（动力工程及工程热物理专业论文）光合细菌生物膜生长特性实验及模拟.pdf

the experiment and simulation of photosynthetic bacterial biofilm growth characteristics a thesis submitted to chongqing university in partial fulfillment of the requirement for the degree of master of engineering by dang nan supervisor: prof. zhu xun major: power engineering and engineering thermophysics college of power engineering of chongqing university, chongqing, china april, 2008 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 i 摘 要 随着经济发展和人类对能源需求的日益增加，对清洁能源的开发与应用是大 势所趋，而氢能作为一种洁净的可再生的能源，具有非常大的发展潜力。光合细 菌可以在光能的驱动下降解有机废物为氢气，实现污染治理的资源化利用；利用 光合细菌生物膜反应器能有效地完成有机废物的处理，同时高效地产生清洁的能 源氢气，这在有机废物的综合利用和环境保护方面是很有前途的处理技术。 本文针对光合细菌在平板式生物膜反应器中的生长过程，采用在线观察光合 细菌生物膜微观结构和离线分析生物膜生长特性参数相结合的方法，实验研究了 在不同的入射光波长、强度、循环液流量和底物浓度条件下，高效光合产氢细菌 生物膜在固体基质表面上生长特性，讨论了其对沼泽红假单胞菌生物膜表面覆盖 率、膜厚、干重和密度的影响。在实验研究的基础上，采用元胞自动机模型对生 物膜生长过程中的生长结构和形态进行了模拟。本研究工作的开展，揭示了光合 细菌在固体基质表面上的吸附及生长机理，同时为光合细菌生物膜反应器的挂膜 启动提供实验依据，并且为污水处理和光生物制氢技术的发展提供基础性材料。 实验和模拟研究所取得的主要研究成果如下： 1）当光照波长范围为 420nm-590nm 时，在相同时间间隔内，生物膜表面覆盖 率随着光照波长的增加而增加；光照波长对生物膜干重的影响很小，在实验运行 4 天后，生物膜的厚度随波长的增加而减小；光照波长越长，生物膜密度越高。 2）当入射光强度范围为 1000lx-8000lx 时，在相同实验运行时间，5000lx 条件 下生物膜覆盖率最高；当光强小于 5000lx 时，实验运行 4 天后，生物膜干重、密 度随光强的增加而增加，膜厚随光强的增加而减小；8000lx 条件下生物膜干重、 厚度最低，密度与 1000lx 条件下差别不明显。 3）当循环液流量为 37.8 ml h-1-1080 ml h-1时，在相同实验运行时间，生物 膜覆盖率随流量的增加先增加后减小；当流量大于 228 ml h-1时，循环液流量对 生物膜生长特性参数影响不大；当流量为 37.8 ml h-1时，生物膜厚度最大，密度 最低。 4）当底物浓度为 0.05 g l-1-10 g l-1时，在相同实验运行时间，10 g l-1条件 下的生物膜覆盖率最高；底物浓度对生物膜干重及厚度影响规律不明显，但生物 膜密度随底物浓度的增加而增加。 5）在各种影响参数中，光照条件对光合细菌形态和生物膜结构影响最大，当 入射光波长为420nm时，光合细菌的分裂增殖及生长代谢功能受到抑制，进而使个 体细菌形态和相应的生物膜结构发生变化；当入射光强度为8000lx时，生物膜变为 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 ii 复杂的长条状不规则结构，且生物膜覆盖率最低。循环液流量对光合细菌在固液 界面的成膜速率影响最大，当流量为37.8 ml h-1时，生物膜生长最慢，但生长速 率并非随流速的增加而增加。底物限制性条件可促使悬浮光合细菌以固定化方式 生长，且生物膜结构疏松，这是光合细菌应对不利环境的生存战略。 6）结合光合细菌生长和生物膜内底物扩散的控制方程，建立了光合细菌生物 膜生长的元胞自动机模型，对光合细菌生物膜在不同实验工况下的生长过程进行 了数值模拟，模拟结果表明：光合细生物膜为多孔状不规则结构；流体剪切力越 高， 生物膜表面结构越平整； 生物膜生物量随光照强度的增加先增加后减小， 1000lx 与8000lx条件下生物膜结构相差很小；波长为420nm条件下的生物膜密度最低，低 底物浓度条件下生物膜密度较低；但是通过模拟得到，光合细菌生物膜生物量和 厚度均随波长及底物浓度的增加而增加。 关键词：关键词：光合细菌，生物膜，元胞自动机模型，可视化 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 iii abstract with the economic development and the increasing requirement of energy for human being, the exploitation and utilization of clean energy is becoming a general trend. it is of great developing potential to exploit hydrogen energy as a clean recyclable energy. organic discard can be descended into hydrogen by photosynthetic bacteria at the driving of sunlight power, then, the recycling use of the administration of