（分析化学专业论文）单细胞酶传感器的制备及应用.pdf

山东大学预t 学位论文 中文摘要 本论文用研制的单细胞酶传感器对单个嗜酸性粒细胞的释放物一h 2 0 2 进行了 研究。论文分为两章：第一章单细胞酶传感器的制备、表征及简单应用。第二 杼币钔咆聊忙傅器用丁瞥个嗜酸件粒细胞受p m a 刺激所释放的h 2 0 2 的定量检 测。 第一章利用光刻和化学腐蚀的技术首先在玻璃平板上加工一个纳升的微池 阵列，用推片法将单个中性粒细胞置入微池中，并用变性胶原固定，然后用毛地 黄皂苷( d i g ) 进行细胞蚀孔，最后微池中加入支持电解质并插入一支复合微电 极，制成单细胞酶传感器。复合微电极由金( a u ) 圆盘工作电极和a g a g c i 微 参l v a e 极组成，其中a u 圆盘电极的直径为2 0 岬左右，a g a g c l 参比电极的直 径为1 0 0p m 左右。该复合电极是将两支电极放入一支o 管内制成的，其尖端不 到2 0 0i t m ，以适合微池内检测微量物质的需要。单细胞传感器对h 2 0 2 的测定原 理是：利用传感器上中性粒细胞中所含的过氧化物酶( p o ) 能够催化过氧化氢 ( h 2 0 2 ) 和氢醌( h 2 q ) 的化学反应，生成酶促反应的产物一苯醌( b q ) 和水， 利用微电极对电活性产物b q 的伏安检测，最终实现对h 2 0 2 的测定。制作好的 单细胞酶传感器用于h 2 0 2 的测定，重现性良好，结果满意。本章有两个难点， 一是在复合电极制作过程中要将工作电极和微参比电极完好地插入0 管内，两者 互不接触，0 管尖端封胶要均匀，不能碰坏电极，能有效防止溶液进入0 管内部； 二是利用光刻和化学腐蚀法制备微池阵列，并把单个中性粒细胞固定在微池底 部。 弟_ 二卓建立j ，单细胞酶传感器定量检测单个嗜酸性粒细胞的释放物的新方 法。通过推片法将人的单个嗜酸性粒细胞转移到已装配有单细胞酶传感器的微池 中，用自制的纳升加样器加入含有化学物质佛波酯( p m a ) 的反应液对嗜酸性 粒细胞进行刺激，刺激时问1 2 0 分钟，使其释放出h 2 0 2 ，用单细胞酶传感器对 释放物一h 2 0 2 进行测定。测定的原理是：受p m a 的刺激后，嗜酸性粒细胞能够 释放出活性氧物质，其稳定存在形式是h 2 0 2 。释放产生的h 2 0 2 在p o 催化下与 堕掣坠兰丝墼 h 2 q 反应生成b q ，然后b q 在a u 电极上被还原，记录0 0 5 0 4v 的线性扫描 伏安曲线，测b q 发生还原所产生的电流，从而确定微池内h 2 0 2 的浓度，再川 对比法计算出细胞释放的h 2 0 2 含量用该法测得单个嗜酸性粒细胞刺激1 2 0 分 钟后的h 2 0 2 释放量大约为7 0 1 0 小m 0 1 。 主题词：复合电极，单细胞酶传感器，电化学检测，单细胞释放物( h 2 0 2 ) a d s t r a c t t h i st h e s i su t i l i z e st h es i n g l ec e l le n z y m es e n s o rw eu s e dt o q u a n t i t a t i v e l y m e a s u r et h em a t t e rs i n g l ee o s i n o p h i lc e l lr e l e a s e da f t e ri tw a ss t i m u l a t e dw i t h d r u g s t h i st h e s i si sd i v i d e di n t ot w op a r t ：i nc h a p t e ri ：s i n g l ec e l le n z y m es e n s o r s w e r em a d e ，c h a r a c t e r i z e da n du s e ds i m p l y i nc h a p t e ri i ：s i n g l ee o s i n o p h i lc e l lw a s a c t i v a t e dw i t hp m aa n dr e l e a s e dh 2 0 2a n dw ed e t e r m i n e dh 2 0 2q u a n t i t a t i v e l yu s i n g s i n g l ee n z y m es e n s o rw i t ha d u a lm i c r o e l e c t r o d e i nc h a p t e ri ；aa r r a yo f m i c r o c e l l sw i t l lt h ev o l u m en a n o l i t e rw e r ef a b r i c a t e db y t h ew a yo fl i t h o g r a p h ya n de t c h i n g s i n g l en e u t r o p h i lw a sc o n v e r t e di n t om i c r o c e l lb y p u s h i n gs l i d