（分析化学专业论文）基于纳米材料构建新型电流型免疫传感器的研究.pdf

， ，j h 。_ - 一 目录 剩 摘要i a b s l r a c t 一i i i 第一章绪言1 1 1 生物传感器概述一1 1 1 1 生物传感器简介1 1 1 2 生物传感器的原理1 1 ，1 3 生物传感器的发展2 1 1 4 生物传感器的种类2 1 2 电化学生物传感器的概述。3 1 2 1 电化学生物传感器简介一3 1 2 2 电化学生物传感器的分类3 1 2 3 电化学生物传感器发展方向3 1 3 纳米材料在生物传感器中的应用4 1 3 1 纳米材料的概念4 1 3 2 纳米材料的基本特性4 1 3 3 纳米材料在生物传感器中的应用5 1 4 聚苯胺的应用6 1 5 本论文研究思路6 第二章f e 3 0 4 交联聚苯胺纳米颗粒修饰的i t o 电极用于甲胎蛋白免疫传感器的研 究8 2 1 实验部分8 2 1 1 仪器与试剂8 2 1 2f e 3 0 4 p a n i 的制备9 2 1 3 修饰电极的制备9 2 1 4 测试方法与原理10 2 2 结果与讨论1 0 2 2 1 免疫传感器的电化学表征1 0 2 2 2 实验条件的优化1 1 2 3 免疫传感器的性能1 2 2 3 1 标准曲线1 2 2 3 2 选择性、重现性、稳定性和再生性的研究1 3 2 4 结论13 第三章纳米线与磁性纳米粒子构建信号放大的酶免疫传感器的研究1 4 3 1 实验部分1 5 3 3 1 仪器与试剂1 5 一 钿 6 3 1 2p b f e 3 0 4 的制备15 3 1 3a u c s p b f e 3 0 4 的制备1 6 3 1 4 固定h r p 和g o d 16 3 1 5 电极的制备1 6 3 1 6 实验测试1 7 3 2 结果与讨论18 3 2 1 金铂纳米阵列的表征1 8 3 2 2 传感器的电化学性质表征1 8 3 2 3 传感器的电化学性质表征1 9 3 3 实验条件的优化1 9 3 3 1 测试底液p h 的选择1 9 3 3 2 孵育时间的优化2 0 3 4 免疫传感器的性能2 0 3 4 1 免疫传感器对c e a 的响应性能2 0 3 4 2 免疫传感器的再生2 1 3 4 3 免疫传感器的稳定性2 1 3 5 结j 沧2 2 参考文献2 3 作者部分相关论文题录2 8 致访 2 9 两南大学硕十学伊论文摘要 基于纳米材料构建新型电流型 免疫传感器的研究 分析化学专业硕士研究生陈庆光 指导教师袁若教授 摘要 生物传感器是利用生物活性物质分子( 如酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生物膜、细胞 等) 识别的功能，将生化反应转变成可用输出信号，从而进行生命物质和化学物质检测和监控 的装置。电化学免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展起来的具有 快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传感器。最近几年，纳米技术开始应用于生 物传感器领域。纳米材料( n a n o m a t e r i a l s ) 具有大的比表面积、高的表面反应活性、好的生物相 容性等有点，被广泛地用作生物分子的固载基质，这样可以有效地增加生物分子的固载量同 时也可较好的保持其生物活性。因此，纳米材料( 如纳米粒子、纳米线，纳米管等) 被广泛应 用到生物传感器。基于这些原因，本文探索和研究以功能性或磁性纳米材料为同载机制的生 物免疫传感器测定。 本文的主要研究工作如下： 1 基于磁性纳米材料的免疫传感器的研究 设计了一种制备过程简单快速的传感器，具有较高的灵敏度高以及良好的选择性、重现 性和长期稳定性等优点，并可使用于其它免疫分子的检测。i t o 导电玻璃是在钠钙基或硅硼基 基片玻璃的基础上，利用磁控溅射的方法镀上一层氧化铟锡( 俗称1 1 o ) 膜加工制作成的。它 有导电性良好、便于修饰、适合加工、造价便宜等优点。利用磁性纳米粒子掺杂聚苯胺使其 具有了较为良好的导电能力的优点，将f e 3 0 4 聚苯胺( p a n i ) 复合纳米材料修饰于铟锡氧化 物( i t o ) 导电玻璃上研制出测定甲胎蛋白( a f p ) 含量的免疫传感器。通过交流阻抗和循环 伏安法对该免疫传感器的修饰过程进行了表征。结果表明，该免疫传感器的响应与a f p 的浓 度在l 1 2 0n g m l _ 范围内有良好的线性关系，相关系数为0 9 9 8 3 ，检测下限为0 6n g m l 叫 ( s n = 3 ) ，并具有良好的重现性和稳定性。 2 纳米线与磁性纳米粒子构建信号放大的酶免疫传感器的研究 构建了信号放大的c e a 免疫传感器。