（市政工程专业论文）MBR中EPS、SMP和生物多样性的研究.pdf

y l i i i l l l l l l l l l , 1 5 l l l l ! q 3 i h 1 l h 1 l l o l i l l l o l l l l l ly 1 5 3 11 0 0 天津大学硕士学位论文 m b r 中e p s 、s m p 和生物多样性的研究 r e s e a r c ho ne p s 、s m pa n d b i o d i v e r s i t yi n m e m b r a n e b i o l o g i c a lr e a c t o r 学科专业：市政工程 研究生：黄兴 指导教师：孙宝盛副教授 天津大学环境科学与工程学院 二零零八年五月 摘要 在膜生物反应器( m b r ) 中，污泥混合特性作为影响膜生物反应器膜污染的 重要因素，很大程度上决定了最终的出水水质和膜分离性能。而胞外聚合物 ( e p s ) 、溶解性微生物产物( s m p ) 和生物多样性是三个表征污泥混合液特性的重 要因素。 本课题综合e p s 、s m p 和生物多样性三方面对m b r 中的污泥混合液特性进行 研究。研究的主要内容分为两个部分： 一是对天津医科大学总医院的m b r 污泥混合液进行研究。在m b r 整个运行 过程中，s m p 没有出现大量累积；在污泥初期增长期和恢复成熟期，e p s 的含量 也比较稳定。但在污泥流失阶段，s m p 和e p s 都突然上升，变化剧烈，是微生物 抵抗外界环境变化的缓冲物质。通过聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳 ( p c r d g g e ) 图谱的直观分析，以及对总细菌的s h a n n o n 多样性指数、各污泥样 品的相似性分析和聚类分析，可以看到污泥中总细菌的种群结构变化能够比较好 的反应m b r 的运行状况，并且观察到总细菌的种群结构能够根据反应器的运行 进行自身的调整。 二是对天津大学游泳馆m b r 中水池中的污泥混合液进行贫营养实验。在贫 营养实验中，不仅观察到了e p s 和s m p 对外界环境变化的的缓冲作用，结合 p c r d g g e 技术及多样性分析，还看到微生物在营养缺乏的条件下以降解e p s 和 s m p 来维持自身生命活动的现象。克隆测序的结果表明，实验中的优势菌种大部 分为未经培养菌种。部分菌种可能与e p s 和s m p 的降解及相互转化有很大关系。 关键词：膜生物反应器胞外聚合物溶解性微生物产物生物多样性聚合酶 链式反应变性梯度凝胶电泳克隆测序 a b s t r a c t s l u d g ec h a r a c t e r i s t i c s ，w h i c ha r et h er e m a r k a b l ef a c t o r sa f f e c t i n gt h em e m b r a n e f o u l i n gi nm e m b r a n eb i o l o g i c a lr e a c t o r ( m b r ) ，d e t e r m i n et h ee f f l u e n tq u a l i t ya n d s e p a r a t i o np r o p e r t i e so ft h em e m b r a n et o al a r g ee x t e n t e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i c s u b s t a n c e s ( e p s ) 、s o l u b l em i c r o b i a lp r o d u c t ( s m p ) a n db i o d i v e r s i t y a r et h r e e i m p o r t a n ti n d e x e so f t h es l u d g ec h a r a c t e r i s t i c s t h i sr e s e a r c hs y n t h e s i z et h et h r e ea s p e c t so fe p s 、s m pa n db i o d i v e r s i t yt os t u d y t h es l u d g ec h a r a c t e r i s t i c si nm b r t h em a i nc o n t e n ti sd i v i d e di n t ot w op a r t s ： t h ef i r s tp a r ti st o s t u d yt h es l u d g ec h a r a c t e r i s t i c s i nt h em b ro ft i a n j i n h o s p i t a lu n i v e r s i t y t h e r ei sn o te x c e s s i v es m pa c c u m u l a t i o ni nt h ew h o l eo p e