ea n di m m o b i l i z e dw i t hd e n a t u r e dc o l l a g e no bt h eb o t t o mo ft h e m i c r o c e l l s c o n d l y , d i gi np b sb u f f e rc a nd i s s o l v ec h o l o s t e r o l0 nt h ec e l lm e m b r a n e a n dm i c r o h o l e sw e r el b r m e d0 1 1i t f i n a l l yad u a le l e c t r o d ew a si n t e g r a t e dw i t hi t s o t h es i n g l ec e l le n z y m es e n s o rw a sm a d ec o m p l e t e l y ad u a le l e c t r o d ec o n s i s t so ft w o e l e c t r o d e o n ei sa ud i s kw o r k i n g e l e c t r o d ew i t hi t sr a d i u s1 0t u n ，t h eo t h e ri s a g a g c lm i c r o r e f e r e n c ee l e c t r o d ew i m i t sr a d i u s5 0 肛m t h er a d i u so ft h et i po fd u a l e l e c t r o d ei sl e s st h a n1 0 0 t x m s ot h a tt h i sd u a le l e c t r o d ec a ni n s e r ti n t ot h em i c r o e e l l w em a d e t h ep r i p i n c l eo fs i n g l ec e l le n z y m es e n s o ri st h a th 2 0 2r e a c t sw i t hh 2 q w i t ht h ee n z y m e m p oi ns i n g l en e u t r o p h i lc e l la n dt h er a t eo f t h i sr e a c t i o ni sf a s t e n e d g r e a t l y t h ep r o d u c to ft h i sr e a c t i o n - b qw a sd e o x i d i z e do nd u a le l e c t r o d e i nt h i s w a y , w ed e t e c th 2 0 2q u a n t i t i v a t e l y t h er e p r o d u c t i o no ft h es i n g l ec e l l i s v e r y g o o d r l h c l ca r cl 、od i m c u l i t i c sd u r i n gt h i se x p e r i e n t o n ei st h a tt h ep r e p a r a t i o no f d u a le l e c t r o d ea n dt h eo t h e ri st h ep r e p a r a t i o no fm i c r o c e l la r r a yw i t ht h ew a yo f l i t h o g r a p h ya n de t c h i n ga n ds i n g l ec e l li si m m o b i l i z e do nt h eb o t t o mo ft h em i c r o c e l l w i t ht h ed e n a t u r e dc o l l a g e n i nc h a p t e ri i ：an e ww a yo f d e t e c t i o no f t h es u b s t r a t eo f s i n g l ee o s i n o p h i lr e l e a s e w i t h s i n g l e c e l l e n z y m es e n s o rw a sd e v e l o p p e d f i r s t l y , s i n g l ee o s i n o p h i lw a s c o n v e n e di n t os i n g l ec e l l e n z y m es e n s o ra n da c t i v a t e dw i t l lr e a c t i o nm i x t u r e c o n t a i n i n gc h e m i c a ls u b s t a n c e - p m a s e c o n d l b i tr e l e a s e dm a t t e r - h 2 0 2d e t e c t e dw i t h s i n g l ec e l le n z y m es e n s o r t h en a n o l i t e ri n j e c t o rw a sh o m e b u i l t 。