多糖成分分析综述.doc

多糖成分分析摘要：对多糖的提取、分离纯化、含量分析以及组分结构分析的研究进展进行了综述，并对其应用前景进行了展望。多糖的组分分析是多糖质量控制和提供多糖基本信息的重要环节。关键词：多糖；提取；分离纯化；表征鉴定多糖(polysaccharides,PS)又称多聚糖，由10个以上的单糖分子通过苷键聚合而成，其分子量较大，一般由几百甚至几万个单糖分子组成，是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分子。虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚，但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸。多糖在自然界高等植物、动物、藻类及细菌类内均有存在，分布极广。有些多糖无生物活性，如淀粉、树胶和粘液质等，通常被当做杂质除去。而具有药效作用的多糖大多是活性多糖。1969年，日本学者千原率先证实了香菇热水提出物的抗肿瘤活性，羽田、佐木进一步研究证实有效成分是香菇多糖。自此，全世界掀起了从真菌中提取抗肿瘤活性成分的热潮1。尤其近年来，随着生物学、化学等相关学科的飞速发展，多糖化合物也得到了日益深入的研究。国际科学界视多糖的研究为生命科学的前沿领域，甚至提出21世纪是多糖的世纪。鉴于多糖研究所具有的学术价值和广阔的应用前景，使得多糖研究成为人们关注的研究热点之一；又目前研究比较多的是植物多糖和微生物多糖，因此本文将就植物多糖和微生物多糖的成分分析研究进行概括、总结，并就存在的问题加以展望。1 多糖的提取多糖的提取通常要根据多糖的存在形式及提取部位不同决定其提取方法。一般从植物中提取多糖，先用石油醚、乙醚、丙酮等有机溶剂进行预处理，除去脂溶性杂质1。然后根据不同的溶解度选择一种溶剂进行萃取，常用的为水、稀盐、稀酸、稀碱等溶剂。传统的提取方法有水提醇沉法、稀碱浸提法、稀酸浸提法和酶法等，随着对多糖研究的不断深入，又出现超滤法、微波辅助浸提法以及超声波法等等。1.1 溶剂提取法溶剂提取法是提取多糖的常用方法，利用多糖不溶于乙醇的性质在提取液中加入乙醇使多糖沉淀出来。常用的粗多糖的提取方法有：水提、酸提和碱提。采用碱溶液提多糖时，易使多糖的糖苷键断裂，通常要充氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾加以保护，且这种提取方法只适用于含果胶物质少、粘度小的原料；酸性条件下提取，也会引起多糖降解及糖苷键的断裂，因此在稀酸提取时，时间宜短温度不宜太高；水提法提取成本低，适用于游离态多糖的提取，且干扰物质少易除去，但要求提取工艺中要控制温度、时间、加水量等2。张国强3等用水提醇沉法提取百合（Bulbus lilii）中的多糖成分，温度60，采用10倍体积的蒸馏水，沸水浴提取3h，真空干燥1h，再于105 干燥箱中烘干，即得灰白色的百合多糖粗品；用Sevage法除蛋白质。黄杰等4通过水提法研究了浸提温度、浸提时间、料液比对茶多糖得率、茶多糖含量及蛋白质含量的影响，得出较佳的茶多糖提取工艺，浸提温度宜在55，浸提时间宜为3h，料液比达到1:25 即可。1.2 超声波辅助提取法超声波辅助提取技术是利用超声波产生的振动作用，使媒质质点温度升高，产生空穴效用，加强了胞内物质的释放扩散及溶解，提高了破碎速度，缩短了破碎时间，极大地提高提取效率。曲哓兰5探讨用超声法提取马齿苋多糖，结果表明最佳提取工艺为60加10倍量水超声提取45min，提取2次。与传统水提法相比，超声法提取马齿苋多糖，提取率高，节省提取时间。1.3 微波提取法微波辅助提取技术主要是利用微波加热的特殊性质，细胞内的极性分子吸收微波能后产生撕裂和相互摩擦引起发热，使胞内温度迅速升高，连续高温使其内部压力急剧升高，导致细胞破裂，促进溶剂进入和胞内成分流出，提高提取效率。Wang等6利用微波辅助法提取鹅绒委陵菜中的多糖，在微波功率523W条件下，提取率达到13.33%，与传统水提法相比不但极大缩短时间、节约能源、提高效率，而且提取的多糖具有更高的活性。1.4 生物酶辅助提取法酶提法是利用果胶酶、纤维素酶等对细胞结构的破坏作用，使存在于细胞内部的多糖释放出来，从而提高了多糖的得率。梁敏等7利用木瓜蛋白酶提取枸杞多糖，在木瓜蛋白酶添加量为0.3%、酶解反应温度为45、pH值为7.0、反应时间为2h条件下，提取率为14.9%，比传统热水提取提高65.6%。钱志伟等8研究了酶法提取马齿苋多糖的工艺条件，考察酶用量、酶解温度、pH、酶解时间对马齿苋多糖提取得率的影响。结果表明：最合适的工艺参数为酶用量2.0%、酶解温度40、pH值6.0、酶解时间110 min，该条件下，马齿苋多糖得率可达 9.7%。2 多糖的除杂质2.1 蛋白质的去除采用醇沉或其它溶剂沉淀得到的粗多糖中常含有较多的蛋白质，需要除蛋白。除蛋白的方法传统上有Sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。Sevage法是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，将氯仿按多糖水溶液的1/5体积加入，然后用1/5氯仿体积的正丁醇混合后剧烈振摇2030 min成乳化液，蛋白质变性成胶状，离心后除去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。