r a t i o n p r o c e s s ，a n dt h ec o n t e n to ft h ee p si ss t e a d yi nt h es l u d g ei n i t i a lg r o w i n gs t a g ea n d r e c o v e r y t o - m a t u r es t a g e b u ti nt h es l u d g ew a s h - o u ts t a g e ，a ns h a r pi n c r e a s i n ga n d v i o l e n tv a r i a t i o n si ne p sa n ds m pa p p e a r s ，w h i c hi n d i c a t et h a te p sa n ds m pa r et h e c u s h i o n i n gs u b s t a n c e sf o rt h em i c r o b i a lt od e f e n dt h ea t t a c kf r o ma d v e r s ee x t e r n a l e n v i r o n m e n t t h r o u g ht h ep c r - d g g ep r o f i l e 、s h a n n o ni n d e x 、t h es i m i l a r i t yo f c o m m u n i t i e sa n dt h ec l u s t e ra n a l y s i s ，w ef i n dt h a tt h em i c r o b i a ls t r u c t u r ec a n p r e f e r a b l yr e f l e c tt h eo p e r a t i o no ft h em b r ，a n dt h em i c r o b i a ls t r u c t u r ec a na d j u s t i t s e l fa c c o r d i n gt ot h eo p e r a t i o no ft h em b r t h es e c o n dp a r ti st oc a r r yat r i a lu n d e rt h eo l i g o t r o p h i ce n v i r o n m e n tu s i n gt h e s l u d g ef r o mt h em b ro ft i a n j i nu n i v e r s i t y w eo b s e r v en o to n l yt h eb u f f e ra c t i o no f t h ee p sa n ds m p , b u ta l s ot h eu t i l i z a t i o no ft h ee p sa n ds m pw h e nt h em i c r o b i a l l a c ko fn u t r i t i o nc o m b i n i n gp c r d g g et e c h n o l o g ya n db i o d i v e r s i t ya n a l y s i s t h e c l o n ea n ds e q u e n c er e s u l t sr e f l e c tt h a tm o s to ft h ed o m i n a n ts p e c i e sa r eu n c u l t u r e d b a c t e r i u m s o m eo ft h eb a c t e r i u mp r o p e r l yh a ss o m e t h i n gt od ow i t ht h ed e g r a d a t i o n a n dm u t u a lc o n v e r s i o no f t h ee p sa n ds mp k e yw o r d s ：m e m b r a n e b i o l o g i c a lr e a c t o r , e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e s ， s o l u b l em i c r o b i a lp r o d u c t ，b i o d i v e r s i t y , p c r d g g e ，c l o n ea n ds e q u e n c e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得基鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名遵哭 篷字日荛| j ：凇年月专j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 靴敝储鹳：磬 签字日期：如分年月弓f 同 导师签名： 签字r 期旷厂月3 1 日 第一章绪论 1 1 课题研究的背景及意义 第一章绪论 在膜生物反应器中，污泥混合特性作为影响膜生物反应器膜污染的重要因 素，很大程度上决定了最终的出水水质和膜分离性能。