与传统方法相比，这一方法有三个明显的优势：首 先，使用聚碳酸酯( p c ) 膜作为空间阻隔物和疏导物沉积立体金纳米簇并以金硫纳米线吸附在 两南大学硕十学位论文 摘要 上面增强其三维结构，提供了大而清晰地表面积增加了电子传递的效率。其次，利用磁性纳 米的物理特性和纳米颗粒的表面优点，制备a u c s p b f e 3 0 4 作为标记物。最后将g o d 和h r p 两种酶标记到磁性纳米粒子上。在双酶多重催化放大的作用下，能再次增强电化学响应信号， 提高免疫传感器的灵敏度。从而制备出超灵敏、低成本、低的检测限、宽的线性范围的电流 型免疫传感器。结果表明，该免疫传感器测得的线性范围为0 0 5 2 0 0n g m l ，检测下限为 0 0 1 9n g m l 一。 关键词：免疫传感器壳聚糖磁性纳米材料金纳米簇 i i “ 两南大学硕十学伊论文a b s t r a c t s t u d i e so ne l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o r sb a s e do nn a n o m a t e r i a l sf o r l 一 -ll i i um a nc 1 1 0 r i o n i cg o n a a o t r o p h i n a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：q i n g g u a n gc h e n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rr u oy u a n a bs t r a c t ab i o s e n s o ri st h eu s eo fm o l e c u l a rb i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e s ( s u c ha se n z y m e s ， p r o t e i n s ，d n a ，a n t i b o d i e s ，a n t i g e n s ，m e m b r a n e ，c e l l ，e t c ) t oi d e n t i f yt h ef u n c t i o no ft h e b i o c h e m i c a lr e a c t i o n si n t ou s a b l eo u t p u ts i g n a l ，w h i c ht h el i v i n gm a t t e ra n dc h e m i c a l m a t t e rd e t e c t i o n d e v i c e s e l e c t r o c h e m i c a l l y b a s e di m m u n o s e n s o r sa r ev a l u a b l e a n a l y t i c a lt o o l sf o rm o n i t o r i n go f t h ea n t i b o d yo ra n t i g e na st h ea d v a n t a g e so fs h o r t r e s p o n s et i m e ，h i 曲s e n s i t i v i t y ，h i g hs p e c i f i c i t ya n de a s ym a n i p u l a t i o n , w h i c hc o m b i n e d t h em e r i t so fe l e c t r o c h e m i c a lt e c h n o l o g ya n di m m u n o a s s a y n a n o m a t e r i a l sa r eo f t e n u s e da st h es a t i s f a c t o r ym a t r i xf o rt h ei m m u n o s e n s o rb e c a u s eo ft h e i rl a r g es p e c i f i c s u r f a c ea r e a , f a v o r a b l eb i o c o m p a t i b i l i t ya n dh i g hs u r f a c er e a c t i o na c t i v i t y , w h i c hc o u l d i n c r e a s et h ea m o u n to fi m m o b i l i z e db i o m o l e c u l e sa n dk e e pt h e i r a c t i v i t y w e l l t h e r e f o r e ，n a n o m a t e r i a l s ( s u c ha