（分析化学专业论文）基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究.pdf

基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究 中文摘要 本文研究了应用鲁米诺的电化学发光( e c l ) 作为酶催化反应的信号输出研制 e c l - 生物传感器。由于酶催化反应的产物为h 2 0 2 ，因此，可以通过h 2 0 2 对鲁米 诺电化学发光的增敏作用来制作不同的酶生物传感器，并将它们用于实际样品的 检测。由于电化学发光的高灵敏度以及酶的高选择性，因此制备的酶生物传感器 能够很灵敏的检测目标物的含量，检测的灵敏度高，检测限低。 第一部分研究了铁氰化钾对鲁米诺电化学发光的增敏作用，发现铁氰化钾可 以促进鲁米诺的氧化，从而增敏鲁米诺的电化学发光，并将该体系用于海带中尿 酸的含量的测定，检测结果重现性好。 第二部分研究了e c l 尿酸生物传感器的制备，并讨论了铁氰化钾对该酶催化 反应的作用。将尿酸酶用电聚合的方法修饰在铂电极表面，制得的修饰电极能对 鲁米诺的e c l 产生增敏作用，且检测尿酸的线性范围是7 5 x 1 0 d l m o l l 8 3 x 1 0 一m o l l ，并将它用于紫菜中尿酸含量的检测，得到的结果满意，重现性高， 稳定性好，且酶膜不容易脱落。 第三部分研究了e c l 谷丙转氨酶生物传感器的制备，由于谷丙转氨酶催化丙 氨酸和q 酮戊二酸转化生成丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸氧化酶能够与丙酮酸反应产 生过氧化氢，能够增敏鲁米诺的电化学发光，从而间接检测谷丙转氨酶的含量。 用该方法检测谷丙转氨酶的线性范围为o 0 0 4 7 5 , - , 3 5 0u l ，并将它用于血清中谷丙 转氨酶的检测。 第四部分研究了e c l 一胆碱生物传感器的制备，同样由于胆碱氧化酶可以与胆 碱反应生成过氧化氢，利用该过程来检测胆碱的含量。该酶生物传感器对 2 x 1 0 m o l l 4 x 1 0 3 m o u l 的氯化胆碱呈现良好的线性响应。并通过该生物传感器 来检测血清中胆碱的含量。 关键词：电化学发光( e c l ) ，鲁米诺，生物传感器，铁氰化钾，尿酸，谷丙 转氨酶，氯化胆碱 作者：吴梅笙 指导老n - 屠一锋 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究 英文摘要 t h er e s e a r c ho fu r i ca c i d 、a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e a n dc h o l i n eb i o s e n s o r sb a s e do n 一一 - j e l e c t r o c h e m l l u m l n e s c e n t0 il u m i n o i a b s t r a c t t h i sp a p e rs t u d i e da n df a b r i c a t e de c l - b i o s e n s o rb a s e do nt h es i g n a lo u t p u to f l u m i n o l se c li ne n z y m a t i cr e a c t i o n b e c a u s eo fh 2 0 2p r o d u c e db ye n z y m a t i cr e a c t i o n c a ni n c r e a s et h ee c lo fl u m i n o lw i t l lt h i sc a ni tb eu s e dt of a b r i c a t ed i f f e r e n te n z y m e b i o s e n s o r s t h e yc a l ld e t e c tt h el o w e rc o n c e n t r a t i o no fs a m p l e sd u et ot h eh i 曲l y s e n s i t i v i t yo fe c l a n dh i g h l ys e l e c t i v i t yo fe n z y m e t h ef i r s t p a r to ft h i sp a p e r s t u d i e dt h ee n h a n c e m e n te f f e c to fp o t a s s i u m f e r r i c y a n i d eo l lt h ee c li n t e n s i t yo fl u m i n o l ，t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tp o t a s s i u m f e r r i c y a n i d ec a ne n h a n c et h eo x i d a t i o no fl u m i n o l ，w h i c hc a n i n c r e