pollution can be realized. bioreactor of photosynthetic bacterial biofilm can process organic discard effectively and can produce clean hydrogen in a large quantity at the same time. this is an advanced technology of great potential in the comprehensive utilization of organic discard and environment protection. for the photosynthetic bacteria growing process in the plate-type bioreactor for biofilm development, a series of experiments on the effects of wavelength, wave-strength, flow flux and nutrition of the circulating liquid on the growth characteristics of the high-efficiency hydrogen-production photosynthetic bacterial biofilm were carried out with the help of the on-line observation of the micro-organization of photosynthetic bacterial biofilm and off-line analyse of the growth characteristic of bacterial biofilm in the present study. then, the effects of these important parameters that affecting the surface coverage rate, thickness, dry weight, and density of rhodoseudomonas palustris biofilm were discussed, respectively. on the basis of experimental studies, the cellular automation model was adopted to simulate the structures of biofilm. the launching of this study, the absorption and growth mechanism on solid substratum of photosynthetic bacteria was revealed；at the same time, the experimental basis for the starting up of bioreactor for photosynthetic bacterial biofilm was offered; and the basic material for the development of processing polluted water and the making of hydrogen technology was offered as well. the main research results are as follows: 1) under the conditions of light wavelengths varying from 420 nm to 590 nm, the surface coverage rate of the biofilm increases with an increase in light wavelength while the dry weight of biofilm keeps almost constant at the same time period. the thickness of biofilm decreases with the increase in light wavelength after 4 days. a longer light wavelength leads to a solider biofilm with a larger density. 2) under the conditions of light wave-strength varying from 1000lx to 8000lx, the 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 iv surface coverage rate of the biofilm is the highest at the light wave-strength of 5000lx at the same time period. under the conditions of light wave-strength smaller than 5000lx, the dry weight and density of biofilm increases with an increase in light wave-strength while the thickness of biofilm decreases after 4 days. the dry weight and thickness of biofilm is lowest at 8000lx, and the differences of biofilm density are