sn a n o p a r t i c l e s ，n a n o t u b e s ，n a n o w i r e s ，e t c ) a r ew i d e l y a p p l i e dt ob i o l o g i c a ls e n s o r s b a s e do nt h ea b o v ec o n s i d e r a t i o n s ，t h i sa r t i c l ei sb a s e do n t h ea b o v e c o n s i d e r a t i o n s ，e x p l o r a t i o na n dr e s e a r c hi sb a s e do n as e r i e so fn a n o m a t e r i a l s ， b i o m o l e c u l e sa st h ec a r r i e ro ff i x e dm e t h o d s t h em 2 l i nr e s e a r c hw o r ka lea sf o l l o w s ： 1 i n v e s t i g a t e dt h ei m m u n o s e n s o r sb a s e d o nt h em a g n e t i cn a n o p h a s em a t e r i a l s d e s i g n e das i m p l ea n dr a p i dp r e p a r a t i o no fs e n s o r sw i 廿1h i 曲s e n s i t i v i t ya n dg o o d s e l e c t i v i t y ，r e p r o d u c i b i l i t ya n dl o n g t e r ms t a b i l i t y ，e t c ，c a nb eu s e di nt h ed e t e c t i o no f o t h e ri m m u n em o l e c u l e s an o v e ld i s p o s a b l ei m m u n s e n s o ra p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o n o f 仅- 1 - f e t o p r o t e i n ( a f p ) h a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ei m m o b i l i z a t i o na n t i 一仅一1 - f e t o p r o t e i n ( a n t i a f p ) t o t h ef e a 0 4 - c r o s s - l i n k e d p o l y a n i l i n en a n o c o m p o s i t e ( f e 3 0 4 一p a n i ) m o d i f i e do ni n d i u mt i n o x i d e ( i t o ) c o n d u c t i v eg l a s sd e v e l o p e d m e a s u r e d i i i a 1 f e t o p r o t e i n ( a n t i a f p ) l e v e l so fi m m u n es e n s o r s t h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r s a n dm o d i f i e dp r o c e d u r eo ft h ei m m u n o s e n s o rw e r ec h a r a c t e r i z e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， t h ei m m u n o s e n s o rd i s p l a y e dh i g hs e n s i t i v et oa f pw i t hal i n e a rr a n g ef r o m1a n d12 0 n g m l 1 w i t hac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 8 3 ，a n dt h el o wd e t e c t i o nl i m i to f0 6 n g m l ( s n = 3 ) 2 e l e c t r o c h e m i c a l l yd e p o s i t e dn a n o e o m p o s i t eo fc