a s et h ee c l i n t e n s i t y ；i tc a nu s e dt o d e t e c tt h ec o n c e n t r a t i o no fu r i ca c i di np o 印l 驴a 、杭t l l s a t i s f a c t o r ya c c u r a c ya n dr e p r o d u c i b i l i t y t h es e c o n dp a r ts t u d i e dt h ef a b r i c a t i o no fe c l - u r i ca c i db i o s e n s o r , a n dd i s c u s s e d t h ee n h a n c e m e n te f f e c to fp o t a s s i u mf e r r i c y a n i d eo nu r i c a s er e a c t i o n a ne c l b i o s e n s o rb a s e do nu r i c a s ea n dp o l y p y r r o l e ( p p y ) f i l mo np l a t i n u me l e c t r o d eh a sb e e n s t u d i e d ，a n di tc a ni n c r e a s et h ee c li n t e n s i t yo fl u m i n 0 1 t h el i n e a rr a n g eo fu r i ca c i d w a s7 5 x 1 0 in m o l l _ 一8 3 x 1 0 - 6 m o l l t h i se c l b i o s e n s o rs h o w e da ne x c e l l e n tc h a r a c t e r f o rm e a s u r i n gu r i ca c i d ，a n de n z y m a t i cm e m b r a n ei sv e r ys t a b l e t h et h i r dp a r ts t u d i e dt h ef a b r i c a t i o no fe c l - a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ( a l t ) b i o s e n s o r ；a l tc a l lc a t a l y z et h er e a c t i o no fa l a n i n ea n d 仅- k e t o g l u t a r a t ew h i c hc a n p r o d u c ep y r u v i ca c i da n dg l u t a m i ca c i d ，p y r u v i ca c i dc a l lr e a c t 谢廿1p y r u v a t eo x i d a s et o p r o d u c eh 2 0 2w h i c hc o u l di n c r e a s et h ee c li m e n s i t yo fl u m i n 0 1 t h el i n e a rr a n g ew a s f r o m0 0 0 4 7 5t 0 3 5 0u l i tw a su s e dt od e t e r m i n e 也ec o n c e n t r a t i o no f a l ti ns e r u m t h el a s t p a r ts t u d i e dt h ef a b r i c a t i o no fe c l c h o l i n e ，i t a l s ob a s e do nh 2 0 2 p r o d u c e db yt h ec a t a l y s i so fc h o l i n eo x i d a s et oc h o l i n e t h el i n e rr a n g ew a sf r o m 2 x10 7 m o l lt o4 x10 - 3 m o l l ，a n dw a su s e dt od e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no fc h o l i n ei n 基于屯化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究英文摘要 k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) ；l u m i n o l ；b i o s e n s o r ；p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e ；u f i ea c i d ；a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ；c h o l i n ec h l o r i d e i