - 6 0 细胞周期检侧 用含2 0 %小牛血清、2 m m o l / l 谷氨酞胺的r p m1 1 6 4 0 培养 液调整h l - 6 0 细胞 数至1 .0 x 1 0 6 个 / m l . 实 验组 加不同 剂量 的s n p ， 使最终浓度分别为0 , 0 . 5 , 1 .0 , 2 .0 m m o l/ l 。 对照组 加等量的r p m i 1 6 4 0 0 2 4 孔板中每孔加入2 m l 细胞悬液、3 7 、 5 %c 0 2 、 饱和湿度的培养箱中培养2 4 小时。 实验组s n p 浓度为2 . 0 m m o l/ l , 0 , 8 , 1 6 , 2 4 h 小时收 集细胞。 1 5 0 0 r p m / 1 5 m i n ， 将2 .0 x 1 0 6 个细胞用r p m 1 1 6 4 0 和p b s 各洗涤一次， 加 浙 江 大 学 硕 士 论 文 入0 . 5 - 1 . 0 m l 7 0% 的 冷乙 醇固定2 4 小时以 上， 测前用p b s 洗涤2 次， 加1 m l d n a - p re p k i t 中 染液( 含有r n a s e 和p i ， 美 国 c o u l t e r公司产品) ，1 5分钟后，用美国 c o u l t e r公司的 e p i c s - x l型流式细胞仪进行d n a分析，每份样品检测1 0 0 0 0 个细胞. 利用m u t i c y c l e 软件进行d n a细胞增殖周期分析。 三、h l - 6 0 细胞翻亡检侧 1流式细胞仪植侧: 方法同细胞周期检测， 得出不同浓度s n p 及s n p 作用不同时间 后细胞凋亡百分率。 2 t u n e l法: 末端脱氧核昔酸转移酶介导的生物素 d u t p切口 末端标记，采 用细胞凋亡检测试剂盒 ( 南京建成生物试剂公司) 。 2 . 1 : 试剂配制 1 . 0 .0 1 m p h 7 .4 p b s的配制( 操作前配制) 2 . 蛋白酶k应用液的配制: p b s : 蛋白 酶k贮液 5 0 : 1 ， 配 好后置冰上备用。 3 . 标记反应混合物的配制:每片按9 u l标记缓冲液、1 u l t d t酶配制，配好后置备用。 4 . s a - h r p复合物应用液的配制:封闭液 5 0 : 1稀释 s a- hr p a 5 . 显色液的配制:5 0 m 1 3 0 %h 2 0 2 5 0 u l混匀 2 .2 : 操作过程 p b s中加入d a b贮液2 5 0 u l及 1 .载玻片处理: 用液体肥皂冲洗， 沥干， 在0 . 1 % h c l 浸泡 4小时，用水冲洗， 无水乙醇浸泡几个小时 ( 脱脂) . 用无水乙 醉消毒小拇指，把多聚赖氨酸 在玻片上涂匀。 待多聚赖氨酸干掉后， 1 0 t o l 细胞 悬液 ( 自然沉 浙 江 大 学 硕 士 论 文 降) ，涂于玻片为0 .7 - 0 . 8 c mo 2 . 固定:在p h 8 .0 p b s调制的4 % 多聚甲醛中固定1 5 - 2 0 分钟以上。 3 .微波增透:玻片置于2 0 0 m l 增透液中，功率为3 0 0 w , 1 0分钟，结束后水温在 6 0 c - 7 0 c ，太高， 细胞易千掉脱落，使其在微波炉中逐渐冷却 1 0分钟到 3 0 c - 4 0 后取出玻片 ( 先用水调 温， 4 分钟后必须为6 0 c - 6 5 c ， 再用新鲜配 制的p b s 洗玻片3 次，每次2 - 3 分钟) 4 . 标记: 每一样品用5 0 u l已稀释好的蛋白 酶k应用液 将样品完全覆盖3 7 c 2 0 - 3 0 分钟， 放入湿盒里。 p b s 清洗2 - 3 次， 在每一样品上加3 0 1, l 新鲜 配制的标记反应混合物， 将样品全部覆盖， 再用 疏水盖玻片覆盖放入湿盒中，置于 3 7 保温 1 小时. 用p b s 清洗3 次， 小心吸取样品周围， 每一样品上加配好的s a - h r p 复合物5 0 u l ， 加 疏水盖玻片覆盖， 3 7 c x 3 0 分钟。 p b s 清洗 3 次，吸干样品周围，加入5 0 u l d a b搜盖在 上面，室温下放置， 在显微镜下观察显色过程。 用水冲洗， 在显微镜下观察， 再浸泡到蒸馏水 中防止干掉。 在样品上方加入甲基绿， 复染十 分钟，再用水冲洗。 封片。 3 . 进射电 债观察: 2 m m o l / l s n p 作用o h , 6 h , 1 2 h , 2 0 h 后收集h l - 6 0 细胞培养液， 2 0 0 0 r p m x 1 5 分 钟， 去除 上清液. 用 戊二 醛清 洗沉淀， 4 0 0 0 r p m x 1 5 分钟， 使细胞结成团 块 固定:戊二醛饿酸双固定，先用戊二醛固定 1 - 2 小时 用o . 1 m p b s 冲洗3 次， 每次为i s 分钟， 加入 固定2 小时 ( 4 c ) ，用 0 . 1 m p b s 冲洗2 次。 ( 4 c) ， 1 % o s o 4 浙 江 大 学 硕 士 论 文 快染:2 %醋酸铀快染3 0 分钟 脱水: 用5 0 % 、 7 0 % 乙醇在冰箱里脱水1 0 - 1 5 分钟，再分别 用9 0 %、1 0 0 %乙醇、1 0 0 %丙酮脱水1 0 - 1 5 分钟，室 温下进行。 包埋: 丙酮与包埋剂( e p o n 8 1 2 ) 1 : 1 混合液里浸透一小时( 振 荡) ，打开囊袋，使丙酮自 然挥发过夜，再用纯包埋剂 浸透。 聚合:3 5 c , 4 5 c . 6 0 各聚合 1 2 小时，再6 0 聚合4 8 小 时，1 0 0 聚合若干天，室温放置。 切片:l k b型超薄切片机 1 0 0 n