（分析化学专业论文）基于半胱氨酸与重金属离子相互作用的分析应用研究.pdf

i 量 一 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论 文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加入了特别标注，不存在抄 袭、伪造等学术不当行为。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、 同仁均已在文中作了明确说明并表示衷心感谢。对文中所呈内容由本人负全部学 术责任。 学位论文作者：碗木签字日期：c 971 年b 月7 日 ，i 、式 。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文： 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：傅杰 签字日期：o c 1 1 年占月7 日 学位论文作者毕业后去向：。 工作单位： 通讯地址： 日 邮编： 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩写符号对照表v 第一节绪论1 第一节半胱氨酸的概述一1 第二节半胱氨酸的检测。l 第三节半胱氨酸的应用6 第四节本文拟达到的目的和意义及主要研究内容9 第二章金纳米颗粒作为铜离子氧化半胱氨酸的可视化指示剂及其分析应用1 l 第一节引言1 1 第二节实验部分1 2 2 1 仪器。1 2 2 2 试剂一12 2 3 实验方法1 2 第三节结果与讨论1 3 3 1 金纳米颗粒的表征1 3 3 2 体系的光谱特征及扫描电镜1 3 3 3 机理探讨l5 3 4 反应条件的优化1 6 3 5 选择性实验1 7 3 6 标准曲线和样品分析1 8 第四节本章小结l9 第三章基于s y b rg r e e ni 的荧光免标记法检测半胱氨酸和银离子2 1 第一节引言2 l 第二节实验部分2 2 2 1 仪器：2 2 2 2 试剂2 2 2 3 实验方法2 3 第三节结果与讨论2 3 3 1 荧光光谱特征2 3 3 2 实验条件优化2 5 3 3 选择性实验2 7 3 4 实验结果2 9 第四节本章小结2 9 第四章基于金纳米簇汞离子体系的荧光恢复检测半胱氨酸31 第一节引言3l 第二节实验部分31 2 1 仪器3 1 2 2 试剂3l 2 3 实验方法3 2 第三节结果与讨论3 2 0 1 金纳米簇的表征。3 2 3 2 体系的荧光光谱特征3 3 3 3 实验条件的优化3 5 3 4 选择性实验。3 7 3 3 实验结果3 8 第四节本章小结= oo oooo oo0 3 9 第五章全文总结与展望4 1 参考文献4 3 硕士期间科研成果。5 3 致谢5 5 氨酸的检测和应用引起了人们的广泛关注。另外，半胱氨酸还可以与重金属离子 发生作用，其作用主要是通过巯基与重金属离子不同的结合能力来实现的，并且 已有文献报道半胱氨酸的巯基能被铜离子选择性氧化。本文将半胱氨酸与重金属 离子之间的作用应用到了重金属离子和半胱氨酸的分析检测中。不但拓展了半胱 氨酸的应用，而且还建立了一种检测半胱氨酸的新方法。具体内容包括以下三个 方面： ( 1 ) 利用半胱氨酸与铜离子的作用实现铜离子的分析检测。研究发现半胱氨 酸能够通过金硫键与十六烷基三甲基溴化铵包被的金纳米颗粒结合，在酸性条件 下诱导金纳米颗粒发生聚集，导致金纳米颗粒的等离子体共振吸收发生变化。而 铜离子能选择性氧化半胱氨酸的巯基，阻止半胱氨酸与金纳米颗粒之间金硫键的 形成，从而抑制金纳米颗粒的聚集。据此，以金纳米颗粒作为铜离子氧化半胱氨 酸的可视化指示剂，通过检测金纳米颗粒5 2 5n l n 处的等离子体共振吸收建立了一 种高选择性检测铜离子的色度分析方法。吸光度值与8 0 x 1 0 培 2 0 x 1 0 西m o l l 范围 内的c u 2 + 浓度呈良好的线性关系，相关系数为0 9 9 6 2 ，检出限( 3 t r k ) 为1 5 x 1 0 - 9 m o l l 。该方法用于天然水体中痕量铜离子的测定，具有较好的精密度和准确度。 ( 2 ) 基于免标记的d n a 荧光法检测银离子和半胱氨酸。s y b rg r e e ni 能选择 性识别单双链d n a ，是常用于p c r 扩增反应的荧光指示剂。本文设计了一段富含 c 碱基的单链d n a 序列，利用银离子与c 碱基形成c a g c 的复合物，使之形成 类似于双链d n a 的结构。当有半胱氨酸存在时，半胱氨酸与c 碱基发生竞争反应 阻止c a g c 结构的形成。以s y b rg r e e ni 为荧光指示剂建立了一种高选择性、高 灵敏度同时检测银离子和半胱氨酸的d n a 免标记的方法。