i i w r i t t e nb ym e i s h e n gw u s u p e r v i s e db yp r o f y i f e n gt u 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名： 址日期：删 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名： 导师签名： 趟日期：剿 埠日+ 期：掣 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究 第一章 第一章引言 1 1 电化学发光 电化学发光( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，e c l ) 或电致化学发光( e l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 分析是指对电极施加一定的电压以使溶液组分发生电化学反 应，反应产物本身或反应产物与体系中某组分发生化学反应而使溶液中的某种物 质被激发，并以光辐射的形式释放能量而导致化学发光，用光电倍增管等光学仪 器测量发光光谱和强度，从而对痕量物质进行分析的一种方法。 1 1 1电化学发光的特点和优点 由于电化学发光是利用电解技术在电极表面产生氧化还原物质而导致的化学 发光，所以该方法较一般的化学发光方法具有装置简单、重现性好、可进行原位 发光以及发光过程可控等特点。特别是对使用不稳定氧化物及产生短寿命激发态 物质的化学发光反应，具有更高的灵敏度。 其优点如下： a ) 有极高的灵敏度及很宽的动力学响应范围：与其他电化学方法相比较，电 化学发光法具有较高的灵敏度。对无机离子测定已达p p b 级，测定金属络合物的 检测限有的可达1 0 1 3m o l l 。动力学响应范围可以达3 - 6 个数量级。 b ) 重现性好：对于同一份样品可以连续重复测定多次，结果稳定。 c ) 仪器特点：所用仪器简单、操作简便，并且易于自动化，易于与其他技术， 如流动注射、高效液相色谱等联用。因此有利于普及与推广。 1 1 2电化学发光的发展 早在19 2 7 年，d u f f o r d 1 】等首次发现在g r i g n a r d 化合物的无水醚溶液中，对阴 极和阳极施加5 0 0 伏到1 5 0 0 伏的电压就可产生发光现象。1 9 2 9 年，h a v e r yn 在 碱性溶液中电解鲁米诺( n i r i l i n 0 1 ) 时发现了在阳极有发光现象【2 】，但是直到六十年代 初的期间三十多年，只有f r a y m a n n 3 ，b e m a l l a s e 【4 】和v o j t r t 5 】等人报道过不足十篇 的文章，对电化学发光的研究多是针对一些稠环芳烃，如红莹烯、芘类化合物、 呋喃、吲哚类以及葸和它的衍生物等的发光机理【6 8 】。 7 0 年代，电子技术的迅猛发展，随着高灵敏度的光电传感器的开发，电化学 发光技术也得到不断发展。电化学发光的研究范围有了很大的扩展，除研究某 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究 第一章 些发光体系外，还对电化学发光的仪器和电极系统进行了改进。在电极种 类上，除了应用固定电极外，开始使用旋转环一盘电极【9 以。7 0 年代还使用了半导 体电极，g r a b n e r 1 2 】用z n o 电极进行红莹烯的e c l 研究，使用这种电极能方便地 研究红莹烯的e c l 过程。随着电子技术水平的提高，集成电路的广泛使用，给电 化学发光仪器研制带来了蓬勃生机。这期间除在脉冲信号发生器的线路上有所改 进外，已开始使用多种脉冲信号，如线性扫描、正矩形扫描、双阶跃脉冲等。仪 器的改善，提高了信噪比，使仪器能适用于测定更微弱的光信号，拓展了研究领 域。这期间除研究各种芳烃化合物的e c l 外，还发现了许多新体系，如在h 2 s 0 4 和h c l 0 4 中u 0 2 2 + 的电化学发光【1 3 ，1 4 1 。和h 2 s 0 4 中t b 3 + 、o y + 时的e c l 1 5 1 。7 0 年 代还出现了新的特点，即e c l 仪器不论在脉冲信号发生系统还是在光电检测及信 号记录等方面，都紧紧地与新技术相结合，如应用计算机进行数据处理和机理研 究，激光也被应用于这方面的研究。在机理研究方面，利用磁场对电化学影响的 磁光效应，进行了三重态湮灭的研究【1 6 郴】。同时还有人使用光谱电化学方法【1 9 】以 及电子白旋共振( e s r ) 研究电极表面的产物【2 0 1 。 8 0 年代以来，有关e c l 的报道逐年增加，e c l 开始进入某些实用阶段。由于 它的连续可测性，可方便地用作为液相色谱仪的检测器【2 1 ，2 2 】。这时期的工作是对 7 0 年代工作的发展和深化，如：开展了膜修饰电极田刀】，表面活性剂对e c l 的影 响等研究【2 5 绷。近年来，有人提出了应用电化学发光图像法( e c li m a g i n g ) ，研究 了非均相电极表面的电化学活性物质的分布情况【2 8 。3 0 1 ，还有人应用该方法研究了 盘电极上非均匀性电流密度的分布特性【3 l 】。 