unobvious at light wave-strength of 8000lx and 1000lx. 3) under the conditions of flow flux varying from 37.8 ml h-1 to 1080 ml h-1, the surface coverage rate of the biofilm increases first and then decreases with an increase in flow flux at the same time period. when the flow flux is higher than 228 ml h-1, the growth characteristic parameters of biofilm are less effected by the different flow flux. the thickness of biofilm is largest while the density is lowest at the flow flux of 37.8 ml h-1. 4) under the conditions of substrate concentration varying from 0.05 g l-1 to 10 g l-1, the surface coverage rate of the biofilm is highest at substrate concentration of 10 g l-1 at the same time period. the dry weight and thickness of biofilm are less effected by the different substrate concentration, while the density of biofilm increases with an increase in substrate concentration. 5) among all the affecting parameters, the effect of sunlight to the morphology of photosynthetic bacteria and the structure of photosynthetic bacterial biofilm is the most significant. the cell division and production of extracellular polymeric substance (eps) were restrained, which then, affects the morphology of the individual bacteria and structure of respective biofilm, when the wavelength of light is 420nm；the biofilm changes into the shape of long irregular strips and the coverage rate of biofilm is the lowest when the wave-length of light is 8000lx; the effect of the flow of circular fluid on the film-forming rate of photosynthetic bacteria on the surface of solid and fluid is most significant; the biofilm grows at the slowest speed, but the rate of growing does not increase with the increase of flowing speed when the flow is 37.8ml/h. nutrition limitation can promote the growth of the floating photosynthetic bacteria in a fixed way and can make the biofilm structure porous, which is the living strategy to the unfavorable environment of photosynthetic bacteria. 6) combined with the growth of photosynthetic bacteria and the differential equation of nutrition spreading of the inner-biofilm, the cellular automation model for the growth of photosynthetic bacteria was established, and the growth process of biofilms of photosynthetic bacteria under different experimental conditions was 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 v simulated mathematically. the results show that the photosynthetic bacterial biofilm is irregular structure with many bores. a higher liquid shear leads to a flatter surface of biofilm. the biomass increases