而胞外聚合物( e p s ) 、溶 解性微生物产物( s m p ) 和生物多样性是三个表征污泥混合液特性的重要因素。 胞外聚合物( e p s ) 主要来源于细胞内分泌、细胞自溶和从废水中吸附得来， 溶解性微生物产物( s m p ) 是生物处理出水中溶解性t o c 或c o d 的主要组成部 分，主要产生于微生物的基质分解过程和内源呼吸过程，两者均是膜污染的优势 污染物。根据统一理论的观点，溶解性的e p s 实际上就是s m p ，并且e p s 和s m p 之间存在一个相互转化的关系。 微生物生态系统结构因废水性质、工艺参数及环境条件等多种因素的影响而 发生变化，并随之引起水处理效果和膜通量的变化。聚合酶链式反应变性梯 度凝胶电泳( p c r d g g e ) 技术直接利用d n a 及r n a 的微生物遗传特性进行表 征，不但避免了传统上耗时的菌种分离，更可进而鉴定出无法利用传统方法分离 出来的菌种，并且可以对一些条带进行测序对比出其种群。这一技术所分析出的 微生物群落多样性使我们能够快速、准确地鉴定各种环境中的微生物个体，并进 行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态性、重要基因定位及表达的评 价分析。 本课题对胞外聚合物( e p s ) 、溶解性微生物产物( s m p ) 和生物多样性三个表 征污泥混合液特性的因素进行联合研究，来探索m b r 的污泥混合液中三者之间 的变化关系，以期对m b r 运行过程中延缓和降低膜污染提供理论依据。 1 2e p s 和s m p 的研究进展 1 2 ae p s 的研究进展 1 2 1 1e p s 的含义和分类 e p s 是微生物细胞外所有高分子物质的总称，是由具有相似或相同结构的化 第一章绪论 合物通过聚合而成的有机高分子物质，分子量通常在1 0 0 0 0 以上，其含水率达9 0 以上。它是微生物在特定环境条件下产生的高分子化合物【l 】，有两种存在形式： 附着于细胞壁上称为胞囊多聚物；以胶体状态存在于液相主体中称为粘质多聚 物。e p s 的来源可能有两种：污泥代谢环境基质，环境中所含物质种类对e p s 产 生的数量和组成有一定影响；细胞本身的新陈代谢和自溶【2 1 。 胞外聚合物( e p s ) 是微生物细胞分泌的粘性物质，是生物膜的主要组成成 分。许多微生物在细胞壁外围有荚膜和粘液层，在形态上可将其分为三类：大荚 膜、微荚膜和粘液层。荚膜和粘液层的产生，与微生物的菌系和营养环境有关。 对环境微生物而言，污泥颗粒单个细胞中，在细胞表面4 0 9 m l 勾约有5 0 的e p s ， 但在菌胶团中，e p s 主要集中在菌胶团中间，即为细胞的相互连接【3 】。 部分研究者【撕】将e p s 分成两类：b o u n de p s ，主要是细胞外壳、蒴状聚合体、 浓缩凝胶、松散的束缚性聚合物及附着有机物；s o l u b l ee p s ，主要是可溶解的大 分子物质、胶体和粘液。 蒴状物呈浓缩状，并且紧密地粘附在细胞上，粘液是比较松散地附着在生物 聚体上，但并非呈溶解态，而胶体一点都与细胞联接不上 6 1 。e p s 的物理状态与 系统的参数有关，诸如环境的p h 和阳离子等1 4 , 5 1 。 1 212e p s 的成分 胞外聚合物是一种天然高分子化合物，它的组成受外界很多因素的影响，如 细胞生长过程的分泌物、细胞表面的脱落物、细胞裂解以及从外界环境中吸附的 物质等【7 j 。e p s 是由各种有机物质组成，早期的e p s 研究主要关注于多糖物质的 分析，因为多糖是纯培养基细胞e p s 的主要成分。然而最近的研究发现蛋白质才 是类似活性污泥的混合培养基细胞e p s 的主要组分。p a v o n i i 驯等通过试验发现， e p s 中各大分子物质所占比例随基质不同而有所差异。以葡萄糖为单一基质时， e p s 中的多糖最多，占3 9 ；以营养肉汁为单一基质时，e p s 中的蛋白质最多， 占3 6 8 ，多糖其次，占2 7 6 。此外，e p s 的组分还包括腐殖酸类物质、糖醛 酸和脱氧核糖核酸( d n a ) ，只是这些组分的量相对较少。l i ua n df a n g 9 j 等人对 7 5 种不同类废水活性污泥的e p s 组成进行了比较发现，来自处理生活污水的活性 污泥中提取的e p s 多于工业污水和合成废水。而且e p s 的量取决于提取过程和分 析方法。 1 2 1 3e p s 的生物可降解性 z h a n g 并 f l b i o s h o p i i o j 生物膜上提取e p s ，并将提取后所剩余的微生物体加入到 缺乏碳源的无机盐溶液中，使之悬浮并在室温下进行曝气。当微生物处于完全饥 饿状态时，将所提取的e p s 液体加入到此悬浮液中，研究这些e p s 是否可以作为 第一章绪论 底物被分泌自身的来源微生物利用。并进行了对比试验，研究这些e p s 是否也可 以作为底物被其它微生物所降解。试验采用同一污水处理厂的曝气池内的活性污 泥作为不同类型微生物，e p s 仍然提取于生物膜中。