进入九十年代后，电化学发光的仪器装置和电极材料得到了进一步的发展， 更加拓宽了这一方法的应用领域。光透电极( i t o ) 的使用及其与光导纤维波导技术 的结合，使光信号的检测更为简便【3 2 , 3 3 。微电极及超微电极的使用，使其更适用 于生物活体分析【3 4 1 。目前，b a n da r r a y 电极开始应用于电化学发光的研究【3 5 1 ，超 声技术亦应用于电化学发光【3 们。电化学发光愈来愈广泛进入了实际应用，生物技 术和生命科学向分析化学提出了新的挑战，而电化学发光以其固有的优势，成功 地应用于多肽、蛋白质和核酸等生物大分子分析、药物分析、超微量和超痕量生 物活性物质分析以及活体分析等领域。以电化学发光分析法作为p c r 的检测方法 己有报道【3 7 4 1 1 ，电化学发光与p c r 结合测定了一些病毒，如h i v e 4 2 1 。电化学发 光分析法还被用作高效液相色谱的检测方法【4 3 】。 2 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氮酶和胆碱生物传感器研究 第一章 目前在我国，e c l 法已引起电化学工作者的重视。安镜如等已连续报道了酰 肼类化合物如鲁米诺及其衍生物在碱性环境中的e c l 现象及其机理研究4 9 1 。林 祥钦等将c v 与e c l 结合，对经不同预处理的不同类型的电极对鲁米诺e c l 的影 响进行了研究，探讨了在碱性条件下，不同电极上的鲁米诺e c l 的可能发光机理， 并利用多元酚，c u 2 + 等对鲁米诺e c l 的抑制作用分别进行了测定【5 0 巧5 1 。董绍俊等 对e c l 对电物理化学的应用方面提出了自己的观点，并对酶、有机胺、各种离子 进行了测定【5 6 5 引。章竹君等提出了电位溶出化学发光分析法、电生试剂化学发光 法等，并进行了c u 2 + 、多巴胺、潘生丁、丙酮酸、硫离子、土霉素等的测定【5 9 - 6 9 。 本课题组经过多年对中性介质鲁米诺电化学发光的深入研究，成功地实现了鲁米 诺在中性环境中的电化学发光。并在此基础上间接地对超氧化物歧化酶( s o d ) 、 谷胱甘肽、维生素k 3 、蜂胶、芦丁等其它黄酮化合物进行了分析研究，实现了这 些对自由基具有明显清除作用的生物活性物质简单而灵敏的检测。 1 1 3鲁米诺电化学发光的原理 有关鲁米诺的电化学发光机理，从已发表的文献分析，归纳起来，主要有以 下几种解释【7 0 】： a ) 电极上产生的氧化物同发光物反应使之成为激发态 酰肼类化合物如鲁米诺、a b e l ，其他如光泽精等发光试剂，其发光机理多为 这种情况。碱性介质中鲁米诺的电化学发光机理被认为是【7 1 1 。 在含氧的溶液中，通过旋转环一盘电极施加双阶跃脉冲电位，由于电极的旋转 在电极之间产生了层流作用，使溶液中的0 2 在盘电极上还原成h 2 0 2 ，而此时鲁米 诺不被还原。 o2 + 2h 十一h2 02( ep = - 0 70v ) h2 02 h oo 。+ h + ( pk a = 1 1 65 ) 碱性溶液中鲁米诺发生如下解离：。 n h h i ! i h 寺hn+ 甲 - h i 号= 兰 i h+ h + 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氮酶和胆碱生物传感器研究 第一章 氧化还原反应是发生在双阶跃正脉冲时的环电极上： h o d + h o o + 上+ 0 2 +旷( e p 2 - 0 1 0 v ) h o o 0 2 - + 旷 ( p l ( a 2 4 8 5 ) p t + i - 1 2 0 - p t o + 2 h + ( e p = o 5 0 v ) 而文献【7 2 1 报道的a b e l 的电化学发光是由于电极上产生c 1 0 。离子，分解成具 有较强氧化能力的【o 】，氧化a b e l 而导致发光。 f ：! - l _ + o2 + 尸 7 h b ) 发光物直接接受电极提供的能量生成激发态或自由基离子： 4 。 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究第一章 安镜如等人提出在含有鲁米诺的碱性介质中施加正矩形脉冲时，鲁米诺的电 化学发光机理如下【7 3 】： n ho h i ；o n h i f 二 l n h 。7 去 n 。”“ & o 啦佃， 鲁米诺在碱性介质中与o h 作用，继而在电极上被氧化成( c ) ，而( c ) 中一n = n 一键级增大，而c n 键级减小，这样有利于c n 键的断裂和一n = n 一以n 2 的 形式脱离母体，产物为激发态的3 一氨基邻苯二甲酸根，从而导致发光。 c ) 近年来提出的一些新见解 林祥钦【7 4 】等提出一种使用循环伏安( c v ) 扫描电位下的电化学发光研究方法， 发现碱性鲁米诺体系在玻碳电极( g c e ) 上呈现2 个阳极发光峰( 在o 3 2 v0 3 9 v v s a g ) 和1 个阴极发光峰( 在一0 6 2 v ) ，在p t 电极上呈现2 个阳极发光峰( 在0 4 9 v 0 7 5 v ) 。