该方法检测银离子的线 性范围为1 2 5 - - 4 5 0n m o l l ，相关系数为0 9 9 7 0 ，检出限为1 2 5n m o l l ；检测半胱 两南人学硕十。何论文 氨酸的的线性范围为1 2 5 , - - 4 2 5n m o l l ，相关系数为- 0 9 9 6 8 ，检出限为0 1 2 5n m o l l 。 ( 3 ) 基于金纳米簇汞离子体系荧光恢复检测半胱氨酸。汞离子是良好的荧光 猝灭剂，能猝灭荧光小分子、有机染料、量子点等的荧光；金纳米簇作为荧光纳 米材料由于其优良的光学性质，引起了人们的极大兴趣。生物大分子牛血清白蛋 白合成的金纳米簇与汞离子之间由于存在h 9 2 + 一a u + 作用，导致金纳米簇荧光被猝 灭。在此基础上利用巯基与汞离子的强结合能力，抑制汞离子与金纳米簇之间的 作用，从而金纳米簇的荧光得到恢复。基于此原理建立了一种高选择性检测半胱 氨酸的新方法。 关键词：半胱氨酸重金属离子金纳米颗粒金纳米簇d n a 一 一 a b s t r a c t 皇皇量鼍曼皇量鲁皇蔓曼曼ii 皇曼曼曼曼皇曼曼曼量曼舅舅璺曼曼皇寡鲁置量皇曼皇曼曼! 曼曼曼量鼻鼍曼曼曼量曼罾皇曼皇曼曼曼曼曼曼曼鼍鼍曼曼皇曼曼曼曼皇鼍鼍量 t h er e s e a r c ho nt h e a n a l y s i sa n d a p p l i c a t i o no f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n c y s t e i n ea n dh e a v y m e t a li o n s m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r yp o s t g r a d u a t e ：j i et a n g s u p e r v i s o r ：p r o f c h e n gz h ih u a n g a b s t r a c t a m o n gm o r et h a nt w e n t ya m i n oa c i d sw h i c hm a k eu pp r o t e i n s ，c y s t e i n ei st h eo n l y o n ew i t hat h i 0 1 i tp l a y sac r u c i a lr o l eb o t hi nb i o l o g i c a lp r o c e s sa n dt h ec o n t r o lo f h u m a nb o d yd i s e a s e ，t h u si t sd e t e c t i o na n da p p l i c a t i o na r o u s ep e o p l e sw i d e s p r e a d c o n c e r n t h ei n t e r a c t i o no fc y s t e i n ea n dh e a v ym e t a li o n si sp r i m a r i l yb a s e do nt h e d i f f e r e n tc o m b i n i n ga b i l i t yb e t w e e nt h i o la n dh e a v ym e t a li o n s ，a n di th a sb e e nr e p o r t e d t h a tt h et h i o lo fc y s t e i n ec a nb es e l e c t i v e l yo x i d a t e db yc o p p e ri o n s t h ep r e s e n tt h e s i s i n t e n d st oa p p l yt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc y s t e i n ea n dh e a v ym e t a li o n st ot h e i ra n a l y s e s a n dd e t e c t i o n s i nt h i sw a y , i tn o to n l ye x p a n d st h ea p p l i c a t i o nf i e l do fc y s t e i n e ，b u ta l s o s e t su pan e wm e t h o dt od e t e c tc y s t e i n e t l l ef o l l o w i n gt h r e ep a r t sa r ei n c l u d e di nt h e t h e s i s ： ( 1 ) t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc y s t e i n ea n dc o p p e ri o n sc a nb eu t i l i z e dt oa n a l y z ea n dd e t e c t c o p p e ri o n s ( c u 2 + ) t h es t u d yh a sf o u n dt h a tt h r o u g ht h ec o m b i n a t i o no fa u - sc o v a l e n tb a n d ， c y s t e i n ei sa b l et oi n d u c et h ea g g r e g a t i o no fc t a b - e o a t e dg o l dn a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) i nt h ea c i d i c c o n d i t i o n s ，r e s u l t i n gi np l a s m ar e s o n a n c ea b s o r p t i o nc h a n g e so fa u n p s h o w e v e r , d u et o i t s s e l e c t i v eo x i d a t i o no fc y s t e i n e st h i 0 1 c u 2 + a r ec a p a b l eo fp r e v e n t i n gt h ef o r m a t i o no fa u - sc o v a l e n t b o n dt or e s t r a i nt h ea g g r e g a t i o no fa u n p s t h e r e f o r e w i t ha u n p sa c t i n ga st h ev i s u a l i z a t i o n i n d i c a t o ro fo x i d a t i n gc y s t e i n eb yc u 2 + ，ac o l o r i m e t r i cm e t h o di se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f c u 2 + i na q u e o u ss o l u t i o n i no p t i m a le x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ag o o dl i n e a rr e l a t i o nc a nb eo b s e r v e d b e t w e e nt h er a t i oo fa b s o r b a n c ev a l u ea t5 2 5a ma n dt h ec o n c e n t r a t i o no fc 一+ i nt h er a n g eo f 8 0 10 。8 2 0 xl0 巧t o o l l ：t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( ，) i s0 9 9 6 2 ，w h i l et h ed e t e c t i o nl i m i t ( 3 a k ) i s 1 5xl0 - 9m o l l t h ep r o p o s e dm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e df o rt h ea n a l y s i so fs y n t h e t i c m i x t u r e sa n dw a t e rs a m p l e s ( 2 ) f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o no fs i l v e ri o n sa n dc y s t e i n eb a s e do nu n l a b e l e dd n a s y b rg r e e nii s u s u a l l yu s e da st h ef l u o r e s c e n ti n d i c a t o ro fp c re x p a n d i n gr e a c t i o ns i n c ei t c a r la l t e r n a t i v e l y i i i 两南人学硕十。