a r b o nn a n o t u b e sa n d e h i t o s a n f o rd e t e c t i o no fh u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n c o n s t r u c t i o no ft h es i g n a la m p l i f i c a t i o no fc e ai m m u n o s e n s o r c o m p a r e dw i t h t r a d i t i o n a lm e t h o d s ，t h i sm e t h o dh a st h r e eo b v i o u sa d v a n t a g e s ：f i r s t ，t h eu s eo f p o l y c a r b o n a t e ( p c ) f i l ma s ab a r r i e rm a t e r i a la n dg r o o m i n gs p a c ed e p o s i t i o no f t h r e e d i m e n s i o n a lg o l dc l u s t e r sa n dn a n o w i r e so fg o l da d s o r p t i o no fs u l f u rt oe n h a n c e i t st h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r ei nt h ea b o v ep r o v i d e sal a r g es u r f a c ea r e aa n dc l e a rt h e e f f i c i e n c yo f e l e c t r o nt r a n s f e ri n c r e a s e s s e c o n d l y , t h ep r e p a r a t i o no fa u c s - p b f e 3 0 4 a sam a r k e ro ft h ep h y s i c a lp r o p e r t i e so fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa n dn a n o p a r t i c l e so n t h es u r f a c ea d v a n t a g e s f i n a l l y , b o t hg o da n dh r pe n z y m e st om a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s l a b e l e d i nt h et w oe n z y m e su n d e rt h ee f f e c to fm u l t i p l ec a t a l y t i ca m p l i f i c a t i o nc a n e n h a n c et h ee l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s es i g n a la g a i nt oi m p r o v et h es e n s i t i v i t y o f i m m u n o s e n s o r p r e p a r a t i o no fs u r p l u sw h i c hi ss e n s i t i v e ，l o w c o s t ，l o wd e t e c t i o nl i m i t s ， 、耐( 1 el i n e a rr a n g eo fc u r r e n ti m m u n o s e n s o lu n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h i sa p p r o a c h p r o v i d e dad e t e c t i o nl i m i to f0 019n g m l 。1a n dt h el i n e a rr a n g ec o v e r e df r o m0 0 5t o 2 0 0n g m l k e y w o r d s ：l m m u n o s e n s o r s ；c h i t o s a n ；m a g n e t i cn a n o p h a s em a t e r i a l s ；a u n a n o p r i c k l ec l u s t e r s i v 两南大学硕十学何论文第一苹 第一章绪言 1 1 生物传感器概述 1 1 1 生物传感器简介 生物传感器是2 0 世纪7 0 年代中期发展起来的一个多学科交叉并相互渗透的 产物，包括了由电生物学，分析化学，医学，物理学，电子技术等多种学科。