t h ea c t i v a t i n gt i m e w a s1 2 0m i n t h e p r i n c i p l e o fd e t e c t i o n q u a n t i t i v a t e l y i s e x p l a i n e d b e l o w f i r s t l y , s i n g l ee o s i n o p h i lr e l e a s e dr o s i t ss t a b l ef o r mi sh 2 0 2a f t e ri ti sa c t i v a t e d h 2 0 2 r e a c tw i t hh 2 qa n dt h i sr e a c t i o np r o d u c eb qa n dh 2 0 a n dt h e nb qi sd e o x i d i z e do n d u a le l e c t r o d eu n d e rm p oi ns i n g l ec e l le n z y m es e n s o rs ot h a th 2 0 2w a sd e t e c t e d q u a n t i t a t i v a t e l y l i n e a rs a n n i n gv o l t a m m e t r yc h i v ew a sr e c o r d e dd u r i n go 0 5 0 4 v a nt h a tw a yw ec a l lc a l c u l a t et h ec o n c e n t r a t i o ni nt h em i c r o c e l l w ed e t e r m i n e dh 2 0 2 s i n g l ee o s i n o p h i lr e l e a s e dw h e ni tw a s a c t i v a t e db yc o n s t r a s t k e y w o r d s ：d u a le l e c t r o d e ，s i n g l ec e l le n z y m es e n s o r s i n g l e c e l lr e l e a s e ( h 2 0 2 ) ，e l e c t r o c h e m i s t r yd e t e r m i n e i i 符号与缩写 s e c m 扫描电化学显微镜 b s a 牛血清白蛋白 b q1 , 4 一苯醌 1 1 2 ql ，4 对苯二酚，氢醌 d 扩散系数 d i g 毛地黄皂苷 p b s 生理盐水 h r p 辣根过氧化物酶 m p o 髓过氧化物酶 p m a 佛波醇1 2 十二酸盐1 3 醋酸盐 f i c o l l 4 0 0 聚蔗糖 t r y p a n b l u e 台盼兰 e d t a 乙二胺四乙酸二钠 计探头上的电流 f t 。探头上的稳念扩散电流 r 氧化还原的电子转移数 h 2 0 2 过氧化氢 i m m a 浆i i i 丛内烯救酯 p d m s 聚二甲基硅氧烷 s o i g e l 熔胶凝胶 p d d a 聚二烯丙基二甲基氯化铵 p s c p r o b es c a nc u r v e ( 探头扫描曲线) p a c p r o b ea p p r o a c hc u r v e ( 探头逼近曲线) s a m 单分子自组装 原创性声明 本人郑重声i ! f = i ：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：日期：! 煎! ：! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：期：竺： 山东人学预 学位论文 前言 一、酶电极 1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 制备出第一支酶电极【l 】( 如图1 所示) ，他们把筒 葡辘氰化酶包埋在凝胶中，然后用带有小孔( 直径为5 0 3 0 0u m ) 的塑胶薄膜 将酶凝胶层包起来固定到氧电极上，测定血液或血清中的葡萄糖，其测量的浓度 范围为0 2 0 0 m g m l ，首次实现酶电极的应用。 塑胶薄膜 葡萄糖 0 2 h 2 0 2葡萄挑酸 酶凝股层 gh l 极 图1 酶电极的结构示意图 f i g 1 ：t h es t r u c t u r eo f e n z y m ee l e c t r o d e 所谓酶电极就是把酶固定在电化学电极的衷面上制成的电极。它利用酶在生 化反应中能够发生特殊的催化作用，将反应过程中消耗或产生的化学物质用能换 转换器变成电信号再记录下来【2 】。