将Sevage法结合酶法去除蛋白效率可提高68%，且可以节省大量的试剂和时间。刘晓红等8对金樱子多糖采用Sevage法、木瓜蛋白酶法、Sevage法和木瓜蛋白酶法相结合进行脱蛋白研究，发现两者相结合的效果最佳。三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)是一种有机酸，可以使多糖中的蛋白质由于有机酸的作用而变性沉淀，TCA法是在多糖水溶液中滴加3%等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除去胶状沉淀，重复以上的操作即得无蛋白质的多糖，且可与正丁醇(V/V=1:10)联合取得理想的脱蛋白效果9。2.2 色素的去除粗多糖中常含有一些色素(游离色素和结合色素)，根据其不同的性质采取不同的除素方法。常见的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、藻土、高岭土、活性炭等)。杨利剑等10取已去皮、晒干的板栗，粉碎后称取100g，经热水提取，冷却后离心，用20% H2O2脱色，用胰匀浆、Sevage法和三氯醋酸除蛋白多次，直至紫外检测无蛋白质(280 nm左右)和核酸(260 nm左右)及其它杂质。对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法以同时除去蛋白和色素，方法是加入菲林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等与多糖生成不溶性络合物，经分离后用阴离子交换树脂分解络合物得到多糖11。3 多糖的分离纯化3.1 超滤法超滤法采用中空纤维超滤膜，对多糖去蛋白质后的提取液通过超滤去除小分子杂质。MarnochR等12应用超滤法纯化芥子蛋白。张佳13用截流分子量为50000的管式陶瓷膜纯化香菇多糖，在超滤温度40，跨膜压差0.20 MPa，流速4.5 m/s-1的条件下超滤，蛋白质去除率为81.0%，多糖纯度为89.7%，收率为77.6%。3.2 沉淀法包括分布沉淀法、盐析法及金属络合法。其中，分步沉淀法14分级分离是利用不同性质以及不同分子量段的多糖在不同浓度的乙醇中的溶解度是有差别的这一特点，分离沉淀到某一性质或某一分子量段占主要部分的多糖。王卫国等15向香菇粗多糖溶液中分别加入一定比例的甲醇，3000rpm离心15 min，分离得到L1、L2、L3三个组分。季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。陈海华等16采用季铵溴化物络合法分离得到酸性多糖(acidic polysaccharose,AFM)和中性多糖(neutral polysaccharose,NFM)粗制品。3.3 柱层析法包括大孔吸附树脂、凝胶柱层析法、纤维素阴离子交换剂柱层析法、高效液相层析，此外还有大孔树脂层析、亲和层析、活性炭柱层析等。目前，国内多采用凝胶柱层析和离子交换柱层析法。其中，凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，使各种多糖得以分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。高义霞等17将经脱蛋白、脱色后的沙蒿多糖用ultrahydrogelTM500 (7.8mm300 mm)层析分离纯化，0.1 mol/L磷酸缓冲液洗脱，在凝胶色谱中出现单一而对称的峰，纯化效果好、纯度高。离子交换柱层析法11常用的交换介质有DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶(DEAE-Sephadex)、DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose),此法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖，最常用的是DEAE-纤维素，它一方面可纯化多糖，另一方面还可分离各种多糖。洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。赵宇等18将海蒿子多糖粗品溶于少量蒸馏水中，离心，上清液加入DEAE-Sephadex A-25层析柱，NaCl溶液梯度洗脱，收集得到两种均一性多糖。3.4 色谱法色谱法是利用填料对不同种类的糖吸附作用的差异，使混合物中各糖分达到彼此分离的方法，是常用的纯化多糖的方法，包括离子交换色谱和凝胶色谱。马莉等19将DEAE纤维素离子交换色谱柱分离得到的板蓝根多糖粉末用Sephadex G75凝胶色谱柱分离纯化，以磷酸缓冲溶液为洗脱流动相，得到4种板蓝根均一多糖：PS1、PS2、PS3、PS4。多糖广泛参与细胞的各种生命活动而产生多种生物学功能，是非常丰富的资源，多糖的提取分离纯化方法在不断更新，在选取方法时，应当关注目标多糖的性质、特点，综合比较进行实验，才能选取最佳的方法和工艺。4 多糖的表征鉴定4.1 含量测定确定样品中的糖类含量，给取样溶解打基础。