试验结果表明，e p s 不仅可 以被分泌自身的来源微生物所降解，还可以作为底物被其它微生物所利用。在 e p s 的降解过程中，出现了四个明显的阶段。第一阶段，e p s 的加入，造成系统 中多糖和蛋白质浓度的瞬时增加；第二阶段，加入的e p s 中易被生物降解的部分 快速地被利用；第三阶段，微生物利用剩余的极少量的易被降解的e p s 产出新的 s o l u b l ee p s ；第四阶段，细胞利用新产出的e p s 代谢，最后微生物逐渐停止呼吸。 e p s 中多糖的利用速率比蛋白质的降解速率快，活性污泥混合液中e p s 的利用速 率大于生物膜悬浮液中e p s 的利用速率。 1 2 2s m p 的研究进展 1 2 2 1s m p 的定义及分类 溶解性微生物产物( s o l u b l em i c r o b i a lp r o d u c t s ，s m p ) 是微生物在降解环境中 可利用基质、进行内源呼吸或者应对环境压力的过程中产生的溶解性有机物，其 能够在不破坏菌体细胞的情况下与微生物相分离，且离开该物质微生物细胞仍能 存活 1 1 , 1 2 1 。 s m p 根据其产生的途径可以分为两种类型t 与基质降解相关联的微生物产物 ( u a p ) 和与微生物内源呼吸相关联的微生物产物( b a p ) 1 3 1 。u a p 是微生物在分 解基质产生能量，进行自身生长繁殖时释放出的产物，与基质降解、微生物代谢 或细胞生长相关，它的生成速率与基质的分解速度成正比。这类微生物产物大部 分可以被生物降解，但是降解速度较慢，需要与微生物接触足够长的时间后才能 继续被细胞同化或者降解。 b a p 是微生物在内源呼吸过程中或者受到外界环境刺激的情况下( 例如环境 温度突变，毒性物质的刺激等) ，伴随细胞解体释放出来的，与微生物的增殖无 关，只与细胞内源呼吸如细胞裂解、细胞衰亡相关，生成速率与生物量水平成正 比。与u a p 相比，b a p 的可生化性较差【1 4 , 1 5 1 ，其最大生物降解速率为u a p 的几十 分之一。另外，微生物为了维持细胞内外浓度的平衡也会释放出一些溶解性有机 物质( 例如胞外酶等) ，但是这种物质的浓度相对较低。 1 2 2 2s m p 产生途径 在生物处理废水的过程中，s m p 的产生主要有以下几种途径 ： 生长过程：微生物在正常生长和代谢情况下产生s m p ； 维持浓度平衡：微生物为达到细胞膜内外的浓度平衡而释放s m p ； 第一章绪论 饥饿的刺激：微生物在饥饿状态时因为碳源不足，为维持生存必须通过 内源呼吸或代谢细胞内的物质以获得能量，从而释放大量的s m p ； 环境中基质的匮乏：如果微生物所需的营养处于非常低的浓度，微生物 会产生s m p 以获取这些营养来维持自身活性； 冲击负荷：给处于饥饿状态的细菌突然添加碳源和能源物质可加速细菌 的死亡，产生s m p ； 底物的刺激：高浓度外在能源物质的存在能够刺激s m p 的释放； 缓解环境压力：微生物在面临环境压力( 如温度变化、渗透压的冲击和毒 性物质的加入) 时，会产生s m p 以解除环境压力。 以上途径中，微生物的生长、饥饿的刺激和内源代谢是影响s m p 产生的重要 因素。 1 2 2 3s m p 的成分 自2 0 世纪六七十年代以来，研究者发现s m p 成分极其复杂，包含了大量化合 物，例如腐殖酸、灰黄霉酸、多聚糖、蛋白质、核酸、有机酸、氨基酸、抗生素、 胞外酶、铁质运载体、细胞的组织成分和能量代谢产物。其中腐殖酸、多聚糖、 蛋白质三种成分是在各种情况下均普遍存在的主要成分。m e n a h e m 和j o s e p h a 1 6 】 发现活性污泥反应器的出水的s m p 中，腐殖质的比例占到4 0 5 0 ，蛋白质和多 聚糖的比例分别为2 2 4 和11 5 。而在b u n c h 1 7 j 的研究中发现，活性污泥和生物 滤池中的出水的s m p 中，各成分的比例是不同的。活性污泥系统中蛋白质和多聚 糖的比例分别为2 3 2 3 2 8 和7 5 3 1 2 ，而生物滤池中分别为2 2 3 0 5 和 4 - 1 6 3 。大量研究结果都认为进水不同，出水也不相同，但可能不同出水中都 含有普遍物质( i i js m p ) ，并且组成类似。 1 2 2 4s m p 的可降解性 目前研究者普遍认为s m p 的可降解性较差，但是微生物经过驯化后是可以将 其降解的。g a u d y 乘i b l a c h l y 1 8 】的试验中发现9 0 在批次和连续反应中认为不能被 降解的s m p ，在二级处理中能被降解。他们在半连续反应器中每天加入葡萄糖， 使反应器中葡萄糖终浓度达到10 0 0 0 m g l 。s m p 的浓度在第3 2 天达到15 7 0 m g l ， 而在第6 6 天时降i k 鼯1 1 3 2 4m g l 。因此，可以认为微生物经过长期的驯化后，是可 以降解一部分s m p 的。b a k e r i1 9 】等研究了在好氧及厌氧条件下的降解特性，发现 在高分子量的在厌氧条件下降解较好，而低分子量的在好氧条件下降解更完全。 国内方面，黄霞【2 0 】等人在用自配水运行m b r 的过程中考察了上清液中s m p 浓度 的变化，在运行的前8 0 1 5 0 天内，反应器中其浓度逐渐上升，但是在1 5 0 2 5 0 天 内，其浓度呈现了逐渐降低的趋势。 