电极上固定的酶有如下特点：( 1 ) 酶与电极 表面足紧密接触的；( 2 ) 通过适当地控制固定的酶的微环境( 即通过化学修饰电 极表面) ，可获得很多所需的性质，如增加酶的稳定性、高灵敏度、快速的响应、 高取样速率；( 3 ) 酶电极的尺寸，形状和表面性能方面具有较大的灵活性：( 4 ) 防止溶液中其他物质的干扰和对电极表面的玷污等【3 】。 由于酶电极上固定的酶可重复使用，稳定性好，对抑制剂和激活剂的敏感度 低，比较经济，催化效率高，所以发展非常迅速【4 】。1 9 9 4 年，m i c h a e l ，g 等把胆碱 氧化酶和辣根过氧化物酶共同固定到7 l o 肛l 的碳纤维圆柱电极上，用来定量检测 大脑组织胞外体液中的胆碱，检测限达到 l m o l 级【5 】。c o n s t a n t i n o sgt s i a f o u l i s ， p r o d t o m i d i s 【6 】等把酶电极和流动注射分析结合起来检测植物样品中的黑芥子硫苷 酸9 i f 。l a n q t i nm a o 7 】等用环状玻碳膜电极在线检测大脑产生的过氧化氢x i ny u 8 】 等用超漳导电聚合物把酶包埋固定到热裂解石墨电极上，大大提高了酶的催化反 些銮盔竺堡：! ：兰竺堡苎 应效率。k i mm m i t c h e l l 【9 】制备了乙酰胆碱和胆碱安培酶传感器，对仆内毋i f 小外 的胆碱和乙已腰碱同时进行了测定。 1 、酶电极的种类1 1 0 l 酶电极按结构分为两类：即紧密型和分离型 紧密型酶电极：如将酶结合在具有微孔的聚氯乙烯或聚p q 氟乙烯i ：他胁川棚 化，然后再将含有固棚酶的薄膜密封在其基础电极的敏感面上制成的酶f l l 极( 如 图2 a 所示) 。 分离型酶电极：如把固定化的酶填充在反应柱内，组成有反应柱的液流系统， 然后再在酶柱后连接一个基础电极，酶柱和基础电极处于分离状态( 盘阁2 b 所 示) 。 t 1 ) 图2 ：两类酶电极的示意图 ( a ) 紧密型酶电极( b ) 分离型酶电极 f i g u r e2 ：t h es t r u c t u r e so f t w ok i n do f e n z y m ee l e c t r o d e ( a ) t h ec o m p a c te n z y m ee l e c t r o d e ( b ) t h es e p a r a t ee l e c t r o d e 2 、酶的固定方法 酶具有专一性强，催化效率高和作用条件温和等显著特点，但足4 ：使川 j 的 过程中，人们也注意到酶的一些不足之处【l l 】： ( 1 ) 酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如在食品、轻工领域广泛心川 的a 一淀粉酶、在p c r 技术巾普遍采用的t a q 酶、胃蛋白酶等可以忍受较低的p i i 条 件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，晰较 易变性失活。 ( 2 ) 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶存反庸系统 中与底物和催化反应产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也棚 2 斤勰 基 加夸 姚0 心 山东大学硕i 学位论文 以回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难以连续化 生产。 ( 3 ) 产物的分离纯化较困难：酶参加反应后成为杂质与产物混在一起，无疑 给产物的进一步分离纯化带来一定的困难 为此，人们针对酶的不足寻求其改善方法。其办法之一就是固定化技术的应 用。固定化酶的研究从2 0 世纪5 0 年代开始，1 9 5 3 年德国的格鲁布霍费( g r u b h o f e r ) 和施莱思( s c h l e t i n ) 采用聚氨基苯乙烯树脂为载体经重氮化法活化后，分别与 羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。 酶电极制备的关键技术就是酶的固定化，即在电极表面覆盖层敏感膜膜 的厚度、致密性、均匀度与分子排列的有序性等因素对酶电极的性能也有一定的 影响。目i ；i 固定方法很多，常用的有吸附法、组合法、包埋法、交联法以及共价 键合法等等。 2 1 、物理吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法 称为物理吸附法，简称吸附法对于酶电极来说，就是将含有酶的溶液滴在电极 表面，溶剂自然挥发，酶滞留在电极上。此种酶的固定方法简单，操作条件温和， 但由于生物分子与固体表面结合力弱，易泄漏或解脱，稳定性较差，目自u 较少使 用。文献 1 2 1 报道将葡萄糖氧化酶结合于葡聚糖衍生物上，然后吸附于多孔碳电极 上构成酶传感器。由于葡聚糖衍生物增强了酶的稳定性及多孔碳的强吸附性，使 其具有较好的稳定性和重现性。蔡强【2 3 】等用静电吸附法制备了辣根过氧化物酶电 极，能够检测0 1m m o f l 的h 2 0 2 ，喻应迅速。 