何论文 d i s t i n g u i s hb e t w e e ns i n g l e - s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) a n d d o u b l e s t r a n d e dd n a ( d s d n a ) t h ep a p e r d e s i g n sa c b a s ef i c h e ds s d n a ，a n df o r mas i m i l a rs t r u c t u r eo fd u a l d n ab yt h ec - a g - cc o m p l e x c o n s t r u c t e do ft h ec o m b i n a t i o nb e t w e e ns i l v e ra n dc b a s e i nt h ep r e s e n c eo fc y s t e i n e ，i tw i l l c o m p e t ew i t hc b a s et or e s t r a i nt h ef o r m a t i o n o fc a g - cc o m p l e x c o n s e q u e n t l y , w i t hs y b rg r e e ni b e i n gt h ef l u o r e s c e n ti n d i c a t o r , a u n l a b e l l e dd n am e t h o di se s t a b l i s h e df o rs i m u l t a n e o u s l yd e t e c t i n g c y s t e i n ea n ds i l v e ri o n s ( a 矿) w i t hh i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y t h ef o l l o w i n gr e s u l t sh a v eb e e n g o t ：t h el i n e a rr a n g eo fs i l v e r i s12 5 4 5 0n m o l l ，i t sc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( 力0 9 9 6 2a n di t s d e t e c t i o nl i m i t1 2 5n m o l l ；t h el i n e a rr a n g eo fc y s t e i n ei s1 2 5 - 4 2 5n m o l l ，i t sc o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t ( r ) 0 9 9 6 2a n di t sd e t e c t i o nl i m i t0 12 5n m o l l ( 3 ) d e t e c t i o no fc y s t e i n eb a s e do nt h er e c o v e r e df l u o r e s c e n c eo f t h eg o l dc l u s t e r s h g ( i i ) s y s t e m m e r c u r yi o n i sak i n do fg o o df l u o r e s c e n c eq u e n c h e rw h i c hc a l le x t i n c t t h ef l u o r e s c e n c eo fs m a l lf l u o r e s c e n tm o l e c u l e s ，o r g a n i cd y e s ，q u a n t u md o t ，e t c a c t i n g a sf l u o r e s c e n c en a n o m a t e r i a l sw i t l lt h e i re x c e l l e n to p t i c a lp r o p e r t i e s ，g o l dc l u s t e r sh a v e a t t r a c t e dp e o p l e sg r e a ti n t e r e s t o w i n gt ot h ei n t e r a c t i o n so fh 9 2 + 一a u + b e t w e e nn d + a n dg o l dc l u s t e r sw h i c ha l es y n t h e s i z e db yb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e so fb o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) ，t h ef