结合c v 、一阶微分伏安、c l 离子影响等分析，提出了5 通道p r e c l 机理假设：( 1 ) 鲁米诺在g c e 上氧化发光；( 2 ) h 2 0 2 促进鲁米诺在g c e 电极上氧 化发光；( 3 ) 0 2 在g c e 上阴极发生的h 2 0 2 ，h 2 0 2 氧化鲁米诺发光；( 4 ) p t 电极上 电生的p t o 氧化鲁米诺发光；( 5 ) p t 电极上电生的【o 氧化鲁米诺发光。 1 1 4 电化学发光的应用【7 5 】 在电物理化学中的应用： a ) 电极表面活性分布的表征【7 6 8 1 】 利用电化学发光成像可以很好地观察电极表面电化学发光强度的分布情况， 而电化学发光强度对电极表面的活性具有很大的依赖性，因此利用电化学发光成 像法可以直观地反映电极表面活性分布。 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究第一章 b ) 电极表面粗糙度的表征8 2 】 1 9 8 8 年，b a r d 研究组研究了工作电极与对电极之间的距离对电化学发光强度 的影响，发现电化学发光强度与电极之间的距离在一定范围内呈线性关系。基于 该实验结果，他们提出了利用电化学发光方法来表征电极表面粗糙度的新方法。 该方法是通过精密仪器控制超微电极在所研究的电极上扫描，并记录电化学发光 强度与电极所在位置的关系，根据电化学发光强度变化的情况间接地反映出电极 表面的粗糙度。 c ) 流体动力学及反应动力学的研究【8 3 , 8 4 】 由于电化学发光试剂是在电极表面上产生的，因此通过电化学发光成像法对 电化学发光过程进行跟踪，了解电化学发光强度分布随时间变化的情况，就可以 在一定程度上推断出电极上产生的试剂走向，为考察微区中溶液的流动情况提供 一种简单的新方法。 将电化学发光用于研究反应动力学是由n i e m a n 研究组提出的。一种方法是通 过对电极化学发光强度与时间的暂态关系曲线进行拟合，计算出反应的速率常数。 第二种方法是通过观察电化学发光与时间的暂态关系曲线的形状来初步估计反应 的快慢。第三种方法是通过电化学发光成像法与流动注射相结合的方法来初步反 映电化学发光反应的快慢。 d ) 电子转移机理的研究【8 5 - 9 6 有许多电化学发光方法可以用于研究电子转移机理。如通过电化学发光效率 来判断电子转移机理；通过对电化学发光的暂态曲线的变化可以判断电子转移机 理是否发生变化；通过磁场对电化学发光强度的影响来判断电子转移机理；通过 扩散层内反应速率的计算机模拟可以确定发光反应是否通过单重态途径来产生激 发态的；通过加入一些吸附体，可以研究反应的中间体等。 e ) 其他 9 7 , 1 0 8 1 另外，电化学发光还可以用于对d n a 与金属络合物的相互作用研究，观察酶 活性的变化，发光器件等的研究。 在分析科学中的应用： a ) 无机物的测定 芬兰的h a a p a k k a 等n 0 9 】人发现在含有鲁米诺的甘氨酸介质中，痕量的c u 2 + 对 鲁米诺e c l 具有催化作用，测定c u 2 + 的线性范围为1x1 0 。7 6 1 0 一m o l l ，只有 6 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究第一章 h g ( i i ) ，p b ( i i ) ，m n ( 1 i ) 等离子干扰较严重。对于c o ( i i ) 的测定，他们亦作了较为 详细的研究【1 1 0 。1 12 1 ，在n a c l h 3 8 0 3 - - n a o h ( p h = 1 0 ) 体系中，c o ( i i ) 测定的范围 为3 1 0 。6 2 1 0 m o l l ，而在n a c l 一甘氨酸缓冲介质中，测定的线性范围增大 至1x1 0 刁6 l o 6 m o l l ，检测限达0 1 3 u g m l 。h a a p a l 【l ( a 【3 】等人还采用氧化膜铝 电极阴极电化学发光法测定水溶液中痕量的铜( 5 1 0 。9 m o f l ) 和铊( 1 0 o t o o l l ) 。 b ) 有机物的测定【1 1 4 】 芳香族化合物具有刚性平面结构的电子共轭体系，电解可产生较稳定的游 离基离子，并可获得较高的荧光量子产率，因而它常常是e c l 测定和研究的对象， 例如5 , 6 ，1 1 ，1 2 ，一四苯并四苯。h a a p a k k a 等对在含8 2 0 8 2 。、成胶束的表面活性剂和 多环芳香烃的乙酸盐水溶液中阴极极化时，发现产生电致化学发光现象，此时， 发光的物质是被胶包裹的多环芳香烃，对9 ，1 0 一二苯基葸进行测定，检出限为1 0 8 m o l l 。在还原水溶液中的k 2 s 2 0 8 时，有机荧光化合物能使阴极的电致化学发光强 度大大增加，所产生的电致化学发光光谱与该荧光化合物产生的荧光光谱十分相 似，对荧光试剂水杨酸进行测定，检出限为3 x 1 0 一m o l l 。 由于电致化学发光法的连续可测性为作为液相色谱的检测器提供了可能，因 此，电致化学发光法测定有机化合物的一个主要的途径是用作液相色谱的检测器。 t s u k a g o s h i l l l 5 】等利用三联吡啶钌的e c l 测定了吐根碱二硫代氨基甲酸铜。 c o l l i n s 1 1 6 1 报道了肼类气体物质的e c l 测定。