国内多用显色剂-硫酸法，根据单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解，脱水生成糖醛衍生物，与酚类、芳胺类等缩和成有色化合物，比色定量，间接求出多糖的含量。苯酚-硫酸法生成橙黄色溶液，在490 nm处有强吸收；蒽酮-硫酸法生成亮绿色溶液在620 nm处有强吸收，其蒽酮试剂需新鲜配置。咔唑-硫酸法用于测定糖醛酸20。这些方法简单、快速，无需多糖纯品和高级仪器，因而被广泛应用于多糖的含量测定。4.2 分子量测定21多糖的分子量分布比较分散，所以一般测得的分子量是一种统计平均值。过去常用渗透压法、端基法、粘度法、光散射法等，这些方法操作复杂且误差较大。目前较常用的方法有凝胶过滤法和高效液相色谱法。此两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。对于分子量小于5万的多糖可采用质谱法。4.3 组分分析多糖的单糖组成分析是控制多糖质量和提供多糖基本信息的最重要环节。目前，多糖组分分析方法一般来说可以分为：传统的化学分析法、物理分析法（仪器分析法）和生物学分析法。其中，化学分析法包括部分酸水解和完全酸水解后中和、过滤，可采用纸层析（PC），薄层层析（TLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）和离子色谱法进行分析。骆传环等22红景天中糖组份的分析中，将红景天多糖水解后进行糖的纸色谱分析，据Rf值判断红景天多糖的组份为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖。仪器分析法种类较多，应用广泛，比如分光光度法、红外光谱法、核磁共振法、气相色谱（GC）、质谱法（MS）等。张汇等23分别采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和气相色谱法(GC)分析黑灵芝菌盖、菌柄和孢子粉多糖的分子质量分布和单糖组成，结果表明三者都以甘露糖、葡萄糖和半乳糖为主，但单糖比例差异较大，而且含量很少的核糖、岩藻糖和阿拉伯糖因多糖来源不同也有较大差异。由此证明黑灵芝菌盖、菌柄和孢子粉多糖的单糖组成存在显著性差异。赵龙岩等24用HPLC-ELSD 和硫酸-咔唑法分析仙人掌多糖(ODPs)的单糖组成；并测定ODPs中蛋白质含量。结果发现ODPs各组分纯度平均达 90% 以上，几乎不含蛋白质，主要由4种单糖组成，糖醛酸含量较高。4.4 结构分析多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂，这不仅因为组成多糖的单糖品种繁多，而且只有一种单糖组成的多糖，其连接方式的不同以及可能有的支链也可造成多糖的结构测定非常困难。目前，多糖的结构分析主要还是对其一级结构进行测定，包括多糖的分子量范围、多糖的单糖组成和单糖的比例、单糖的连接顺序、单糖连接点的类型、单糖和糖苷键的构型以及糖链有无分支、分支的位置及长短，是否有羧基、氨基以及硫酸基的取代和重复单元等等25。常见的结构分析方法有：高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应；而后采用了许多先进的仪器设备，分析方法和手段都有了很大的提高，主要有紫外光谱法、红外光谱法和核磁共振分析法等。高碘酸氧化法是用高碘酸盐作氧化剂选择性的氧化降解多糖，高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处的C-C键，生成相应的多糖醛、甲酸等，反应定量，通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度和支链多糖的分支数目等26。甲基化的基本原理是先将组成多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，随后将多糖中的糖苷键水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接位置。同时根据不同甲基化单糖的比例可以推算出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。甲基化反应的关键在于甲基化是否完全，通常采用红外光谱法检测3500cm-1处有无吸收峰，以此判断甲基化多糖中是否含有游离的羟基(-OH)。邓成华等27在虎奶菌碱溶性多糖的分离纯化及成分分析中，利用气相色谱法(GLC)测定多糖组成，凝胶渗透色谱法(GPC)测定相对分子质量，红外光谱法(FT-IR)测定糖苷键构型，高碘酸氧化及Smith降解确定糖基间连接方式。结果表明，虎奶菌碱溶性多糖为(13)-D-葡聚糖，并含1,6-连续支链。5 结语多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的研究和应用前景2。同时，随着目前对多糖的研究越来越全面深入，不断有新型多糖被发现，从提取纯化到结构分析乃至合成技术的发展日新月异，为人类更充分地认识利用多糖提供了有力的技术支持。以多糖为重点的糖工程研究可能是继蛋白质、基因工程后生物化学和分子生物学领域中的前沿科学，具有很大的潜力和发展空间。参考文献：1 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