l u o r e s c e n c eo fg o l dc l u s t e r sw i l lb eq u e n c h e db ym e r c u r yi o n s a f t e rt h a t ，i fw em a k eu s eo ft h es t r o n gc o m b i n a t i o nb e t w e e nt h i o la n dm e r c u r yi o n s ，i t i sc o n f i n et h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e ng o l dc l u s t e r sa n dh 矿+ s ot h ef l u o r e s c e n c eo fg o l d c l u s t e r sc a nb er e c o v e r e d t h e r e f o r e ，b a s e do nt h i st h e o r y , an e wm e t h o do fd e t e c t i n g c y s t e i n e 丽m1 1 i g hs e l e c t i v i t yi sc o n s t r u c t e d k e y w o r d s ：l - c y s t e i n e ；h e a v ym e t a li o n s ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ；g o l dn a n o c l u s t e r s ；d n a 、 一 缩写符号对照袭 缩写符号对照表 英文名称中文名称 缩写符号 v 一 第一罩绪论 第一章绪论 第一节半胱氨酸的概述 半胱氨酸( c y s t e i n e ) 学名：2 氨基3 巯基丙酸，是一种脂肪族含巯基的极性 仅氨基酸，在中性或碱性溶液中易被空气氧化成胱氨酸。半胱氨酸分为l 半胱氨 酸和d 半胱氨酸两大类。l 半胱氨酸是蛋白质合成编码氨基酸，哺乳动物非必需 氨基酸和生糖氨基酸。d 半胱氨酸主要存在于萤火虫的萤光素酶中。 半胱氨酸是含硫的0 【一氨基酸之一，遇硝普盐因巯基( - s h ) 作用呈紫色，存在 于许多蛋白质、谷胱甘肽中，由体内的蛋氨酸转化而来。半胱氨酸是不稳定的化 合物，容易被氧化，与胱氨酸相互转换。同时还可以与有毒的芳香族化合物缩合 成硫醚氨酸，因而具有解毒的作用。除此之外，半胱氨酸还具有预防和治疗放射 性伤害、抑制癌细胞和细菌生长、防止生物体衰老、使皮肤变得自然美白、消炎、 止痛等功能。 半胱氨酸易与h 矿+ ，c u z + ，a 矿等金属离子以r s m7 ，r s m ”s r ( m7 ，m ” 各为1 价、2 价金属) 的形式形成不溶性的硫醇盐。据文献报道半胱氨酸的巯基与 金属离子( a g + 、h 矿+ 、c u 2 + ) 之间有较强结合，这种结合能力由强到弱的顺序是： h 孑+ c u 2 + a 矿。还有文献报道半胱氨酸能与具有弱氧化性的铜离子能发生氧化 化学反应，将自身氧化成胱氨酸，而铜离子被还原成亚铜离子【l - 3 】。 第二节半胱氨酸的检测 半胱氨酸是生物体内一种常见的氨基酸，是组成蛋白质的2 0 多种氨基酸中唯 一具有巯基的氨基酸，是人体非必须的氨基酸之一。半胱氨酸的缺乏会引起头发 褪色、组织浮肿、嗜睡、肝组织损伤、肌肉萎缩、皮肤病及婴儿的生长发育缓慢 等疾病及综合症 4 1 ，而其浓度的升高却是冠心病患者血浆动脉粥样硬化的一个危险 因素和标志1 5 j 。同时半胱氨酸还参与新陈代谢、解毒以及蛋白质合成等重要生命活 动 6 1 ，故对半胱氨酸的分析检测有着十分重要的意义。 目前测定半胱氨酸的方法已有很多，如高效液相色谱法【7 ，8 1 、毛细管电泳法 9 1 、 荧光分析法【1 0 1 2 1 、电化学分析法【1 3 。2 2 1 、化学发光分析法【2 3 , 2 4 1 等。下面主要是介绍 利用纳米材料、d n a 和小分子检测半胱氨酸的方法。 随着纳米技术的发展，纳米颗粒与化学、医学、生物学等领域的结合越来越 密切。利用纳米颗粒发展的超灵敏检测方法越来越多，其在细胞成像方面的应用 也越来越广泛【2 5 , 2 6 j 。在此同时也发展了许多用纳米颗粒来检测半胱氨酸的方法， 主要是根据金、银纳米颗粒在溶液中不同的存在状态，溶液表现出不同的颜色来 建立的可视化分析方法。例如，用硼氢化钠还原的c t a b 包被的正电金胶在分散得 两南人学硕十学位论文 状态下呈现红色，而聚集后颜色就从红色变为紫色最后变成蓝紫色。实验证明半 胱氨酸能诱导金纳米颗粒聚集，导致其溶液颜色发生改变，基于此色度法检测半 胱氨酸 2 7 - 3 1 】。s s d n a f 毙保护纳米颗粒增强其抗盐能力，当有半胱氨酸同时存在时， 半胱氨酸拉近金纳米颗粒之间的距离导致其发生聚集【3 2 ，3 引。