（分析化学专业论文）生物分子叶酸和尿酸电化学和电分析化学研究.pdf

郑州大学硕：l ：研究生毕业论文张娟 全文摘要 生物分子的电化学分析方法及其电化学性质的研究，由于其在生命科学 中的重要地位而受到普遍重视。而目前的医学发展对分析化学提出了更高的 目标在线分析。实现在线分析的前提就是电极的微型化和测定方法的高 灵敏度。本论文利用吸附预富集结合高灵敏度的示差脉冲技术，大大提高了 叶酸和尿酸测定的灵敏度，在大量抗坏血酸存在下用恒电位活化的碳纤维电 极测定了尿样及血样中的尿酸。并且在活化后的碳纤维微电极上修饰聚甘氨 酸薄膜，修饰后的微电极能同时测定血样和尿样中的抗坏血酸和尿酸，这对 实现生物分子的在体测定具有重要意义。本论文主要内容包括以下几个方 面。 1 、利用叶酸分子在汞电极上的吸附性，采用在适当电位预富集的方法 与示差脉冲结合，建立了测定痕量叶酸的电化学分析方法。在不富集的实验 条件下，差示峰电流与叶酸浓度在3 3 9 1 0 一m o l l - - 3 7 3 1 0 1 m o l l 范围 内呈良好线性关系：而在- 0 2 5 v 电位吸附富集7 0 s 条件下，其线性范围为 6 7 8 1 0 叫o m o l l - - 一2 7 2 1 0 一m o l l ，检测限达1 0 1 0 叫m o l l 。方法具有快 速、简便、灵敏度高、干扰少的优点。将该方法应用于小米和玉米中微量和 痕量叶酸的测定，结果满意，回收率在9 4 1 0 2 之间。 2 、利用差示脉冲伏安研究了尿酸在碳纤维微电极上的电化学反应，建 立了对应的d p v 法检测尿酸的分析方法。将自制的碳纤维微电极经过特定 的电化学方法活化，活化后的电极对尿酸有近可逆的响应。借助于差示脉 冲伏安技术的高分辨率优点，可在高浓度抗坏血酸存在下准确测定尿酸浓度， 在不富集情况下，测定尿酸的线性范围为6 6 7 x1 0 。7m o l l 7 3 0 1 0 。6 m o l l ，检测下限为2 x1 0 一m o l l ；吸附富集7 0 s ，其线性范围为6 7 0 1 0 m o l l 8 6 7 1 0 qm o l 几，检测下限为2 1 0 一 m o l l 将该方法应用尿样中尿 酸含量的测定结果满意，可望用于在线检测。另外，利用多种电化学技术研 究了尿酸在电极上反应的动力学参数。 3 、研究了聚甘氨酸修饰碳纤维微电极的电化学性质和同时测定尿酸和 抗坏血酸的分析方法。并研究了尿酸在该聚合膜电极上反应的动力学参数。 在选定的条件下，尿酸和抗坏血酸的峰电位分别为0 3 3 v 和o 0 3 v 两峰电位 差达3 0 0 m v , 可以实现两者的同时测定。将建立的方法应用于尿样和血样 中尿酸和抗坏血酸的测定，结果满意。该膜对五羟色胺、酪氨酸、色氨酸和 组氨酸等均有良好电流响应。 a b s t r a c t i ti sv e r yi m p o r t a n tf o rt h er e s e a r c ho fb i o m o l e c u l e si ne l e e t r o c h e m i c a i p r o p e r t i e sa n de l e c t r o a n a l y t i c a lm e t h o d s m o r er e c e n t l y , ah i g h e rr e q u i r e m e n t ，i n s i t ua n a l y s i s i sp u ti nf a c ef o re l e c t r o a n a l y s t t h ef i r s to fa l lf o ri ns i t ua n a l y s i s i st h em i c r o e l e c t r o d eu s e da n dh i g hs e n s i t i v i t ym e t h o d s i nt h i st h e s i s ，w eh a v e r e s e a r c h e dn e wm e t h o d so f d e t e r m i n a t i o n sf o rf o l i ca n du r i ca c i d si nh i 曲 s e n s i t i v i t yb yc o m b i n i n gb o t ha d s o r p t i v ep r e c o n c e n t r a t i o na n dd i f f e r e n tp u l s e v o l t a m m e t r yt e c h n i q u e t h e r ea r et h r e ep a r t si nt h i st h e s i s ： 1 i nt h i se h a p t e r ，w ei n v e s t i g a t e da b o u td e t e r m i n i n go ft r a c ef o i i ca c i di n f o o d s t u f fb yd i f f e r e n tp u l s ev o l t a m m e t r y i nb rb u f f e rs o l u t i o n ( p h6 5 9 ) ，t h e f o l i ca c i dw a sa d s o r b e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ef o rp r e e o n c e n t r a t i o na n dt h a l lt h e d i f f e r e n tp u l s es t r i p p i n gs c a nw a sp e r f o r m e d t h ep e a kc u r r e n t sa r el i n e a r r e l a t i o n s h i pw i m f o i i ca c i dc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g e so f3 3 9x 10 一m o l l - - , 3 7 3 x1 0 7 m o l lw i t hn o n p r e c o n c e n t r a