第一章绪论 对于不同类型的s m p ，其可降解性也有所不同。与b a p 相比，u a p 的可降解 性较好。但r i t t m a n n 1 3 1 曾指出，即使微生物的驯化得已经适应降解溶解性微生物 产物，但其降解速率还是要低于原始进水基质的降解速率。 1 2 3e p s 和s m p 关系 1 2 3 1e p s 和s m p 的相同和不同之处 e p s 和s m p 都是在能量代谢和微生物合成过程中产生的包含电子和碳的有 机物质1 2 】，即都是微生物次生级代谢的产物；并且主要组成成分相同：多糖、蛋 白质、核酸和腐殖质；性质方面都具有一定的生物可降解性；对重金属有一定的 螯合、吸附作用；组成、含量均受到工艺运行参数的影响；并会影响活性污泥的 动力学活性和絮凝、沉淀特性及工艺的处理效果。 虽然e p s 和s m p 都产生于能量代谢和微生物合成过程中，但两者之间的关键 不同是：s m p 完全是可溶解的，而e p s 大部分都是与固体相关联，虽然并不全是 1 0 0 的关联，但是e p s 大部分是不可溶解的1 1 2 。 1 2 3 2 统一理论提出的基础 ( 1 ) s o l u b l ee p s 与b o u n de p s n i e l s e n 等【4 就生物膜中e p s 的产生建立了概念上的模型。认为微生物的产物 分为：新合成的微生物细胞、b o u n de p s 和s o l u b l ee p s 。b o u n de p s 和s o l u b l ee p s 包括细菌产生的聚体、衰减产物和水解产物。所有这些物质呈束缚态，或者溶解 态。并认为s m p 包含在s o l u b l ee p s 之中。即： b o u n de p s 被细菌水解酶溶解或水解后，生产的水解产物称之为s o l u b l e e p s ； s o l u b l ee p s 也包含所附着有机物的水解产物和细胞衰减所释放的有机物 质： 部分s o l u b l ee p s 可以被细胞循环利用，类似于s m p 的生物降解过程。 而h s i e h 等1 5 】认为s o l u b l ee p s 是附着在细胞上的e p s 通过溶解、水解或者是细 胞表面的剪切力作用而释放出来的物质，它可以被活性微生物所利用。h s i e h 等 的主要观点是： b o u n de p s 包含与生长有关的产物及与微生物有关的产物，这一点与 n i e l s e n 等【4 】的观点不同； s o l u b l ee p s 只是b o u n de p s 的溶解产物； 只有s o l u b l ee p s 是具有生物可降解性。 ( 2 ) 胞外聚合物与惰性微生物 第一章绪论 s m p 学派可能认为部分b o u n de p s 是惰性微生物。在内源衰减过程中，部分 衰减微生物没有被氧化，而是积聚成惰性微生物。n i e l s e n 和j a h n 6 】同样提出，除 了微生物自身分泌的高分子量的黏性物质外，e p s 还包含细胞水解产物和衰减微 生物，而衰减微生物正是惰性微生物的组成，因此至少部分惰性微生物是b o u n d e p s 的组成。除了e p s 多 b ，惰性微生物还包含其它固体物质，如：死细胞的残渣、 捕获的悬浮固体和无机沉淀物。如果b o u n de p s 是由基质利用和微生物合成过程 直接产生的，那么部分b o u n de p s 很可能是活性微生物的组成。 ( 3 ) 统一理论提出的假设条件 之所以会出现s m p 学派忽略e p s ，e p s 学派忽略s m p 的现象，根本原因是两 个学派研究的方向不同。s m p 学派的研究方向是出水质量和污泥产量，e p s 学派 主要是研究生物膜或者絮体的性质。针对这种矛盾，l a s p i d o u a - 等1 1 2 】在事实的基础 上，提出了以下六点假设，分别是： 在颗粒有机基质水解不重要的条件下，s m p 和s o l u b l ee p s 是同一种物质； b o u n de p s 可以水解生产b a p ； s o l u b l ee p s 中与生长有关的那部分物质与u a p 相同； s o l u b l ee p s 可以聚合形成b o u n de p s ； b o u n de p s 的产生与生长有关，并且产生速率与基质利用速率成正比： b o u n de p s 的一部分属于新合成的活性微生物，另一部分属于惰性微生 物。 1 2 3 3 统一理论的内容 l a s p i d o u 等1 1 2 】在假设的基础上，进一步提出了统一理论，使得两个学派的观 点达成一致。统一理论揭示了活性微生物、e p s 、u a p 、b a p 及惰性微生物之间 的相互关系，并且反映了六点假设中的所有机理： s o l u b l ee p s 和s m p 是相同的； b o u n de p s 可以水解生成b a p ； u a p 直接由基质利用过程生成，并且生成速率与基质利用速率成比例； b o u n de p s 直接在基质利用过程中产生，其产生速率与基质利用速率成比 例： 活性微生物由b o u n de p s 和活性细胞组成，但部分e p s 属于惰性微生物范 畴： 死亡的细胞残渣由微生物内源衰减过程产生，是惰性微生物的组成之一； u a p 和b a p 具有一定的可生物降解性，可被细胞当作电子供体循环利用。 