m i r k i n 3 4 j 课题组将金 纳米颗粒d n a 功能化，采用t 碱基错配的d s d n a 和利用t 碱基能与汞离子形成复合 物的性质，高灵敏度、高选择性比色法检测汞离子( 图1 ) 。吴同p5 j 等人成功制备 形态较均一的银三角，实验证明半胱氨酸能导致银三角形态发生改变，从而引起 其颜色发生改变，据此可视化检测半胱氨酸( 图2 ) 。此外，也有文献报道以水凝 胶合成的银纳米水晶为材料，可视化检测半胱氨酸【j 6 。 囝：h g 扣 翻：t - h 9 2 - t ，：c y s t e i n e b l a n k o ro t h e r a m i n oa c i d 墨 鼬心汐 臼 - ：5 n s - c 1 0 t ，o - 再t o3 。 ：5 。h s - c ，o - a 1 0 - t - a 1 03 图ld n a 功能化的纳米颗粒比色法检测半胱氨酸 w a v e l e n g t h ，n m 图2 银三角可视化检测半胱氨酸 釜oe再cljo西o 第一苹绪论 除此之外，金纳米颗粒还是一类性能良好的荧光猝灭剂。当荧光分子被吸附 在金纳米颗粒表面时，两者之间发生能量转移其荧光被猝灭，而半胱氨酸与金有 很强的结合能力，能将荧光分子从金纳米颗粒表面竞争下来 3 7 - 3 9 】。刘春【3 7 】等人用 柠檬酸三钠包被的负电金胶猝灭罗丹明b 的荧光，而半胱氨酸使其荧光恢复从而 建立了一种检测半胱氨酸的方法，同时还从纳米颗粒表面能量转移的角度进行了 详细的研究( 图3 ) 。 o 一迤 节爹罐1 魂1 ，曦嶝谚 产“备 o f fo n a u n p s 羹r h o d a m i nbc y s t e i n e 图3 金纳米颗粒能量转移法测定半胱氨酸 量子点是一类新型的半导体纳米材料，由元素周期表i i v i ，i i i v 或i v - v i 族 元素构成。由于其具有许多优良的光学性质如：高荧光量子产率、相对狭窄的发 射峰、粒径可协调的发射、光稳定性等已经越来越广泛地被用于分析检测。h u a n g 4 0 】 等人基于半胱氨酸能增强巯基乙酸包被的量子点荧光的原理，建立了一种简单、 灵敏的检测半胱氨酸方法。近几年来，检测物猝灭量子点荧光的原理已经被广泛 的应用于分析检测中，特别是用于汞离子的检测。汪尔康【4 1 l 课题组在汞离子猝灭 量子点荧光的基础上结合汞离子与巯基化合物的特异性作用，将吸附在量子点表 面的汞离子竞争下来，设计了一种量子点荧光先猝灭后恢复的思路来检测生物巯 基小分子( 图7 ) 。 qo o s：h 譬臻b i o t h i o i s 图4q d s - h g 体系荧光法检测巯基小分子 h v 硼南人学硕十学何论文 近年来d n a 的研究引起了人们极大的兴趣，常见的d n a 结构有单链、双链 和g 碱基四折叠结构，不同的结构具有不同的性质。如c 碱基能与银离子形成 c a g c 的复合物，导致s s d n a 发生类似于d s d n a 结构的转变。在血晶素存在条 件下，g 碱基四折叠结构能催化a b t s 或t m b 氧化变色，与过氧化物酶活性作用 类似。g 碱基上的n 和o 能与银离子发生配位，破坏g 碱基四折叠结构的形成， 而半胱氨酸能将银离子竞争下来【4 2 1 。基于此原理，李涛【4 3 l 等人设计了银离子调控 的一段g 碱基d n a 序列，实现了同时对银离子和半胱氨酸的色度法检测。郭俊红 m 】等人利用一种能选择性嵌入g 碱基四折叠结构的荧光染料来实现对银离子和半 胱氨酸的荧光法检测。同时还引入了d n a 含义的“逻辑门”【4 5 】。z h a 0 1 4 6 j 等人利 用可重复使用的单壁碳纳米管和荧光基团修饰的c 碱基错配的d s d n a 荧光法检测 银离子和半胱氨酸。 4 5 6 4 娃s a c 5 h e r o i n g 4d s ( c - - c 】 d n m 卿a 图5 基于g 碱基四折叠结构比色法检测半胱氨酸和银离子 o：a g + ：e 图6s w n t - d n a 体系荧光法检测半胱氨酸和银离子 咖 g 址捧 c o m p l e x 雾 黼一 斟 雠 跳 n甜g 旷 张哦协 姆 第一章绪论 近几年来，荧光小分子探针已被广泛的应用于金属离子和生物小分子的检测 4 r j 。半胱氨酸在生物体内有着重要的作用，其检测自然受到了人们的关注。不同 的荧光小分子被设计并用于半胱氨酸的检测【1 0 1 2 , 4 8 - 5 0 】。用荧光小分子检测多是基 于荧光信号的增强且常用于细胞成像。j i a n 9 1 4 8 j 课题组发现二萘嵌苯北酰亚胺 ( p b i ) 有类似于t 碱基的结构，能与汞离子结合形成聚集体，其荧光发生猝灭， 而半胱氨酸与汞离子的特异性作用，能将汞离子从聚集体中竞争出来，使得二萘 嵌苯北酰亚胺由聚集变成分散，其荧光也得以恢复( 图6 ) 。 