f o r i b e s 1 1 7 】等将三联吡啶钌的e c l 和 毛细管电泳的高效分离结合，从而测定了几种1 3 阻断剂。c h e n t l l 明等利用e c l 对吲 哚和色氨酸进行了测定。r i d l e n 1 1 9 】等将h p l c 和e c l 联用对n 一磷酸亚甲基一甘 氨酸进行了测定。 在生化、药物及免疫分析中的应用： a ) 生化分析 高效液相色谱和电化学发光联用将是一种重要的生化分析手段。s k o t t y 1 2 0 等 对尿液和血清中草酸的浓度进行了测定，其检测限可达1 0 2 m o l l 。u c h i k u r a 1 2 1 】 等测定了样品中的色氨酸，检测限达1 0 。1 2 m o l l 。j a n u s z 1 2 2 】等报道了用柠檬酸一甲 醇一0 2 体系对一些抗氧化剂和自由基反应的抑制剂进行e c l 测定，如1 3 一胡萝卜 素、生育酚等。一些陆生和海洋生植物中叶绿素也可用e c l 测定。有人利用电化 学发光法监测卵巢和肝脏中类脂瘤的生长情况。 b ) 药物分析 7 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究第一章 g r e e w a y l l 2 3 】把硅光二极管用作流动注射电化学发光( f i a e c l ) 分析的检测器， 并建立了r u ( b p y ) 3 2 + 和t p a 进行e c l 的测定方法，检测限达1 0 毋g m l ，动力学范 围为3 个数量级。这种方法已被用于选择性地测定1 3 一肾上腺功能药物氧烯洛尔， 线性范围为0 1 4 0 1 x m o l l ，检测限为3 5n m o l l 1 2 4 1 。他们还建立了局部麻醉药丁卡 因、布比卡因、利多卡因、丙胺卡因和普鲁卡因的e c l 测定方法【1 2 5 1 。抗抑郁药阿 米替林的e c l 测定也被报道【1 2 6 1 。他们还用e c l 方法测定了具有麻醉作用的药物 可待因、海洛因和具有镇咳作用的药物右美沙芬。 l i a n g 1 2 7 】等先用b 一内酰胺酶水解打开1 3 一内酰胺环，然后用e c l 的方法间 接测定了1 0 种含有该环的抗生素药物。有趣的是当他们把其中的胺比西林 ( a m p i c i l l i n ) 和6 一氨基青霉烷酸( 6 - - a m i n o p e n c i l l a n i c a c i d ) 与r u ( b p y ) 3 2 + 形成酰胺键 后，继而用b 一内酰胺酶水解进行e c l 测定，发现灵敏度提高了1 2 5 倍【1 2 8 】。e c l 还被用于红霉素和磷酸克林霉素的测定。e c l 还被用于液相色谱的柱后检测来测 定非尼拉敏( p h e n i r a m i n e ) 、溴苯涕敏( b r o m p h e m i r a m i n e ) 、苯海拉明、氯苯钠敏 ( c h l o r t h e m i r a m i n e ) 、和美吡拉敏( m e p y r a m i n e ) 等抗组胺药。另外，把e c l 和流动 注射技术结合来测定痕量的氢氟噻嗪( h y d r o f l u m e t h i a z i d e ) 、环噻嗪( e y l o t h i a z i d e ) 和 氯噻嗪等利尿降压药也被报道【1 2 9 1 。 c ) 免疫分析 e c l i a 是一种将电化学发光( e c l ) 和免疫检测这两种分析方法与生物素、亲和 素及固相磁微珠相结合而融于一体的新的标记免疫分析技术，它在生命科学研究 中将发挥重要作用。w i l s o n 1 3 0 】等以鲁米诺为发光试剂，利用e c l i a 技术测定了除 草剂a t r i z i n e 。l i n t b l 】等研究了吖啶酯一甲基一9 一( 对一甲酰苯基) 吖啶氟磺酸盐 ( m f p a ) 的e c l 反应，并利用该酯作标记物用于h c g 的免疫分析。利用e c l i a 检 测人t 细胞白血病病毒1 型( h t l v - 1 ) 、血中前病毒( p r o v i r u s ) 和血清中b d v 病 毒【1 3 2 1 。g a t t o 1 3 3 】等人采用e c l i a 分析仪，测定了多种生物毒素，如肉毒毒素、霍 乱毒素一b 亚单位、蓖麻蛋白、金黄色葡萄球菌肠毒素等，并检测了炭疽杆菌芽 孢，最小检出值为1 0 0 个芽孢。 利用竞争和双抗体夹心免疫电化学分析( e c l i a ) 测定促黄体激素( l h ) 、牛血清 i g g 、牛血清生长激素、胰岛素样生长因子( i g f 1 ) 和鲑甲状腺降钙素已被报道【1 3 4 1 。 人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 、前列腺异性抗原( p s a ) 、和促甲状腺激素( t s h ) 可用双 抗夹心e c l i a 测赳1 3 3 7 1 ，地高辛、雌二醇和游离甲状腺素( f t 4 ) 可用竞争e c l i a 8 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究第一章 测定。