第一章绪论 1 3 分子生物学研究进展 1 3 1 分子生物学技术在环境微生物生物多样性中的应用 生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是指生物中的多样化和变异性以及物种生境的生 态复杂性，它包括植物、动物和微生物的所有种及其组成的群落和生态系统。生 物多样性可以分为遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性3 个层次。遗传多 样性指地球上生物个体中所包含的遗传信息之总和；物种多样性指地球上生物有 机体的多样化；生态系统多样性涉及的是生物圈中生物群落、生境与生态过程的 多样化。 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物：细菌、放线菌、原生动物、 真菌、部分藻类和病毒，是生物多样性的重要组成部分。通过其代谢多样性和遗 传适应性，微生物在许多小生境包括其他生命类型不适宜的极端环境中得以生存 并发挥作用【2 l 】。微生物作为生态系统中极重要的一员，对动植物的生长【2 2 1 、生 态系统中的能流和物质循环【2 3 j 及环境污染物的降解和解毒【2 4 等方面起着重要作 用。 微生物物种的多样性是微生物多样性最基本的内容。微生物是地球上仅次于 昆虫的第二大类群的生物，但微生物已知种占估计种的比例很小，细菌、真菌及 病毒的已知种占估计种的比例分别仅为5 、1 0 和4 ，微生物物种多样性的研 究要落后于其他大生物类群1 25 | 。此外，微生物多样性与其他生物类群相比有许多 独特之处，包括：生存环境多样；生长、繁殖速度多样；营养、代谢 类型多样；生活方式多样。因而，微生物多样性的研究无论对于生态系统功 能的完整理解，还是对于微生物资源的利用和开发都具有特殊重要的意义。 传统的环境工程微生物的分析测定方法有：显微镜微生物形态观察、选择性 培养计数、纯种分离和生理生化鉴定等。但是由于环境微生物的可培养性差，传 统的培养技术能分离培养的微生物只占环境微生物总数的0 1 1 0 ，因此，传 统的培养技术不适用于微生物群体组成和结构的分析【26 i 。而利用分子生态学理论 和技术，研究各种不同生态系统微生物物种种群组成、结构及其演替规律，揭示 自然界环境中( 尤其是极端环境) 微生物多样性的真实水平及物种组成，既可以避 免传统微生物学方法在研究微生物群落结构方面的局限性，又能够从本质上对自 然界微生物多样性、适应生存及其与环境之间的关系有系统和全面的认识1 27 。2 9 j 。 迄今，在国外，基于d n a r n a 的现代分子生物技术废水处理、生物修复等 环境污染治理领域已有广泛的研究应用 3 0 - 3 2 】。就目前所开展的研究来看，用于微 生物群落结构的分析技术主要有： 第一章绪论 克隆文库分析法( c l o n el i b r a r yp r o f i l i n g ) ，通过构建群落样品总基因组 d n a 的文库，分析文库中标记序列的类型和出现频率，可以得到微生物群落种 群组成的分析数据。如果是用16 sr r n a 基因作标记，可以通过与g e n b a n k 和r d p 数据库中己有的序列数据的比对，鉴定出各种序列类型的分类地位，许多序列可 以鉴定到种的水平。 分子杂交技术( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) ，用己知的标记序列作为探针， 可以检测微生物群落样品中特定的微生物种类存在状况及其种群水平的高低。可 以直接对样品进行分析的荧光原位杂交( f i s h ) 、原位p c r ( i s p c r ) 、基因芯片 ( m i c r oa r r a y s ) 等受到研究者的青睐。 基于p c r 扩增的遗传指纹技术( g e n e t i cf i n g e rp r i n t i n g ) ，用于群落结构分 析的指纹图技术中，最常用的是用1 6 s 1 8 sr r n a 基因序列可变区的扩增以及 d g g e t g g e 电泳分析技术，目前已经被广泛用于分析微生物的区系结构组成与 动态变化。此外，随机扩增技术( r a p d ) 、扩增r d n a 限制性分析( a r d r a ) 、限 值性片段长度多态性分析( r f l p t r f l p ) 、单链构象多态性分析( s s c p ) 等也被 用于监测微生物群落结构的动态变化或者比较不同微生物群落样品的结构差异。 1 3 2p c r d g g e 技术 1 3 2 1p c r d g g e 技术流程 图1 1p c r - d g g e 技术流程图 第一章绪论 p c r d g g e 主要技术路线如图1 1 所示，样品经过预处理之后，直接提取样 品中的总基因组d n a ：针对1 6 sr d n a 可变区进行p c r 扩增，使目标片段的数量 增加到可进行后续分析的水平；扩增后的p c r 产物是各种细菌1 6 sr d n a 可变区 片段的混合物，通过变形梯度凝胶电泳，扩增出的各种片段在凝胶上分离开来。 