2 ，2 、组合法 组合法是将酶和电极材料简单的混合以制备固定化酶电极的一种方法典型 的是酶碳糊电极 1 3 】。y a m 锄o t o 【1 4 】用过氧化物酶、二茂铁、石蜡油、石墨粉混合 制成的碳糊电极用n a t i o n 的纤维树脂膜包裹后用于流动注射分析h 2 0 2 ，取得良好 效果。此外还有报道用有机导电盐做电极材料与酶混合制成的酶电极 1 5 】，此类酶 电极制作简单，电极表面可更新，缺点是电极表面不均匀，重现性差，酶有泄漏， 用酶量大，电极不易微型化。改进的方法有先将酶共价固定到甲壳粉上，然后同 碳粉及石蜡油组成酶碳糊电极【1 6 】。 2 3 、凝胶聚合物包埋法 山东大学硕十学位论文 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定的方法称为包删法。他蛐 法实际上是酶在凝胶聚合物基体中的物理保留。包埋法使用的多孑l 载体上婴仃： 琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、交叉菜胶、明胶、聚丙酰胺、光交联树脂、聚酰胺以 及火棉胶等。人们已经对许多种聚合物作为捕集酶的基质进行了全面的研究，如 明胶、环糊精、聚苯胺、聚氯乙烯、聚丙烯氰、聚乙烯亚胺及其它许多聚合物以 及胶体，利用他们的单体聚合时将酶一起包埋其中。此法优点是：可采用温年的 实验条件及多种凝胶聚合物；大部分酶可很容易地掺入聚合物膜中，一般不发，l 化学修饰；由于没有化学变化，对酶活性影响比较小；膜的孔径和几何形状较易 控制：包埋的酶比较牢固，并可结合其它固定方法如共价结合和交联进。步改进 包埋的稳定性s j u p d i k e 1 等利用凝胶包埋法制备了世界上第一支葡萄糖酶 乜 极。利用包埋法制备的酶电极的缺点是反应比较慢，物质传递足个麻烦。彭l 划治 等【2 4 】采用碳纳米管负载铂修饰电极结合溶胶凝胶技术制笛了 l 叫醇氧化i l l 极，纳米铂的引入提高了传输效率，响应时j 日j 只有2 0 s ，检测限达到t 1 t m o l l 级。 2 4 、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方 法，叫做交联法。常用的官能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯 等，最常用的是戊二醛。用戊二醛交联时采用的p h 值一般与酶或蛋白质的等l u 点 相同。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时问使用。马伞l i 【1 7 】等用牛血清、戊二醛溶液和酶混合后涂于电极上制成酶电极，但由于戊- 醛与 酶的氨基反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大，而 制 备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此k i m m m i t c h e l l 9 把包埋法和交联法结合起来使用，首先把苯乙烯单体电聚合到p i 电檄 上，然后把胆碱氧化酶和乙酰酯酶和牛血清白蛋白混合，最后在混合液中) q t l a 戊 二醛交联剂，快速用注射器把混合液沿水平方向注入剑电极的聚合层i ：。逊叫将 交联法与包埋法联合使用，以取长补短 18 】。 2 5 、共价键合法 通过共价键将酶与载体结合的固定方法称为共价键结合法。共价键合法实际 上是一种表面修饰，基质可以是转换器即电极本身或另外一利咱够在其操作l i i 沉 积到电极表面的聚合物材料，即通过共价键将酶直接结合到电极表面。如码水峻 苷共聚物，甲基丙烯酸酸苷共聚物及其衍生物，或其他带有- - o h ，- - n h 2 ，- - s h ， 山东大学硕士学位论文 - - c o o h 等功能基团的聚合物材料以薄层的形式沉积到整个电极上通过单体或 其衍生或其衍生物共聚合，或者通过与预聚物直接反应，可以将功能性基团加到 聚合物上，酶通过氨基酸残基进行结合【1 9 】。在利用天然材料如甲壳素 2 0 1 、丝索 蛋白【2 1 等固定酶时，通常也是用共价键合法，通过酶的氨基酸残基与其上的酰基 共价结合的，共价键结合的优点是酶结合的牢固、稳定性好。酶共价键合固定的 酶稳定性与其他方法相比是最好的。但如果共价键在生物分子的活性部位键合， 或反应条件苛刻，都会使生物分子的活性降低越来越多的人用单分子自组装法 先对电极进行修饰，然后再用共价键合法把酶固定到电极上，所用的电极是会、 银、铂和铜，主要是金电极。j j u s t i ng o o d i n g * ，d b r y n nh i b b e r t 2 2 对此进行了综 述。这种方法的优点是能通过控制单分子自组装从而控制酶分子在电极表面的排 椎从而使电极的重现性良好。