经 过3 0 多年的发展，己经成为充满创新活力的和潜在应用前景的研究领域。它与生 物芯片、生物信息学、生物控制论、仿生电化学( 仿生燃料电池、仿生计算机) 等学科一起，构成生物电化学这门新学科【l j 。它与传统的分析检测手段相比，具有 设备简单、灵敏度高、选择性好、体积小、操作简易、相应快、成本低、是直接 获取体系中组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物、医药、医学、临 床检测、食品卫生、环境检测等领域得到实际应用【2 。2 1 世纪是生命科学的时代， 随着纳米技术、生物科学和信息科学的发展成果在生物传感器上的应用，生物传 感器技术将有巨大改变。 1 1 2 生物传感器的原理 生物传感器是通过利用一种能与换能元件在空间上直接接触的生物识别元件 提供特殊的定量或半定量的分析信息，来检测或计量化合物的综合装置。由分子 识别元件( 感受器) 与信号转换器( 换能器) 相结合而构成，感受器主要包括抗原、 抗体、核酸、酶、细胞、动植物组织切片、微生物等具有分子识别能力的生物活 性物质，用作分子识别元件，结合待测物，提供有关待测物质浓度的信息【8 ，9 】。换 能器即基础电极或内敏感器，是一个电化学或光化学检测元件，如电极( 离子选择 性电极、固体电极等) 、光敏二极管、热敏电阻器、离子敏或化学敏场效应晶体管、 压电石英体、光导纤维及表面等离子共振器等构成【l o 】。当待测物质经过感受器时， 发生生物化学反应，产生的信息被相应的化学或物理换能器转变成可处理的电信 号，通过电子系统处理和显示，实现对待测物质的检测】。其基本构成及工作原 理如图l 所示。 i 待； 1 测时 i 物i 信号转换器 电化学电极 热敏电阻 光敏管 场效应管 压电石英体 表面等离子共振 器 图1 1 生物传感器示意图 i 信； 号； ；处； l 理l 西南大学硕十学伊论文第一章 1 1 3 生物传感器的发展 1 9 2 1 年，h e y r o v s k y 创立极谱学，这是电分析化学发展的里程碑【l2 1 。2 0 世纪 4 0 年代，酶开始用作分析试剂来检测底物为有机物的特定物质。隔离式氧电极于 1 9 5 6 年c l a r k 把电极过程与主体溶液利用硅橡胶膜等合成膜隔离开而成功制备【l3 1 。 生物传感器始于1 9 6 2 年c l a r k 在纽约科学院会议上的演讲。这次报告中，c l a r k 和 l y o n s 创造了酶电极( e n z y m e e l e e t r o d e ) 这个术语，并且提出了将电极和酶组合起来 的检测原理【川。1 9 6 7 年，基于c l a r k 和l y o n s 的这个设想，u p d i k esj 和h i c k s gp 首次将葡萄糖氧化酶在聚丙烯酞胺凝胶中固定化，把胶体膜固定在隔膜氧电 极的尖端上，制备出第一支葡萄糖生物传感器，标志着以氧为中继体的第一代生 物传感器诞生【1 5 】。由于多数酶来自微生物或动植物组织，提纯困难，价格昂贵， 并且酶电极的寿命一般比较短，因此2 0 世纪7 0 年代中期，人们开始研究酶电极 的衍生物：免疫电极( 1 9 7 5 年研制出) 、微生物电极( 同样诞生于1 9 7 5 年) 、电位型 微生物传感器( 出现于1 9 7 7 年) 、1 9 7 8 年和1 9 8 0 年，动植物组织传感器和线粒体 传感器出现。此后随着生物学、化学、物理学、医学、电子技术等学科的快速突 破，生物传感器的种类越来越爹1 6 珈】。 到现在为止，生物传感器大约经历了三个发展阶段【2 l 】：第一阶段在上世纪6 0 到7 0 年代，是用固定化生物非活性基质膜( 反应膜或透析膜) 和电化学电极( 氧电极 或p h 电极) 组成。第二阶段在上世纪7 0 年代末期到8 0 年代，主要将生物成分直 接吸附或共价结合到转换器的表面，不再用非活性的基质膜。同时，基于不同技 术和原理的其他生物传感器也陆续出现；如细胞器传感器、酶免疫传感器、压电 生物传感器及微生物传感器等。第三阶段是在上世纪9 0 年代以后，生物分子直接 固定在电子元件上相对容易地进行电子传递，能直接感知和放大界面物质的变化， 只对特定反应起作用，可以把生物识别与信号的转换处理结合在一起。微流控技 术、生物芯片技术、纳米材料的突破和应用也给生物传感器的发展注入了新的活 力。 