中审中甲早 内 一一 。h 专瓣盏一，h g 爷：0 图7 二萘嵌苯北酰亚胺荧光法检测汞离子和半胱氨酸 电化学法是检测半胱氨酸最常用的方法之一，但其稳定性和重现性差。电化 学法多是利用半胱氨酸和电极之间的氧化还原性质来进行分析，也有利用醌和巯 基之间作用来进行检测吲2 1 j 。近年来，已有文献报道利用石墨电极和金、银等金 属电极上的氧化还原行为来研究半胱氨酸。随着纳米技术与纳米科技的发展，人 们对电极进行了改良，将许多纳米材料如：碳纳米管【1 3 l 7 1 ，金属钠米颗粒【1 9 j ，无 机纳米线【1 6 】等修饰在电极上并成功用于半胱氨酸的研究。也有研究者将复合纳米 材料修饰后的电极用于半胱氨酸的检测i l 引，提高了电极的重复性和稳定性。c h e n 2 0 l 课题组先在玻碳电极上沉积上壳聚糖，再用m n 0 2 纳米线修饰，并将修饰后的电极 成功用于生物样品中半胱氨酸的检测。 l u 2 4 j 课题组设计了一种简单方便的流动注射化学发光法检测半胱氨酸，基于 碱性条件下的l u m i n 0 1 c y s t e i n e - n a l 0 4 溶液发出的强化学发光信号来检测半胱氨 酸。除此之外还有色谱法【8 】、毛细管电泳法【9 】等。 5 日 一译一 一珞 踌南火学硕十位论文 第三节半胱氨酸的应用 半胱氨酸在食品工业、化妆品、医药工业中有着广泛的应用1 5 。在食品工业 方面主要用于防止食物褐变，作为某些物质的抗氧化剂和稳定剂等【5 2 ，5 3 】。由于半 胱氨酸的巯基具有还原性和化学反应活性，能调节黑色素的生成故半胱氨酸常用 于美白化妆品的生产【5 4 ，5 5 j 。在医药工业方面主要是利用半胱氨酸的解毒作用。下 面主要介绍一下半胱氨酸在分析检测中的应用。 半胱氨酸在重金属离子分析检测方面的应用。化学上常根据金属的密度把金 属分为重金属和轻金属，重金属离子有h 矿+ 、c u 2 + 、a 矿等。重金属离子给人类的 身体健康带来了巨大的危害，故其检测吸引了人们的极大兴趣。半胱氨酸上的羧 基和氨基能与许多重金属离子配位。如：羧基和氨基与c u 2 + 以2 ：l 的比例进行配位 【5 6 】，羧基与a s 3 + 以l ：3 的比例【5 7 1 发生配位作用等。据此，将半胱氨酸修饰在金纳米 颗粒表面，借助金纳米颗粒独特的性质，实现对重金属离子的检测。如通过a u - s 键将带巯基的半胱氨酸修饰在柠檬酸三钠包被的纳米金表面，利用半胱氨酸上游 离的羧基和氨基与铜离子以2 ：1 的比例形成络合物，拉近金纳米颗粒之间的距离， 导致金纳米颗粒的溶液颜色发生改变，实现了色度法检n c u 2 + 【5 6 】( 图8 ) 。该原理 也用于电化学检测重金属离子，在金电极表面修饰上半胱氨酸，利用半胱氨酸与 铜离子的络合作用，实现对微量铜离子的分析【l 5 引。 c u 2 + - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 图8 用半胱氨酸功能化的a un p s 色度法检测c u 2 + 半胱氨酸也常用作包被剂，如用于量子点的包被，而汞离子和铜离子都是良 好的荧光猝灭剂，通过猝灭量子点的荧光来检测汞离子和铜离子【5 9 石1 1 。c h e n 6 0 1 等 人合成的半胱氨酸包被的c d s 量子点，能选择性响应锌离子，锌离子通过与c d s 量 6 第一苹绪论 子点表面的半胱氨酸形成复合物来增强其荧光，其它金属离子包括铜离子对其荧 光没有明显影响。x i a o 6 2 1 等人利用半胱氨酸来提高小分子检测汞离子的灵敏度和 选择性。还有将在半胱氨酸修饰在纤维素上能明显提高其对汞和甲基汞的吸附能 力【6 3 】。 除此之外还有利用半胱氨酸与铜离子的氧化还原作用来检测铜离子。荧光银 纳米簇由几个到几十个原子组成，由于很强的量子限制效应呈现出很强的荧光。 现在银纳米簇多是以d n a 为模板来制备。在用硼氢化钠还原的a g n 0 3 中，可通过 控制d n a 序列的长度，合成不同大小的银纳米簇，随着粒径大小的变化其荧光颜 色也发生改变晔】。但由于其稳定性差和大粒径难以合成，而未被广泛应用。c h a n g 删 课题组在以d n a 为模板，硼氢化钠还原硝酸银制备银纳米簇的过程中加入适量的 铜离子来增强银纳米簇的荧光，其所合成的这种d n a c u a g 拘纳米簇能在4 。c 的黑 暗环境下存放至少两星期。当有巯基化合物存在时，巯基化合物能与c u a g 纳米簇 结合导致d n a 结构发生改变从而猝灭其荧光。若巯基化合物与c u 2 + 先反应形成二 硫化物，再与c u a g 纳米簇作用其荧光能得到一定程度的恢复。因此，根据半胱氨 酸与c u 2 + 之间的氧化还原作用建立了一种荧光分析铜离子的方法( 图9 ) 。 