其采取的一般步骤是( 图3 所示) ： 图3 ：利用胱胺借助d i d s 把纯酶自组共价固定到会电极上 f i g 3 ：s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ec o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o no f e n z y m et oas a mo f c y s t a m i n eu s i n gd i d s e - n h 2 ：酶s h c h 2 c h 2 c h 2 n h 2 ：胱胺 s = c = n = 一n ；n ( d i d s ) ：t r a n s 1 。2 二苯乙烯( 4 ，4 一二异硫氰酸) - - 2 ，2 - 二硫酸) e n h 2 ：e n z y m e s h c h 2 c h 2 c h 2 n h 2 ：e y s t a m i n e s = c = no n = c = n ：t r a n s s t i l b e n e - ( 4 ，4 - d i i s o t h i o c y a n a t e ) 一2 ，2 - d i s u l l p h o n i c a c i d 二、细胞酶电极 由于商业化的酶电极都是采用纯酶进行研制，纯酶的提取工艺复杂，价格昂 贵，在应用上受到了一定的限制。利用微生物中的酶作为催化剂由来已久【2 5 1 ， 90上工 山东大学硕i 。学位论文 r e c h n i t z , g a 2 6 1 等把完整的细胞固定到电极上利用细胞中的酶对底物进行牛物 催化从而实现对底物的测量；k a t s u m it a k a y a m a ，t o s h i y a s uk u m s a l i 。t o k u j ii k e d a 。 t o m n a g a s a w a 2 7 1 等把假单胞菌微生物细胞t n 5 ( p f ) 悬浮液滴到碳糊电极表l f l i ， 等细胞悬浮液中的溶剂挥发完毕，用透析膜把电极表面覆盖起来，从而制得细胞 酶电极，利用这种方法制成细胞酶电极来对烟酸进行了测量。1 9 9 6 年，k a nk a m 【2 8 1 等把细胞( a c e t o b a c t c ra c e t i ，其细胞质膜上自乙自# 脱氢酶) 怂泞液滴d l l 剑戗糊i u 极表面，细胞悬浮液的溶剂蒸发完毕，用透析膜( 在干燥状态下透析膜的j v 艘 是2 0 1 tm ) 覆盖电极表面，制成细胞酶电极，不用时电极储存在5 c 的盐溶液- i 用此电极测定了乙醇，检测限达到0 8 5m m o l l 。a s h o km u l c h a n d a n i 等 2 9 1 用币组 埃希氏菌属细胞( 含有机磷水解酶) 和p h 电极结合起来制备了微生物f i l lj 旭酶i 乜极 用此电极来测定有机磷杀虫剂。此电极的制作是先把已知细胞数量的细胞恳f 7 液 滴加到聚碳酸酯多孔膜上，然后再把此膜覆盖gu j p h 电极上( 幽4 ) 。y ul e i 【3 0 1 等 用聚四氟乙烯膜把酵母细胞包埋固定在氧电极上测量对硝基苯取代物有机磷神经 试剂。e r o la k y i l m a z 3 1 等用戊二醛交联法把c a n d i d at r o p i c a l i s 细胞凝胶混合物 定到特氟隆膜上来测定乙醇，反应时间只有1 5s 。m a r g a r i t as t o y t c h e v a 3 2 0 把翕 有胆碱氧化酶a r t h r o b a c t e rg l o b i 6 m m 细胞用微生物膜和纤维素膜包埋固定到平头 氧电极上间接测定胆碱酯酶的活性。在细胞酶电极的应用方面，发展也非常迅速。 r a c c kj 3 3 等把需氧酵母h a n s e n u l aa n o m a l a 绍t 胞固定到电极e 利j n 脯母细胞一1 1 含 有的乳酸脱氢酶测定血液或血浆中的乳酸，通过这种方法制备的细胞f u 极和l | 常 分析中用到的酶电极进行了对比，发现细胞酶电极具有纯酶制备的酶电极所具有 的优点，比如造价低，性能稳定，保存时间长等。e l i s a b e t u c s o r e g i 3 4 等把细| j | 细 胞e s c h e r i c h i ac o l i 固定到电极上测定污染土壤中的重金属h g 6 山东大学项上学位论文 图4 ：微生物细胞传感器示意图 f i g 4 ：s c h e m a t i cd r a w i n go f t h ep o t e n t i o m e t r i cm i c r o b i a lb i o s e n s o r 三、微电解池 3 1 、微反应器 面临着2 l 世纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学也正经历着 深刻的变革，其中一个日益明显的发展趋势是化学分析设备的微型化、集成化与 便携化。当前，主要是为了适应生命科学发展的需要，分析仪器的发展正在出现 了一个以微型化为主要特征的、带有革命性的重要转折点 3 5 1 。 微反应器【3 6 】是指用微加工技术制造的一种新型的微型化的化学反应器，它内 部结构宽度的尺寸在微米级 3 7 3 9 ，其研究是从2 0 世纪7 0 年代丌始，发展非常缓 慢【4 0 】。