i g e n 公司还把此技术用于肌钙蛋白【1 3 8 】、胰岛素、甲胎蛋白( a f p ) 、促卵泡 激素( f s h ) 、癌胚抗原( c e a ) 【1 3 9 1 等对生命活动有重要意义的物质的测定。b o c h r i n g e r m a n n b e i m 公司已把e c l i a 技术用于人体肿瘤相关糖蛋白的测定【1 4 0 1 。 另外，体内细胞因子种类很多，但各自含量均较少，常规检测方法难以得到 准确结果，而用e c l i a 能很好地解决这一不足。 1 2 生物传感器 1 2 1生物传感器的特点 生物传感器是生物，化学，物理，医学，电子技术等多种学科相互渗透在一 起，处在生命科学和信息科学的交叉区域的一种新技术。生物传感器作为直接或 间接测定生物分子、生理或生化过程相关参数的新方法，具有样品用量少、选择 性高，分析速度快，简单易操作和仪器价格低廉等特点，而且可以进行在线甚至 活体分析。 1 2 2生物传感器的传感原理 生物传感器的构成包括二个部分：生物敏感膜和换能器，见图1 生物敏感膜 是生物传感器的关键部件，由膜基质和敏感材料组成。可做敏感材料的生物材料 有：酶、微生物、动植物组织切片、抗体、细胞和核酸等；与敏感膜组合的换能 器可以是多种类型的物理或化学传感器，如电化学( 电流测定、电位测定、电导 测定、阻抗测定) 、光学( 光致发光、共振表面等离子体) 、机械( 杠杆、压电反 应) 、热( 热敏电阻) 或者电( 离子或者酶场效应晶体管) 等等。被分析物扩散进 入固定化生物敏感层，经分子识别，发生生物学反应，产生一次信息继而被相应 的物理换能器、化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经过二次仪表( 检 测放大器) 放大输出， 图1 生物传感器传感原理 1 2 3酶生物传感器 酶生物传感器的发展： 9 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究 第一章 a )第一代经典电化学生物传感器 1 9 6 2 年，在纽约科学院学术会议上，c l a r k 矛d l y o n s 在氧电极的基础上首次描述 了酶传感器，提出了研制葡萄糖酶传感器的设计原理；1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 用聚 丙烯酰胺凝胶固定葡萄糖氧化酶( g o d ) 成膜和氧电极组装在一起，制成了第一种生 物传感器，即葡萄糖酶电极生物传感器【1 4 2 】。它标志着第一代生物传感器的诞生， 从理论和实践上为生物传感器的发展奠定了基础。 第一代生物传感器采用共价交联法有效地减少或消除敏感材料从载体上脱 落，提高传感器的稳定性；天然介体氧直接参与酶促反应，通过电子在反应中心 与电极表面之间的传递，实现生化反应信号向电信号的转换，由于直接的电子传 递过程较慢，传感器对底物敏感性不够理想，而且传感器容易受到环境氧浓度的 影响。此外，在电极反应的过程中，需要较高的极化电位，大约在0 6 0 8v 【1 4 3 朋5 1 ， 在如此高的电位下进行氧化测定，试样中共存的其它电活性物质，如抗坏血酸( 维 生素c ) 和尿酸等，也可以在此电位下氧化而产生氧化电流，给测定带来干扰，因 此该方法的灵敏度和选择性相对较差。 b )第二代介体酶生物传感器 2 0 世纪9 0 年代初，生物传感器进入第二代的研究。第二代生物传感器采用化 学介体或特定生物分子取代0 2 i - 1 2 0 2 在酶促反应中和电极之间进行电子传递。其原 理如下： 酶层： g o d ( o x ) + g l u c o s e _ g l u c o n o l a c t o n e - 4 - g o d ( r e d ) 修饰层：g o d ( r e d ) + m ( o x ) _ g o d ( o x )+ m ( r e d ) 电极：m ( r e d ) _ m ( o x )+ n e 第二代酶生物传感器在酶电极上增加了化学修饰层。化学修饰层的目的是为 了扩大基体电极检测化学物质的范围，同时也提高了测定的灵敏度。基体电极经 过修饰后，可以看成是一个经过经改进的信号转换器，这种修饰剂称为电子转移 媒介体。电子媒介体的作用是促进电子传递过程，降低工作电势，以排除其他电 活性物质的干扰【1 4 6 】。 常见的媒介体主要有：二茂铁及其衍生物、有机染料、有机介体、四硫富瓦 烯、苯醌、对苯二酚和甲苯胺蓝等。但该方法的缺点是加入媒介体易污染电极， 影响电极的性能【1 4 6 。有文献报道用一种吩噻嗪类化合物亚甲蓝作为化学介体对玻 碳电极进行修饰，并以此修饰电极为基础研制酶电极，采用从香蕉中获得的组织 l o 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究 第一章 材料为酶源，研制成了一种多酚酶生物传感器7 1 。 c )第三代直接电化学生物传感器 第三代生物传感器既不需要氧分子，也不需要化学介体分子作为电子传递体， 通常还不需要固定化载体，而是将酶分子直接吸附固定到电极表面，使酶的氧化 还原活性中心与电极直接“交流”，能够更快地进行电子传递，从而使酶电极生 物传感器的响应速度更快、灵敏度更高，真正成为“无试剂分析 【1 4 引。