a b 曩r s 珏三审岫 c n p尘s _ 啦 曩珏 r s - s r d n a - c w a | n c l 彩：c 蚺n c s ：c u + 掌：c 哇：+ 蠢 图9d n a c u a g 纳米簇荧光法检测铜离子 除了在重金属离子分析方面的应用，半胱氨酸衍生物保护的金纳米颗粒和酪 氨酸酶的杂合体可用于酚类化合物的检测协耵，还有利用半胱氨酸修饰的金纳米颗 。_ ，气 ：o 。蓍量鼍j ( 釜 l ，二。慵，：三：一 od b 邮e d 柚牌s c y s 拽h m 馨陆唧。oa g g r e g a t e da 【u n p s 图l o 半胱氯酸修饰的金纳米颗粒可视化检测光气 在纳米颗粒组装方面，半胱氨酸有其独特的优势。半胱氨酸的巯基能与金纳 米颗粒形成a u - s 键结合在其表面，而其游离的氨基和羧基在一定条件下能形成两 性离子，从而诱导纳米颗粒组装【6 1 7 “引。通过半胱氨酸诱导组装纳米颗粒，可以是 单独的纳米棒，纳米球和纳米双椎体之间的组装，也可以是它们之间的混合组装。 此外半胱氨酸诱导纳米颗粒组装的可逆过程可调控稀土上转换纳米材料光可逆行 为【6 9 】( 图1 1 ) 。还有将半胱氨酸修饰在金种的两端，用于诱导金纳米棒的横向生长 【| 7 0 】。实验结果证明，金纳米棒的直径在生长过程中变得越来越长，而其长度并没 有改变，说明金纳米棒的纵向生长被半胱氨酸抑制了。 8 n a n 陬 岭 豢二： 甜 图l1 半胱氨酸诱导的纳米颗粒可逆组装用于稀土上转换纳米材料光学研究 x 、 豫澎 移 翰0 第一章绪论 第四节本文拟达到的目的和意义及主要研究内容 半胱氨酸是人体必需氨基酸之一，对人体内疾病的控制有极大的作用，其分 析检测和应用引起了人们的关注。由于重金属离子对人类身体健康造成了巨大的 危害，其分析检测也引起了人们极大的兴趣。根据上述文献分析，我们认为半胱 氨酸的应用和分析检测方面还存在以下问题：在检测金属离子的应用方面，需要 进行修饰，操作步骤比较繁琐，较为复杂。用d n a 检测金属离子和半胱氨酸主要 是基于g 碱基四折叠结构的催化能力，需要大量的d n a ，该方法成本高且耗时长。 为了更好地发展半胱氨酸的应用，必然需要构建简单、直观、易操作的分析检测 方法。 本论文旨在研究半胱氨酸与重金属离子之间的作用，并将其用于分析检测。 我们拓展了半胱氨酸的应用价值并建立了一种基于金纳米簇检测半胱氨酸的新方 法。主要内容包括以下几个方面： ( 1 ) 在酸性条件下，半胱氨酸能诱导c t a b 包被的金纳米颗粒发生聚集。而铜 离子能选择性氧化半胱氨酸的巯基，破坏半胱氨酸与金纳米颗粒的结合，从而阻 止金纳米颗粒的聚集。以c t a b 包被的金纳米颗粒为指示剂，基于铜离子能选择性 氧化半胱氨酸巯基的原理，建立了一种色度法可视化检测水环境中微量铜离子的 方法。 ( 2 ) c 碱基与a 矿能形成c a g c 复合物导致s s d n a 结构发生类似于d s d n a 结构 的变化，而半胱氨酸的巯基与银离子有很好的结合能力，当溶液中存在半胱氨酸 时，半胱氨酸能与c 碱基发生竞争破坏c a g c 结构的形成，不能形成类似于d s d n a 的结构。利用s y b rg r e e ni 的荧光能选择性识别单双链d n a ，建立了一种免标记的 d n a 高灵敏、高选择性检测银离子和半胱氨酸的荧光法。 ( 3 ) 金纳米簇与汞离子通过h 9 2 + _ a u + 作用，其荧光被猝灭。半胱氨酸的巯基与 汞离子有极强的结合能力。实验结果表明：半胱氨酸与汞离子之间强的结合能力 能阻止金纳米簇与汞离子之间的作用，从而金纳米簇的荧光得到一定程度的恢复。 据此建立了一种金纳米簇汞离子体系荧光恢复检测半胱氨酸的新方法。 9 第一章会纳米颐粒作为铜离了氧化半咣氦酸的可视化指示剂及其分析市用 第二章金纳米颗粒作为铜离子氧化半胱氨酸的可视化指示 剂及其分析应用 第一节引言 铜离子是人体必须的微量元素之一，在人体内保持着一种特殊的内稳态。铜 离子缺乏时会引起关节炎、血管损伤、冠心病、m e n k e s 等疾病，而过量时则会 诱发胃肠炎、癌症、肝硬化、w i l s o n 病1 7 。目前测定铜离子的方法主要有电化 学分析法【亿7 4 、荧光分析法【6 1 ，7 5 - 7 9 1 、光散射法删等。随着纳米分析技术的发 展，已经建立了一系列基于金属纳米颗粒特征光谱性质的铜离子分析法。如利用 半胱氨酸功能化的负电金纳米颗粒在铜离子存在下，半胱氨酸的羧基和氨基与铜 离子形成2 ：1 络合物后，金纳米颗粒发生聚集，据此检测检测1 0 巧m o l l 铜离子 和半胱氨酸【5 6 ，5 7 1( 图l a ) 。在这个作用过程中，金纳米颗粒首先需要半胱氨酸 巯基功能化，然后再利用铜离子与半胱氨酸的羧基和氨基发生配位作用，铜离子 的分析实际上是二步法。在此过程中，铜离子也可与半胱氨酸上没有与金纳米颗 粒作用的游离巯基发生氧化还原作用【2