为得到更详尽的信息，对d g g e 图谱上感兴趣的条带可进行切胶回收，回收的片 段再经过一次扩增，数量可达到序列测定所需的水平。片段序列测定后，进入 n c b i 序列基因库进行对比，初步确定主要优势菌种的种属，并进行样品菌落结 构分析。 1 3 2 2p c r 反应 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是一项在短时间内大量扩 增特定d n a 片段的分子生物学技术。p c r 是一种选择性体外扩增d n a 或r n a 的方法，它的操作体系中含有双链模板d n a ( 即目的基因) 、热稳定的d n a 聚合 酶和一对引物。引物是根据已知d n a 序列人工合成的，与所要扩增的d n a 两 端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段，即左右端引物。两引物间范围要包括所欲扩 增的d n a 片段。引物长度一般在2 0 3 0 b p 之间。此外，反应体系还应该供给合 成时所需要的原料四种三磷酸脱氧核苷酸( d n t p ) 。 p c r 过程包括三个基本步骤：变性( d e n a t u r e ) ：目的双链d n a 片段在9 4 解链。即在适当的缓冲体系中加入上述物质后，置于特殊的自动温度循环器装 置中，加热至高温( 一般为9 4 ，9 0 秒) ，将所需要扩增的靶d n a 双链热变性处 理，解开为两个寡聚核苷酸单链；退火( a n n c a l ) ：两个寡核苷酸引物在适当 温度( 5 5 左右，3 0 6 0 秒) 下与模板上的目的序列通过氢键配对，经单链杂交复 性；延伸( e x t e n s i o n ) ：t a q d n a 聚合酶在适当温度( 7 2 ) 条件下，催化d n t p 按从5 到3 方向将引物延伸，以单链的目的d n a 为模板，自动合成新的d n a 链， 使d n a 重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。此时，引物在反应中不 仅起引导作用，而且起着特异地限制扩增d n a 片段大小的作用。新合成的d n a 链含有引物的互补序列，又可作为下一轮聚合反应的模板。如此反复地进行上述 “模板d n a 力h 热变性模板d n a 引物的复性”这个在d n a 聚合酶作用下的引 物延伸循环过程，每次循环后延伸的模板又增加一倍，也就是扩增d n a 产物一 倍。经过反复循环，使得靶d n a 得到大量的扩增。从理论上来讲，经2 5 - 3 5 轮 循环就可使d n a 扩增达10 6 倍。 l 32 3d g g e 技术 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 最早是由 f i s h e r 和l e r m a n 3 3 1 发明用于检测d n a 突变的技术，19 8 5 年m y e r s 等对这一方法 第一章绪论 做了改进，即在一条引物的末端加上富含g c 的序列( g c c l a m p ) ，从而改变了其 解链和电泳的性质。保证了链在变性胶内泳动过程中不会完全解链为单链，使该 技术日臻完善。1 9 9 3 年m u y z e r f 3 5 j 首次将该技术用于微生物生态学的研究，并证 实了这种技术在揭示自然界微生物系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的 优越性。在十多年的时间己被广泛应用于环境微生物生态研究各个领域 3 6 - 4 7 】。 ( 1 ) d g g e 基本原理 d g g e 不是基于核酸分子量大小的不同将不同大小的d n a 片段分开，而是根 据序列的不同，将片段大小相同的d n a 序列分开。双链d n a 分子中，a 、t 碱基 之间有2 个氢键，而g 、c 碱基之间有3 个氢键连接，因此，a 、t 碱基对对变性剂 的耐受性要低于g 、c 碱基对。双链d n a 分子由于a 、t 、g 、c 这四种碱基的组 成和排列差异，使不同序列的双链d n a 分子具有不同的解链温度。 当双链d n a 分子在含梯度变性剂( 尿素、甲酰胺) 的聚丙烯酰胺凝胶中进行 电泳时，因其解链的速度和程度与其序列密切相关，所以当某一双链d n a 序列 迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链，部分解链 的d n a 分子的迁移速度减小，使具有不同序列的d n a 片段滞留于凝胶的不同位 置，从而相互分开。理论上，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电 压等足够精细，接近9 5 的单碱基替换可以通过d g g e 的方法实现分离1 3 4 1 。 根据d g g e 变性梯度的方向与电泳方向是否一致，可将其分为两种形式的 d g g e - 垂直d g g e 和平行d g g e 。