以葡萄糖 氧化酶催化葡萄糖为例： 酶层：g o d ( o x ) + g l u c o s e g l u c o n o l a e t o n e + g o d ( r e d ) 电极：g o d ( r e d ) _ g o d ( o x ) + n e 酶直接电化学和第三代酶生物传感器已成为生物电化学研究的重要发展方向 之一。由于酶通常有较大分子量，酶分子的电活性中心深埋在分子的内部，且在 电极表面吸附后易发生变形，所以酶与电极间难以直接进行电子转移。因此，与 其他氧化还原蛋白质如细胞色素c 、血红蛋白和肌红蛋白等相比，他们的直接电化 学研究更加困难。到目前为止，仅有过氧化物酶【1 4 9 - 1 5 1 】氧化酶【1 5 2 - 1 5 4 1 、氢化酶和脱 氢酶【1 5 5 ，15 6 1 ，对甲酚甲基羟化酶【1 5 7 】超氧化物歧化酶【1 5 8 ，1 5 9 】等少数几种分子量相对 较小的酶，能够在电极上直接进行有效的电子转移。酶作为一类典型的生物大分 子和特殊的催化剂，在生命过程中扮演着极其重要的角色。归纳起来能实现酶直 接电化学的方法有四种：( 1 ) 使用电子转移促进剂；( 2 ) 化学修饰形成电子转移中继 体；( 3 ) 酶吸附在电极表面的直接电化学；( 4 ) 酶固定在导电聚合膜内的直接电化学。 文献报道在碳纳米管修饰电极上实现了葡萄糖氧化酶的直接电子转移【1 6 0 1 ，制 备了碳纳米管修饰的玻碳电极，利用吸附方法将葡萄糖氧化酶固定到玻碳电极表 面，形成葡萄糖氧化酶玻碳电极；以及在制备亲水金纳米颗粒的基础上，与明胶 一起固定葡萄糖氧化酶，制得具有纳米增强效应的葡萄糖传感器【1 6 1 】。实验表明： 纳米颗粒能够大幅度地提高固定酶的催化活性，提高响应灵敏度，且电极响应迅 速，一般在5 s 之内就能测得稳定的电流响应值。c o o p e r 1 6 2 】等通过碳化二亚胺 ( h n c n h ) 缩合，把细胞色素c 共价键合到n 乙酰半胱胺酸修饰金电极，使细胞色 素c 与修饰电极间的直接电子传递得以发生，由此做成的生物传感器对超氧化合物 有很好的响应。后来他们又进行了对比试验，把细胞色素c 吸附到镀铂电极上测定 超氧化合物与通过镀铂电极测定超氧化物歧化酶催化底物产生的h 2 0 2 相对比，结 果显示，前者的灵敏度更高，同时也证实了直接电子传递的发生。 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究第一章 基于直接电子传递的生物传感器已经研制成功，但是，所报道的生物传感器 都不太理想，主要是这种原理仅限于少数氧化还原酶和氧化还原蛋白，对大部分 生物催化剂还不适用。采用适当的修饰膜技术可以使蛋白质结构略为变化而不影 响原有的活性，有利于扩大该方法的应用范围。此外，纳米修饰技术、生物模拟 分子印迹技术等都有希望成为直接电化学生物传感测定的主流技术。 酶的固定化方法： 要使酶作为电化学生物传感器的敏感膜使用，必须将酶固定在电极表面即在 电极表面覆盖一层敏感膜。膜的厚度、致密性，均匀度与分子排列的有序性等都 对酶电极的性能有影响。而且在固定过程中，既要保持酶本身的固有特性，又要 避免自由酶应用上的缺陷。因此酶的固定化技术决定着酶电极的稳定性、选择性 和灵敏度等主要性能，同时也决定酶电极是否具有研究和应用价值。 为了研制价格低廉、灵敏度高、选择性好和寿命长的酶电极，固定化技术已 成为世界各国竞相研究和探索的目标。经过2 0 年来的不断工作，已建立了多种酶 固定化方法，目前，被广泛研究的固定化技术主要有吸附法、共价键合法、交联 法、包埋法、组合法和电化学聚合法等。 a )吸附法 酶在电极表面的物理吸附是一种较为简单的固定化技术。吸附法是通过酶分 子极性键、氢键、疏水键以及静电等作用，将酶吸附于不溶性载体上。此法多以 无机材料为载体，主要包括多孑l 玻璃【1 6 3 1 、活性炭【1 6 4 1 、氧化铝f 1 6 5 】等。吸附法具有 酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失少，但是它 有酶与载体相互作用力弱、易脱落等缺点，若能找到适当的载体，这是很好的固 定化酶的方法【1 6 6 】。在进行固定吸附前，一般需对电极表面进行处理。同其他化学 方法相比，对酶活性影响较小，但对溶液的p h 变化、温度、离子强度和电极的基 底较为敏感，需要对实验条件进行相当程度的优化。i k a r i y a m a 等 1 6 7 】采用微铂电极， 在含有氯铂酸和葡萄糖氧化酶的溶液中进行恒电流或恒电位点解，使酶分子吸附 在电解过程中产生的铂黑微粒上。铂黑的微孔具有较大的比表面积，对酶产生强 烈的吸附。 ”共价键合法 使酶通过共价键与电极表面结合而固定的方法称为共价键合法，这种方法通 常要求在低温、低离子强度和生理p h 条件下进行，并常加入酶的底物与防止酶的 1 2 基于电化学发光的尿酸、谷丙转氨酶和胆碱生物传感器研究第一章 活性部分与电极表面键合。电极表面的共价键合较吸附困难，但提供了较稳定的 固定化酶，因此被较多的采用。 t h o m a s 掣1 6 8 1 先将铂电极进行阳极氧化使其表面形成氧化物，然后与硅烷化试 剂反应，形成带胺基的表面基团，再与戊二醛反应，形成可以与葡萄糖氧化酶固 定在电极表面。r a m 等【1 6 9 1 利用带正电的聚吡咯，以静电力