流式细胞术实验方法及应用PPT课件.ppt

流式细胞术实验方法及应用,科研型分选功能488nm激光四色荧光(525、575、610、675nm）,一、流式细胞术的原理,流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。,前向散射,激光,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,近30年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。,速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个细胞，甚至几万个细胞。多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把细胞群分为各亚群。,二、流式细胞术的特点、优点,定性、定量分析细胞通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。灵敏度高荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于10、G2/M15或S20、G2/M5,白细胞分化抗原（CD分子）的命名：1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群(ClusterofDifferentiation，CD)，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个分化抗体群被鉴定并命名,2、淋巴细胞亚群分析,流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个亚群。,CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,T淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞B淋巴细胞（CD19+）NK细胞（CD16+56）+,NK细胞:CD(16+56)+/CD3-,B淋巴细胞:CD19+/CD3-,NK+/CD3-,CD（16+56）+/CD3+（T-cell）,CD19+/CD3+（T-cell）,CD19+/CD3-,50ul+10ul相应抗体避光孵育15min加OptiLyesC溶血素250ul室温10minPBS洗一次上机分析抗体:CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体CD19-PE/CD3-FITC二标抗体CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照,外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）,淋巴细胞亚群检测临床意义：CD3+、CD4+、CD8+总数降低：细胞免疫功能低下CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)降低：自身免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血CD3+CD4+CD8+T细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重免疫缺陷病。,NKCD(16+56)+活性低下：肿瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等NK+CD(16+56)+活性增高：多发性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（B病毒、疱疹病毒、肺TB）、习惯性流产等CD19+B细胞减少：体液免疫抑制CD19+B细胞增高：B细胞恶性增殖性疾病（白血病）,FCM作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体包括：胞浆（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a,T淋巴系-cyCD3）,胞膜(髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10,T淋巴系-CD3、CD2)等,3、白血病免疫分型,采用CD45和侧向散射(SSC）设门技术可将各细胞群分开，荧光从强大到弱：淋巴细胞群单核细胞成熟粒细胞原/幼细胞(白血病细胞)，而成熟的红细胞和血小板不表达。,正常骨髓流式细胞分布图,各系表达的抗原造血干细胞：CD34、CD33髓系表达：CD13、CD14、CD33巨核细胞：CD61、CD41B细胞系：CD10、CD19、CD20T细胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK细胞:CD16、CD56、CD57,细胞因子（CK）主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种CK，一种CK也可由多种细胞产生。细胞因子分为4类：白细胞介素（lL）；干扰素（IFN）；造血生长因子；肿瘤坏死因子（TNF）。,4、细胞因子的检测,血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加并不断分泌到细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞内的细胞因子较为困难。通常应用刺激剂（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。,全血或单细胞+刺激素(佛波脂)和阻断剂(莫能霉素)37培养4-6h加入细胞表面抗体(如CD3、CD4/CD8)孵育20-30minPBS洗1次加固定破膜剂室温15min加入IFN-r和IL-4抗体孵育30minPBS洗两次FCM。,细胞因子检测（IFN-r，IL-4）：,结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（FS）和侧向散射（SS）圈出淋巴细胞，再用CD3+和SSC设门圈出T淋巴细胞，再用CD8-/CD3+设门选定T淋巴细胞亚群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r,淋巴细胞,T淋巴细胞（CD3+）,CD3+CD8-（CD4+）,IFN-r,IL-4,检测Fluo-3/Am是高特异性Ca2+荧光指示剂，能与Ca2+特异结合。Fluo-3它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去AM重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离Ca2+浓度的变化。单细胞悬液+flour-3/AM37C避光孵育40minPBS洗1次上机检测,5、细胞内Ca2+浓度Ca2+超载是细胞损伤的重要标志，导致DNA降解，促使细胞凋亡。,6、线粒体膜电位,线粒体膜电位（MMP）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量，MMP下降，其氧化磷酸化功能障碍，使ATP产生减少，导致细胞凋亡和坏死。,Rhodamine123（罗丹明123）、DiOC6、JC-1等多种亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测MMP的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒体内膜的内侧带负电荷，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。,MMP检测原理及方法：,当MMP降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映线粒体数量和MMP的降低或丧失。操作：单细胞悬液（1*106）+1umol/L的Rh12337C,30minPBS洗两次上机检测,细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。,7、FCM检测细胞凋亡,半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的Caspase进一步激活其他的Caspase前体，形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现15个Caspase家族成员，分别命名为Caspase1-15。在Caspase家族成员中，Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。,（1）Caspase家族,操作：单细胞悬液（1*106）固定和破膜剂冰浴20minPerm/WashBuffer洗两次20ul单抗室温孵育30minPerm/WashBuffer洗1次加0.5mlPerm/WashBuffer上机检测。,细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、ced基因家族等。抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad等促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等染色标记同Caspase,（2）凋亡相关基因蛋白,Fas又称APO-1，即CD95分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。Fas/FasL是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重要分子,Fas/FasL结合,可向细胞传递死亡信号,引起细胞凋亡。检测：同表面标记,（3）Fas/FasL,被认为比较成熟的方法：,（4）凋亡率检测,PI单染色法AnnexinVPI双染法。TUNEL法,碘化丙啶（PI）单染法（DNA周期分析）：由于凋亡细胞DNA被降解，小分子DNA可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成凋亡细胞DNA含量减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。,AnnexinVPI双染法：在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，PS被特异的AnnexinV-FITC探针所标记，而PI对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，故AnnexinV-FITC/PI双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。,机械损伤细胞：AnnexinV-/PI+晚期凋亡、坏死细胞：AnnexinV+/PI+早期凋亡细胞：AnnexinV+/PI-活细胞：AnnexinV-/PI-,TUNEL法：细胞凋亡时，双链DNA会出现断裂点，即产生一