垂直d g g e 的变性梯度方向与电泳方向垂直， 可用于优化品的分离条件，也可用于分析p c r 产物的组成；平行d g g e 的变性梯 度方向与电泳方向一致，可用于同时分析多个样品。目前应用在环境微生物样品 分析的主要是平行d g g e 。 ( 2 ) d g g e 在微生物生态学中的应用 1 ) 研究微生物类群的多样性 从环境样品中直接提取总d n a ，经p c r 扩增到含有某一高变区的目的d n a 序列产物，通过d g g e 得到图谱。因为每个条带很可能就代表一个微生物物种， 所以d g g e 带谱中条带的数量，即反映出该环境微生物群落中的优势类群的数 量。为了得到更详细的信息，往往采用种或类群专一性探针与得到的条带进行杂 交或将条带切下，重新p c r 扩增后测序，进而得到部分系统发育信息。 2 ) 用于环境微生物变化的动态检测 d g g e 技术的一显著特点就是可以同时对多份样品进行分析，因此适合于监 测环境中微生物在时间和空间上的动态变化。 3 ) 有助于发现新的微生物 目前，自然界中可获得纯培养的微生物仅占0 1 l ，这些微生物只是易于在 第一章绪论 人工的营养条件及培养条件下形成克隆，但不一定是天然的优势菌群，而分子生 物技术又通常只能检测到优势菌的存在，因此自然界中还有很大一部分微生物尚 未被发现。应用d g g e 与富集培养相结合有助于发现这一部分微生物。 4 ) 用于不同d n a 提取方法效果的比较 在分子微生物生态学研究中，从环境样品中提取得到总d n a 是关键的一步。 一般采用直接提取和间接提取两种方法，直接提取法即对样品直接进行处理使其 中的微生物细胞裂解从而释放出d n a ，而间接提取法则是先将样品中的细胞与 环境中的其它物质如土壤颗粒等分离，然后再对其进行裂解、提取等处理。总 d n a 的提取期望尽可能多的提取出环境中微生物的d n a 。通过对不同提取方法 得到的d g g e 带谱进行比较可以评价提取效果的好坏。 5 ) 对功能基因多样性的研究 微生物多样性及其生理代谢活动在生态系统的物质循环和能量循环中起着 主要的作用，是微生物生态学研究的主要内容之一。对环境样品总d n a 的直接 检测能够从基因水平上反映环境中多样性的状况，其中包括了代谢旺盛的、休眠 或无代谢活性的微生物，不能单独反映该环境中有代谢活力的微生物的状况。代 谢旺盛的细胞中具有较多的核糖体，因此可以通过研究m r n a 来反映环境中处 于不同生理代谢活动期的微生物。 1 3 2 4d n a 测序、16 sr d n a 文库的建立及微生物分类鉴定 将纯化的d g g e 条带置入水中以后，其d n a 会再度溶解出来，之后，再由p c r 反应将溶解于水中的d n a 进行扩增反应，以获得高浓度的1 6 sr d n a 接着便可进 行以1 6 sr d n a 为序列的微生物测序及1 6 sr d n a 文库的建立。 对微生物1 6 sr d n a 进行测序时最好进行全长测序，尤其是所测序列将要用 于探针设计和新物种确定时。另外，采用正反向引物对所测序列进行重复验证可 以确保序列的准确性。但由于目前测序费用还比较高昂，因此许多研究者也采用 测l6 sr d n a 部分序列的方法进行微生物多样性分析和平行样品比较。研究表明， 4 0 0 - 6 0 0 碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计， 但这样短的序列通常不能用于新物种鉴定和探针设计。 有了微生物1 6 sr d n a 序列，不论是全长还是部分，都可以提交至l j g e n b a n k 采用b l a s t 程序与己知序列进行相似性分析。g e n b a n k 将按照与测得序列的相似 性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更 为精确的微生物分类还取决于系统发育分析( p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ) 。 系统发育分析，就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分子( 如1 6 s r d n a 、a t p 酶基因) 的序列同源性，计算不同物种之间的遗传距离，然后采用聚 第一章绪论 类分析等方法，将微生物进行分类，并将结果用系统发育树表示。计算菌属、菌 种之间的遗传距离可以采用不同方法。在计算遗传距离之后，构建进化树时有许 多种方法，其中以n e i g h b o rj o i n 法最为常用。在进行系统发育树分析时常用到的 一些软件包括m e g a3 1 和a r b 。 对于一个完整的进化树分析一般包括以下几个步骤： 要对所分析的多序列目标进行排列( t oa l i g ns e q u e n c e s ) 。做a l i g n m e n t 的软件很多，最经常使用的有c l u s t a l x 和c l u s t a l w ，前者是在w i n d o w s 下的而后者是在d o s 下的。 要构建一个进化树( t or e c o n s t r u c tp h y l i g