1 1 4 生物传感器的种类 根据分子识别元件的不同，可将生物传感器分为：免疫传感器( i m m u n o l s e n s o r ) ， 酶传感器( e n z y m es e n s o r ) ，脱氧核糖核酸传感器( d n as e n s o r ) ，微生物传感器 ( m i c r o b i a js e n s o r ) ，分子印迹生物传感器( ( m o l e c u l a ri m p r i n t e db i o s e n s o r ) ，组织传感 器( t i s s u es e n s o r ) 和细胞传感器( o r g a n e l l es e n s o r ) 等【2 引。根据换能器即信号转换器又 可将其分为电化学生物传感器( e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ) ，声波生物传感器( a c o u s t i c w a v eb i o s e n s o r ) ，半导体生物传感器( s e m i c o n d u c tb i o s e n s o r ) ，热生物传感器 ( c a l o r i m e t r i cb i o s e n s o r ) ，光生物传感器( o p f i c mb i o s e n s o r ) 和压电晶体生物传感器 2 两南大学硕十学位论文第一章 ( p i e z o e l e c t r i cb i o s e n s o r ) 等。按照生物敏感物质相互作用的类型分类，可分为亲和型 和代谢型2 种。 1 2 电化学生物传感器的概述 1 2 1 电化学生物传感器简介 电化学免疫传感器以抗原( a n t i g e n ，a g ) 或抗体( a n t i b o d y , a b ) 作为分子识别元 件，将免疫分析与电化学分析方法相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于 测量免疫反应前后发生的电流或电势变化。由于以生物材料作为敏感元件，所以既 具有生物传感器快速、灵敏、高度选择性等特点，又具有免疫分析的高特异性、 构制敏感电极方法灵活和稳定性好等优势。传统免疫测试法只能半定量或定性地 判断，一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实时监测，而且所用时间较 长。而免疫传感器将生物传感技术和传统免疫分析技术融为一体，将抗原( 或抗 体) 固定在固相支持物基体上，用精密换能器把产生的化学或物理上的变化数字 化，转变成可检测信号来达到定量检测的效果，减少了分析时间。抗原与抗体反 应的特异性和敏感性，提高了检测的灵敏度和测试精度【2 3 】。因此，电化学免疫传 感器已经成为当前研究的热点课题之一。 1 2 2 电化学生物传感器的分类 根据测定过程是否使用标记物分为间接型( 标记型) 电化学免疫传感器和直 接型( 非标记型) 电化学免疫传感器。间接电化学免疫传感器主要包括以电活性 物质为标记物的非酶标记电化学免疫传感器以及电化学酶联免疫传感器。电流型 酶标免疫传感器的检测原理主要有竞争法和夹心法两种。 根据生物材料固定或修饰到电极上的方法不同，可以集中分为l b 膜法传感器、 化学免疫法传感器、自组装膜法传感器、共价键结合法传感器、表面富集法传感 器、静电吸附结合法传感器等【2 4 ，2 5 1 。 1 2 3 电化学生物传感器发展方向 电化学免疫分析的开端是r a d c l i f f 和b r e y e r 于1 9 5 1 年首次用极谱方法检测了 由偶氮标记的抗原【2 引。1 9 5 9 年美国科学家b e r s o n 和y a l l o w 通过测定胰岛素发表 了抗体感受抗原反应的理论【2 7 1 。之后免疫检测技术开始广泛应用于生物检测分析， 电化学生物传感器也得到了迅速发展。 相对于其他类型的免疫传感器，电流型免疫传感器代表了生物传感中比较发 达的领域，具有持久和广阔的发展空间。以其灵敏度高、检测线低等优势。电流 型免疫传感器是在恒定电压情况下监测由于抗原抗体结合或继后反应中根据产生 的氧化还原信号电流的变化。通过转换器产生的电流，可以直接测量电子转移反 两南大学硕十学位论文第一苹 应的速度，它反映了生物分子识别的速度，即该电流正比于待测物质的浓度。到 目前为止，电流型免疫传感器已经应用于多种物质监钡1 2 3 2 8 】，但仍在研究和寻找 更合适的固定方法与固定材料，探求更加灵敏、稳定的标记体系和电活性物质， 追求更便利的无标记方法，从而获得更完美的信号检测系统。 主要体现在( 1 ) 标记物的种类层出不穷，从多种酶( 如：h r p 、g o d 、a l p 等) 、 电活性物质( 如：二茂铁的衍生物) 、胶体金、胶乳颗粒、金属离子和磁性颗粒等 2 9 - 3 1 】；( 2 ) 向微型化、阵列化、多组分化方向发展；( 3 ) 电化学响应信号增强的技术 研究应用，底物循环放大的信号增强、酶联级多重催化信号增强、亲和素生物素 信号增强、脂质体标记物信号增强、与p c r 技术联用的信号增强【3 2 - 3 5 1 ；( 4 ) 设计新 颖免疫分子固定界面，提高传感器灵敏度和使用寿命。