first and then decreases with an increase in light wave-strength, the differences of biofilm structure are little at light wave-strength of 8000lx and 1000lx. the density of the biofilm is the lowest at light wavelength of 420nm and lower substrate concentration. the biomass and thickness increase with an increase in light wavelength and substrate concentration. keywords: photosynthetic bacteria, biofilm, cellular automation model, visualization. 重庆大学硕士学位论文 目 录 vi 目 录 中文中文摘要摘要 . i 英文摘要英文摘要 . iii 1 绪绪 论论 . 1 1.1 概述概述 . 1 1.2 细菌生物膜生长的国内外研究现状细菌生物膜生长的国内外研究现状 . 2 1.2.1 细菌生物膜形成 . 2 1.2.2 细菌吸附机制 . 4 1.2.3 细菌生物膜的分析方法 . 7 1.2.4 生物膜生长的元胞自动机模型 . 9 1.3 本课题目的及主要任务本课题目的及主要任务 . 10 2 光合细菌的培育和优势菌种筛选光合细菌的培育和优势菌种筛选 . 12 2.1 实验方法实验方法 . 12 2.1.1 光合细菌的采样和增殖培养 . 12 2.1.2 光合细菌的分离纯化 . 13 2.1.3 光合细菌产氢性能的测试 . 13 2.2 实验器材实验器材 . 13 2.3 实验结果及实验结果及分析分析 . 13 2.3.1 光合细菌的分离纯化和形态特征描述 . 13 2.3.2 光合细菌产氢优势菌种的鉴定 . 13 2.3.3 16s rrna 基因序列分析 . 15 2.4 本章小结本章小结 . 15 3 光合细菌生物膜生长特性实验光合细菌生物膜生长特性实验 . 16 3.1 实验目的实验目的 . 17 3.2 实验设备实验设备 . 17 3.2.1 平板式光合细菌生物膜反应器的设计要求 . 17 3.2.2 反应器的设计 . 18 3.2.3 实验循环系统 . 19 3.3 实验方法实验方法 . 20 3.3.1 光合细菌生物膜生长的实验方案 . 20 3.3.2 实验参数的测定方法 . 21 3.3.3 实验测量参数的误差分析 . 22 重庆大学硕士学位论文 目 录 vii 3.3.4 实验步骤 . 22 3.4 光合细菌生物膜在固液界面的生长特性实验光合细菌生物膜在固液界面的生长特性实验 . 23 3.4.1 循环液流速对光合细菌生物膜生长的影响 . 23 3.4.2 底物浓度对光合细菌生物膜生长的影响 . 28 3.4.3 光照波长对光合细菌生物膜生长的影响 . 33 3.4.4 光照强度对光合细菌生物膜生长的影响 . 38 3.5 本章小结本章小结 . 43 4 模拟光合细菌生物膜形成及生长的元胞自动机模型模拟光合细菌生物膜形成及生长的元胞自动机模型 . 45 4.1 元胞自动机模型概述元胞自动机模型概述 . 45 4.1.1 元胞自动机的构成要素 . 46 4.1.2 元胞自动机的一般特征 . 47 4.2 光合细菌生物膜生长光合细菌生物膜生长 ca 模型的建立模型的建立 . 47 4.2.1 基本定义 . 47 4.2.2 转化规则 . 47 4.2.3 控制方程的建立 . 48 4.3 模拟流程模拟流程 . 49 4.4 模拟结果模拟结果与讨论与讨论 . 49 4.4.1 生物膜脱落概率对光合细菌生物膜结构的影响 . 49 4.4.2 初始底物浓度对光合细菌生物膜结构的影响 . 52 4.4.3 入射光波长对光合细菌生物膜结构的影响 . 53 4.4.4 入射光光强对光合细菌生物膜结构的影响 . 55 4.5 本章小结本章小结 . 57 5 主要结论及进一步工作建议主要结论及进一步工作建议 . 58 5.1 本文主要结论本文主要结论 . 58 5.2 进一步工作建议进一步工作建议 . 59 致致 谢谢 . 60 参考文献参考文献 . 61 附附 录录 . 65 重庆大学硕士学位论文 1 绪 论 1 1 绪 论 1.1 概述 随着经济发展和人类对能源需求日益增加， 作为主要能源的矿物燃料,如煤炭、 石油、天然气等的贮量不断减少,按现在能源的消耗速度,矿物燃料消耗必然面临危 机。同时由于矿物燃料大量应用,已对全球环境造成了严重威胁。因此,寻找新的高 效、可再生的清洁能源是我们解决环境压力、能源不断减少的现实矛盾的迫切任 务。 氢能作为一种洁净的可再生的能源,取之不尽、用之不竭，且还具有很多优点， 比如：氢气燃烧的产物是水，不污染环境；重量轻，热值高，利用效率高，用途 广泛；氢气可以经济有效地贮存和输送，金属氢化作为氢气的贮存介质，同时又 具有化学能、热能和机械能相互转化的功能等。因此氢能是我们最为理想的替代 能源1。 近年来，发达国家高度重视氢气开发与利用,并且投入了大量的人力、物力、 财力来开展研究工作， 如日本的“阳光计划”、 加拿大利用丰富的水力资源电解水制 氢、欧洲利用核能发展氢能技术、美国则利用太阳能制氢，德国宝马公司目前也 有新型燃料电池汽车面世。相比而言我国虽已提出氢能计划，比如燃料电池汽车 的开发和制造等，但是在该领域投入资金数量过少,与实际需要相差甚远，新能源 和可再生能源系统技术的发展水平,与发达国家尚有较大的差距,在资金投入力度 上甚至还不如一些发展中国家。由此可见，目前发达国家已经对制氢技术高度重 视，并进行了大量的开发和利用，而我国对氢气的研究和利用与发达国家差距很 大，寻找并且实施高效制氢方法是我国科学家面临的责任与义务。 