四十年i j 微电子技术在信息科学的发展，引发了一场革命，并对微反应器 的发展起了很大的作用。最近几年来，随着m e m s ( 微电子机械系统) 技术的发 展，微型反应器的研究有了实质性的进展。最近的研究表明，自从1 9 9 3 年r i c h a r 一知j m a t h i e s 首先在微加工技术制造的生物芯片上分离测定了d n a 片段后【4 1 】，生物芯 片技术与计算机相结合，促成了基因排序这一伟大的科学成就：而化学分析方面， 差不多同时发展了在组合化学，催化剂筛选和手提分析设备等方面有着诱人应用 i j 景的的微全分析系统( p t a s ) 4 2 1 。把微加工技术应用于化学反应的研究始于 1 9 9 6 年自口后，l e r o u s 4 3 和e h r f e l d 等 4 4 1 各自撰文系统阐述了微反应器在化学领域 的应用原理及其独特的优势。微反应器按其功能和用途可分为氧化微型反应器、 加成微型反应器、取代微型反应器等；按反应物形态可分为气柏微型反应器、气 液微型反应器和液帽微型反应器；按是否有固相反应存在，可分为均相反应器【4 5 】 ( 均相反应器主要用于多种反应物均相混合后进行化学反应) 和非均相反应器( 最 常用的非均相反应器是固相催化反应器，此类反应是将催化剂固定在微反应通道 中，反应物溶液在固相催化剂下催化完成化学反应) 。微反应器的小尺寸具有两大 优点：一是试剂的消耗大大减小，仅为纳升级至微升级。这一特点对于样品量少、 试剂昂贵的生命科学领域样品的分析具有重要的意义。二是微反应器中反应速度 快，而且具有很好的安全性。由于微反应器腔体体积小，比表面积大，扩散距离 短，流阻小，传热、传质速度快，短时间内即可充分混合。并达到反应平衡【4 5 】 制备微反应器所使用的材料比较广泛，如金属、聚合物( 其包括硬质高分子聚合 物如聚碳酸酯等、弹性聚合物如聚二甲基硅氧烷p d m s 和光敏聚合物如s u - 8 ) 、陶 山东人学母l 十学位论文 瓷、玻璃和硅等。会属设备适用于快速放热多相催化反应；玻璃和n 制作的微反 应器适用于多种化学反应，如药物快速筛选和多相催化反应；聚合物等凶具1 干一i i 多，价廉，加工又相对容易，又有很好的透明性和介电性通门j 反应濉承j 、小； j 发生剧烈反应的反应。制作微反应器的微自n 工技术种类繁多，阒微反心器的种类 和材料而异。玻璃和硅般用刻蚀方法进行刎蚀，土要濉法化学刻蚀【4 6 f 法刎 蚀( 等离子体刻蚀、深度反应离子刻蚀) ；聚合物芯片主要用光刻法、此外还f l f 助 电铸、激光烧蚀加电铸、l i g a 加工( 光亥0 、电铸和塑模结合的工艺) 【4 7 4 9 】、机械 微加工、微e d m ( e l e c t r o d i s c h a r g em a c h i n e ) 等。 3 2 、微电解池 微型电解池属于液相微反应器，是液相微反应器与电化学检测的结合。微j 叫 电解池作为微反应器的一个领域，它具有易于实现批量生产，只需要少氍的样 大大降低有毒试剂的消耗，减少环境污染，分析成本低，响应时i h j 快，枪测现象 低和适用于现场快速检测等优点近年来，用于微型电解池中的微电极技术的发 展也很快，是当前电化学和电分析化学领域中活跃的研究方向之- - 5 0 5 8 1 。微电 极与常规电极相比具有很小的时间常数，小的j r 降，大的电流 季f 度，快速的f i 述 速率且具有较大的法拉第电流与充电电流比等特点。微电极周旧的扩散层j ，瞍撤 小，使法拉第电流与对电流分丌，具有较高的稳念传质扩散速度，在溶出分析或 伏安分析中，可以避免流动因素带来的误差【5 9 】。放入微型电解池内的微电极 要 有两种形式。一种是与电解池为一体的微带电极 6 0 7 0 。放入微型电解池内的微 电极主要有两种形式：一种是与电极池为一体的微电极 6 0 】( 图5 所示) ；，3 种址 可以随意移动的微电极【5 1 5 3 ，7 1 1 ，可以是两电极体系【5 1 , 5 2 1 ( 例6 所示) ，也i 叮以 是三电极体系 6 0 】。 微型电解池的体积很小，要考虑溶液的蒸发问题，解决蒸发主要有两种措施： 一是在溶液上方加入矿物油和甘油等表面活性剂 6 0 ，6 2 ，6 4 ；二是在微型 【l 斛池j 二 加盖 5 2 ，5 3 ，5 5 1 ，这两种措施都能在定时间内有效防止蒸发。还有就是刖电微作 为小池底部在小池中加大量样品，这样即使有蒸发也不影响其测量结果 6 9 1 。 8 5m m 山东大学硕士学位论文 图5 ：微池电极示意图 f i g 5 ：v i a le l e c t r o d e 图6 ：二电极体系微电解池进行单细胞分析示意图 1 粗铜丝2 银丝3 0 管4 环氧树脂胶5 微米a u 圆盘工作电极6 - a g a g c i 参比 电极7 石蜡8 微孔阵列9 盖子l o 一佩替式表面皿保湿盒l l 孑l1 2 支架1 3 水 f i g 6 s c h e m a t i cd i a g r a mo f s e t u pw i t hm i c r o a r r a ya n dd u a le l e c t r o d e i nac o n s t a n t - h u m i d i t yc h