( 5 ) 与计算机等联用，向智 能型、操作自动化、适用化方向发展；( 6 ) 应用范围日渐扩大，逐渐深入到环境监 测、临床诊断和食品卫生工业等领域。 1 3 纳米材料在生物传感器中的应用 1 3 1 纳米材料的概念 纳米材料的概念于德国萨尔兰大学的学者g l e i t e rh 在1 9 8 1 年首次提出，泛 指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度( 1 1 0 0n m ) 范围。1 9 9 0 年7 月在美 国召开的第一届国际纳米科学技术会议，正式宣布纳米材料科学为材料科学的一 个新分支【3 6 1 。现在纳米材料包含的内容更加丰富，国际上将处于1 1 0 0n n l 纳米 尺度范围内i ”j 的超细颗粒所组成的固体材料，以及由纳米微晶( 包括微粒尺寸、晶 粒尺寸、晶界宽度、气孔尺寸、缺陷尺寸、第二相分布等) 所构成的材料，统称为 纳米材料。纳米材料从根本上改变了材料的结构，架起了微观与宏观世界之间的 桥梁。纳米材料的制备按原料状态分为三大类：固相法、液相法和气相法。 1 3 2 纳米材料的基本特性 纳米粒子又叫超微颗粒，一般是指在l 1 0 0 n m 的纳米材料尺寸范围内，其尺 度恰好处在原子簇、分子为代表的微观世界和宏观物体的交接区域，这样的系统 既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，是一种典型的介观系统。当一种材料 的结构进入纳米尺度特征范围时，其某个或某些性能会发生显着的变化。纳米尺 度和性能的特异变化是纳米材料必须同时具备的两个基本特征。纳米微粒由于粒 子表面能和表面张力随粒径减小而增加，导致非键电子对的排斥力降低等，这些 结构特性必然引起颗粒内部特别是表面层晶格的畸变，造成许多特殊的性质。它 具有小尺寸效应( 体积效应) 、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应【3 8 , 3 9 1 。 这四种效应是纳米材料的基本特性，也是常规材料与有纳米材料很大差异的根本 4 两南入学硕十学何论文第一章 原因 4 0 1 。 1 3 3 纳米材料在生物传感器中的应用 由于纳米材料在结构上具有的大比表面、独特的热学、力学、电学、磁学、 化学、光学和异相催化特性，吸引了越来越多的科学家对它进行研究。目前，随 着纳米材料的不断发展，给纳米生物传感器的制备和应用带来了突破性进展。纳 米材料的研究目前集中在纳米集成阵列、介孔组装、探针技术、薄膜嵌镶、电极 表面修饰等方面。其中纳米颗粒在生物传感器中应用非常广泛，可分为两类： 一、纳米颗粒用作固定载体：纳米粒子具有较高的比表面积，用于生物分子 固定可以加快电子传递，增强电极导电性，提高生物蛋白分子的固定量，增强响 应信号，提高传感器响应速度，增强传感器灵敏度和稳定性等优点；同时纳米颗 粒具有一定的生物相容性，能使生物分子较稳定地存在。 纳米金颗粒比表面积大，表面自由能高，吸附能力强，催化效率高，具有良 好的生物相容性，良好的导电性。常用于固载和标记生物蛋白质。 y i n gz h u o 等【4 2 】报道了以n a t i o n ，硫堇，纳米金修饰金电极测定甲胎蛋白的免 疫传感器( 图1 2 ) 。纳米金是电的良好导体，能加快电子传递，使电极导电性增加； 纳米金良好的生物相容性能很好地保持抗体的生物活性；且纳米金比表面积高， 吸附能力强，能提高抗体在电极表面的固定量，使免疫传感器的灵敏度提高。 缸e l e t a r o d e n 硷o n2 - _ _ _ _ - _ - _ - - _ - _ _ _ - a o ( h a l o 洳) - h 私取融秘3 ( t k o m e ) b 图1 2n a f i o n = 硫堇纳米金修饰的甲胎蛋白免疫传感器的制备过程示意图 二、纳米颗粒用于生物分子的标记：在蛋白质上直接标记酶，由于酶的负载 量有限，限制了传感器灵敏度的提高。纳米粒子用来标记生物分子，可以实现信 号放大，被广泛地应用于扫描电子显微镜( s e m ) 表征、透射电子显微镜( t e m ) ，电 化学检测、光学检测等。 v i g n e s h w a r a nm a n i 等m 3 j 制备了以直径为ll x m 的磁珠，利用该纳米颗粒负载约 5 酋 两南大学硕十学伊论文第一章 7 5 0 0h r p 酶蛋白分子，标记了二抗蛋白的磁性耦合物( 图1 2 6 ) 。对p s a 抗原通过夹 心免疫模式进行检测，磁性纳米颗粒大大增加对标记的h r p 的固定量，在适量底 物h 2 0 2 存在的条件下，该免疫传感器携带的大量h r p 能提高催化效率，电化学响 应信号显著增强。该检测p s a 抗原的方法极大的提高了传感器的灵敏度与检测限。 