目前，氢气的制备方法有很多种，其中4%的氢气产量是由电解水的方法制取 的， 其余的是用化学法从石油、 煤炭和天然气等化石燃料或工厂副产气转化制得2。 但是这些方法不仅要消耗大量的矿物资源，而且生产过程中还会造成严重的环境 污染，极大地限制了氢能的发展和应用。在可再生能源领域也有运用太阳能技术 制取氢气，但是利用太阳能技术不仅技术要求高、而且单位面积太阳辐射能很小， 限制了其应用。而生物质具有可再生性且分布广泛、储量丰富，生物制氢技术是 目前国内外研究的热点问题。根据制氢过程所利用的产氢微生物，可分为厌氧发 酵制氢和光合细菌生物制氢技术。这两种方法制氢成本低，运行稳定，制取氢气 的同时还可以处理有机废水，且细菌代谢产物为氢气和二氧化碳，不会对环境造 成污染，利用微生物法制氢是目前最具有前途的制氢方法之一。 本课题针对光合生物制氢技术，将光合产氢细菌固定在固体基质表面上制取 重庆大学硕士学位论文 1 绪 论 2 氢气，即利用光合细菌生物膜法制取氢气，这也是目前生物制氢领域的一个重要 的前沿研究方向。在固定化光合细菌的反应器中，光合细菌会首先在反应器内固 体基质表面上形成光合细菌生物膜，生物膜内细菌的产氢行为与悬浮细菌的产氢 行为不同，而且由于固体基质界面的影响，光合细菌的生长和代谢特性与悬浮细 菌也具有较大差异，所以研究光合细菌在固体基质表面的生长机理、产氢行为具 有重要意义。大量研究表明，细菌在固体基质表面上的生长、代谢行为受外部环 境的影响非常大，这些外部环境因素主要包括水力条件、营养条件、光照等3,4， 而这些外部环境制约细菌生物膜的生长的现象可归结为传递现象对生物膜生长的 影响。所以研究传递现象对光合细菌生物膜生长、产氢行为的影响对于研究固定 化细菌制氢技术具有重要的意义和价值。 1.2 细菌生物膜生长的国内外研究现状 1.2.1 细菌生物膜形成 生物膜与人类生活关系密切。由于生物膜反应器比悬浮生长反应器具有更大 的优势，所以细菌生物膜大量应用在废水处理系统中5；除此之外，生物膜经常用 于对污染土壤的生物修复系统当中；另外，利用产氢细菌生物膜反应器生产氢气 也是一种最有前途的氢气生产方式之一。但是，细菌生物膜同样存在负面作用， 比如，一些致病细菌可以在人类器官及组织，医疗设备上形成生物膜，由于生物 膜抗逆性较强，往往难以控制，造成严重的感染；食品加工设备上也容易形成生 物膜，从而造成对食品的污染；此外，生物膜细菌还会污染与人类生活相关的设 施，如空调系统、供水系统等，从而降低这些设备的使用效率和寿命。因此对细 菌生物膜的研究一直是微生物学、医学、环境科学等领域中的热点问题。 成熟的生物膜是不可逆吸附到载体表面、包含细菌胞外聚合物并且表现出特 殊的表形特性的微生物群体6。在自然界中，微生物90以上是以生物膜的形式存 在的，研究表明，逆境条件会促使生物膜的形成，比如当营养受到限制、不适宜 的ph值、微生物抑制剂等。在适当的条件下，几乎所有的细菌都能形成生物膜， 但不同细菌形成生物膜的能力不同，有的细菌形成膜的速率较快，有的则较慢。 生物膜的成分 生物膜主要由细菌生物量和细胞胞外聚合物 （eps） 组成， 并且含有大量水分， 细胞胞外聚合物主要是由多糖、蛋白质组成。聚合物基质对于生物膜来说，具有 很多重要的功能，比如：是影响细菌生物膜结构的最重要因素之一，可以形成和 保持细菌生物膜的结构；增强生物膜抵抗外部压力的抗逆性，并且可以使细菌在 生物膜中获取营养7。 生物膜的形成过程 重庆大学硕士学位论文 1 绪 论 3 生物膜的形成过程包括细菌的吸附、生物膜的发展和成熟三个阶段。 细菌的吸附是生物膜形成的第一步，吸附阶段包括悬浮细菌在介质表面的吸 附和菌体间的聚集过程。细菌在经过不可逆的吸附过程之后，逐渐适应生存环境， 首先形成细菌单层，进而发展成小的、分散的细菌菌落，这些初始菌落首先在载 体表面的不规则处形成。此阶段对于生物膜的形成至关重要。 细菌附着于介质表面之后，就进入生物膜的发展阶段，包括众多细菌菌落的 形成、长大进而连接成大的扩散性多孔结构的过程。当细菌粘附到表面后，调整 其基因表达，在生长繁殖的同时分泌大量胞外多糖（eps），eps可粘结单个细菌 而形成细菌团块，即细菌菌落。大量的细菌菌落使生物膜变的越来越厚。在此阶 段由于营养物的供给超过了消耗的需要，固着的微生物在载体表面呈最大速度增 长。 当微菌落扩大到一定程度，生物膜就进入了成熟阶段。成熟的生物膜在内在 的调节机制或在外部冲力下可部分脱落，脱落的细菌又转变成浮游的生长状态， 再黏附到合适的介质表面形成新的生物膜4,5,8,9。 影响生物膜结构的主要因素及其对膜结构的影响 水文条件、载体表面类型、营养水平、光照等是水环境中生物膜形成的最主 要影响因素。 水文条件中流速对生物膜的形成极其重要。研究表明，低流速时，可观察到 单细菌明显地在载体表面上附着，并且易形成细菌菌落；而高流速时，细菌呈堆 状附着，单细菌很少。由于较强的粘附、较高的剪应压力以及胞外多糖聚合物的 较高产量，高流速下形成的比在低流速下形成的生物膜可以更牢固地粘附在载体 表面上。控制生物膜生长的最主要参数是水的流速，高流速使生物膜易于形成单 层结构，而低流速使生物膜形成复杂结构。 营养水平对生物膜的形成及结构同样具有重要影响。在低底物浓度条件下， 生物膜是由彼此分隔的微生物菌落堆砌而成，在这些菌落和固体基质表面相连接 的地方有一个膜的连续层，这种生物膜结构被称为异质嵌合模型。在中等底物浓 度条件下，生物膜形成典型的蘑菇状多孔结构，该结构由类似蘑菇形状的微菌落 组成，膜底比膜顶窄，在这些微菌落之间围绕着输水通道，水溶液可在通道中不 断的流动循环，从而运送养料、代谢产物和排出废物等。在高底物浓度条件下， 生物膜易形成非常均匀的结构，这种结构微孔极少3,4。 s.ebrahimi10等研究了剪切力和底物传递对生物膜生长的影响， 指出生物膜的 形成是由底物传递引起的微生物生长和由剪切力引起的生物膜脱落相互平衡作用 的结果。 s.m.soini11等研究了在水压力系统当中，水的流动速度和水质对悬浮细菌和 重庆大学硕士学位论文 1 绪 论