a m b e rf o rs i n g l e c e l la n a l y s i s 1 c o p p e rl e a d2 a gw i r e3 d u a le l e c t r o d e4 e p o x yr e s i n5 m i c r o m e t e r - s i z e da ud i s k w o r k i n ge l e c t r o d e5 n a n o m e t r - s i z e da ud i s kw o r k i n ge l e c t r o d e 6 a g a g c ! r e f e r e n c ee l e c t r o d e7 w a x8 m i c r o e e l la r r a y9 c o v e r10 p e t r id i s ha sa c o n s t a n t - h u m i d i t yc h a m b e r1 1 h o l e1 2 s t a n d1 3 w a t e r 四、微型电解池、游离酶用于细胞的研究 近年来，越来越多的人在微型电解池内进行电化学检测进行研究，人们利用 照相平板印刷法和湿法化学刻蚀等技术制作出了各种各样的微电解 7 4 ，7 7 1 。 n e u g e b a u e r 7 6 等在p l 级的微电解池内对 r u ( n h 3 ) 6 c h 进行分析，并且不需要防 止蒸发的措簏。也有人用微型电解池和游离酶结合起来对单个细胞进行分析 【5 5 ，6 3 ，7 1 7 3 。g e z a 等 6 3 1 通过光刻和电化学技术制作了一个微型电解池，酶催 化反应在池内的一个薄膜上进行，通过电流法检测两种不同模式肌氨酸激酶的活 性。b r a t t e n 等【7 2 】用刻蚀法制作了一个深2 0um ，直径2 0 0p m 的微型电解池，用 这套装置通过三种酶( 腺苷脱氨酶，核苷磷酸酶和嘌呤氧化酶) 安培检测了细胞 山东大学硕上学位论文 的释放物一嘌呤。c a i 等【7 3 】用平板光刻技术制作了体积为3 6 0p l 的微型电解池， 电解池内含有两个微电极( 如图7 所示) ，通过乳酸氧化酶实时检测了细胞释放的 乳酸盐。金文睿等 7 7 f f 2 0 1 0 0n l 的微池，通过微电极检测了单细胞中的过氧 化物酶。 图7 两电极体系微电解池( 一体化) 电子显微镜示意图 ( 左：工作电极右：参比电极) f i g 7s e mo ft h et w o m i e r o e l e e t r o d e ( 1 e f l , w o r k i n ge l e c t r o d e ；r i g h t ，r e f e r e n c ee l e c t r o d e ) 、i t l ls u 一8m i c r o e h a m b e r05 01 tm d i a m e t e o 五、结束语 微型电解池不仅应用在细胞分析方面，在d n a 分析、蛋白质结晶、酶检测、 免疫分析以及生物分子检测等方面都有着广泛的应用。细胞酶电极主要是一些常 规电极，主要是用来测量了一些非细胞物质，把微型电解池和细胞酶电极结合起 来将是一个未来发展的方向。 参考文献 【1 】u p d i k e ，s j ，h i c k s ，gp t h ec n z y m ee l e c m x l e p l n a t u r e ，1 9 6 7 ，2 1 4 ：9 8 6 - 9 8 8 【2 】焦奎，罗细亮，孙伟辣根过氧化物酶修饰电极的研究进展i j l 青岛化l + 学院学 报，2 0 0 1 ，2 2 ( 1 ) ：l 一7 【3 】李彤，姚子华电流型酶传感器的研究进展9 1 河北大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 4 ， 2 4 ( 2 ) ：1 9 6 - 2 0 2 【4 】m o r o l a ha e n z y m e sa sa n a l y t i c a lr e a g e n t s ：s u b s t r a t ed e t e r m i n a t i o nw i t hs o l u b l ea n dw i t h i m m o b i l i z e de n z y m ep r e p a r a t i o n s i z i a n a l y s t , 1 9 8 7 ，11 2 ：7 1 9 - 7 2 7 1 0 坐查查兰堡主堂丝丝塞 【5 】5m i c h a e l gg a r g u l l o a m i c h a e l c q u a n t i t a t i o no fc h o l i n ei ne x t r a c e l l u l a rf l u i do fb r a i n t i s s u ew i t ha m p e r o m e t r i cm i c r o s e n s o r s j i a n a l c h e m ，1 9 9 4 ，6 6 ( 1 7 ) ：2 6 2 1