臼r i 删舭鼬v 触 v o l t a g e + h 拍2 s i g n a l 图1 3 基于多酶催化的电流型免疫传感器响应原理示意图 1 4 聚苯胺的应用 在生物传感器的发展中，由于导电聚合物具有抗干扰能力强、合成的灵活性、 性质的多样性以及结构的预设性，使其得到广泛的应用。作为导电聚合物家族的 重要成员之一，聚苯胺除了具有其他聚合物共有的特点外，还具有独特的掺杂行 为，良好导电性能和良好的电化学可逆性，再加上原料易得、合成方法简单，己 经在许多领域中得到广泛的研究和运用。例如：光存储器、导电橡胶、导电粘结 剂、磁性记录材料、电磁屏蔽、显示器件、气体隔离材料、防腐涂层以及传感器 的制备【4 4 4 6 1 。而纳米结构的聚苯胺( 如纳米球、纳米管、纳米线、纳米纤维【4 7 4 9 】由 于其在导电性、磁性能和气体传感性等方面有较好的提高，同时还兼有生物兼容 性好、比表面积大等特点，开始在免疫传感器的修饰中发挥越来越多的作用 5 0 , 5 1 】。 1 5 本论文研究思路 本文在最新的文献报道基础上，利用化学还原、电聚合、电沉积的方式合成 和构建纳米材料，在电极表面创建纳米基质。利用i t o 导电玻璃和f e 3 0 4 p a n i 的 优点，制成新的稳定的传感器。采用独特的纳米材料，根据电沉积金纳米簇的玻 碳电极而制的新颖的安培计式的免疫传感器，它是由一种有效的抗体固定基质构 成，具有高的稳定性和生物活性。并且通过夹心免疫测定法提高了灵敏度和选择 性。主要研究工作如下： 1 、基于f e 3 0 4 和i t o 导电玻璃的特性，制备了f e 3 0 4 一p a n i 复合纳米材料， 并将其滴涂于i t o 电极表面用于固定a n t i a f p ，研制了一种新型的高灵敏的a f p 6 阳南大学硕十学何论文第一章 免疫传感器。该传感器制备过程简单快速，具有较高的灵敏度以及良好的选择性、 重现性和长期稳定性等优点，并可使用于其它免疫分子的检测。 2 、希望构建一种信号放大的c e a 免疫传感器。与传统方法相比，这一方法 有三个明显的优势：首先，利用p c 薄膜电沉积立体金纳米簇并以金硫纳米线吸附 在上面增强其三维结构，提供了大而清晰地表面积增加了电子传递的效率。其次， 利用磁性纳米的物理特性和纳米颗粒的表面优点，制备a u c s p b f e 3 0 4 作为标记 物。最后将g o d 和h r p 两种酶标记到磁性纳米粒子上。在双酶多重催化放大的 作用下，能再次增强电化学响应信号，提高免疫传感器的灵敏度。从而制备出超 灵敏、低成本、低的检测限、宽的线性范围的电流型免疫传感器。 7 两南大学硕十毕业论文第二辛 第二章f e 3 0 4 交联聚苯胺纳米颗粒修饰的i t o 电极用于甲胎 蛋白免疫传感器的研究 电化学免疫传感器是将电化学分析方法、免疫识别技术和传感器技术相结合 的一种兼具三种体系优点的分析方法，是基于测量电流、电位变化来进行免疫分 析的生物传感器。与酶联免疫吸附分析法( e l i s a ) 、放射免疫测定法( r j a ) 等 检测技术相比，具有专一性强、灵敏度高、检测快速和便于携带的优势 5 2 - 5 6 】。因 此电化学方法在多种免疫检测中被广泛使用 5 7 - 6 2 】。纳米材料具有高的比表面积以 及优良的化学和物理性能，外部条件的变化会引起表面和界面电子传递或粒子价 态的改变，而且灵敏度高、响应快。其中，功能复合纳米材料可表现出各种单质 材料的协同效应，并具有可设计性、良好的稳定性及其表面易基团功能化等特点， 适于生物传感器敏感界面的构建。 聚苯胺( p a n i ) 是一种容易吸附在i t o 电极表面的聚合物。通常情况下，该 聚合物具有较高的电化学阻抗，从而制约了其在电化学中的应用。而通过代替、 共聚，合成和掺杂等方法【6 3 。6 7 1 提高聚苯胺的电化学性质。该文通过将f e 3 0 4 纳米 颗粒与聚苯胺纳米材料交联制得复合纳米材料( f e 3 0 4 p a n i ) ，并将其固载到i t o 电极表面用于免疫传感器的研究。制得的传感器具有较低电化学阻抗和较高的稳 定性。本文采用循环伏安法和交流阻抗对该传感器的制备过程进行表征，并研究 其对不同浓度a f p 的响应。结果表明，该传感器具有稳定性高、灵敏度好以及特 异性强等优点，且制作简单，有望用于实际样品的分析。 2 1 实验部分 2 1 1 仪器与试剂 电化学工作站( c h l 6 1 0 b 型，上海c hi n s t r u m e n t s 公司) ，b r a n s o n i c2 0 0 超 声清洗仪( 德国b r a n s o nu l t r a s c h a l l 公司) ，i m 6 e 型交流阻抗测试系统( 德 国z a h n e re l e k t r i k 公司) ，i t o 导电玻璃购买自深圳莱宝有限公司。超级数 显恒温器( c s5 0 1 一s p 型，重庆四达实验仪器厂制造) 。采用三电极体系进行，即不 同修饰的i t o 导电