t i o na n d6 7 8x1 0 - 1 0 t o o i l 2 7 2x1 0 o 儿 w i t hp r e c o n c e n t r a t i o nf o r7 0 s t h ed e t e c t e dl i m i ti su pt o1 0 10 叫1 m o l l t h i s m e t h o dw a su s e di nd e t e r m i n i n go ft r a c ef o l i ea c i di nf o o d s t u f fw i t hs a t i s f a c t o r y r e s u l t s 2 t h eu r i ca c i di si n v e s t i g a t e db vd i f f e r e n tp u l s ev o l t a m m e t r ya tc a r b o n f i b e rm i c r o e l e c t r o d e ( c f m e ) ，w h i c hi sm a d eb yu s t h ec f m ei se l e c t r o a c t i v e b yaf i x e dm e t h o da n di tc a nb eu s e df o rd e t e r m i n i n gu r i ca c i di nt h ep r e s e n c eo f h i g hc o n c e n t r a t i o na s c o r b i ca c i d t h ep e a kc u r r e n t sa r el i n e a rr e l a t i o n s h i pw i m u r i ca c i dc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g e so f6 6 7 10 - v m o l l - - 7 3 0 10 。0 m o l lw i t h d e t e c t e dl i m i to f2x10 - v m o l lf o rn op r e c o n c e n t r a t i o na n d6 7 0x10 喝m o i l 8 6 7x 10 m o l lw i t hd e t e c t e dl i m i to f2x1o - s m o l lf o rp r e c o n c e n t r a t i o n7 0 s t h i sm e t h o dw a su s e di nd e t e r m i n i n go ft r a c eu r i ca c i di nu r i n ew i t hs a t i s f a c t o r y r e s u l t s 3 w bf o u n dt h a tg l y c i n ec o u l db ep o l y m e r i z e de l e c t r o c h e m i c a l l ya tc a r b o n f i b e rm i c r o e l e c t r o d es u r f a c e t h ep o l y - g l y c i n ef i l mm o d i f i e de l e c t r o d e sp o s s e s s h i g hs t a b i l i t ya n dg o o de l e c t r oc a t a l y t i ca c t i v ef o ru r i ca c i d a tt h i se l e c t r o d e ，t h e d e a kp o t e n t i a l so fu r i ca c i da n da s c o r b i ca c i da r e0 3 3 va n d0 0 3 vr e s p e c t i v e l y t h i sm e a n st h a tb o t ho ft h e mc o u l db ed e t e r m i n e ds i m u l t a n e o u s l y b a s e do nt h i s p o i n t ，w eh a v ee s t a b l i s h e dam e t h o df o rs i m u l t a n e o u s l yd e t e r m i n i n gu r i ca c i da n d a s c o r b i ca c i d t 1 1 i sm e t h o dw a su s e di nd e t e r m i n i n go ft r a c eu r i ca c i da n d a s c o r b i ca c i di nu r i n ea n ds e r u ms a m p l e sw i t hs a t i s f a l c t o r yr e s u l t s i i 第一章 绪论张娟 第一章绪论 1 1 叶酸分子的生物功能 叶酸是一个在自然界广泛存在的维生素之一，维生素b 6 ( v b 6 ) ，因为在绿叶中含 量丰富，故名叶酸。自1 9 4 2 年s t o k s t a d 首次成功合成了叶酸以来，叶酸一直是学术界 研究的热点物质。叶酸分子是由蝶呤啶，对氨基苯酸与l _ 一谷氨酸连接而成的，其结构 式如下： 曰 一c 一n c h c h 2 - c h 2 一c o o h b h o o n 叶酸是一组化学结构极其相似，生化特性相近的化合物的总称。食物中的叶酸大多 数是以喋酰多谷氨酸的形式存在的，使食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰谷氨酸水解 酶的作用，水解为喋酰单谷氨酸后吸收，水解后的单谷氨叶酸( p t e g l u ) 部分转变为 多谷氨酸叶酸，在肝脏，细胞及其它组织中储存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分 布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。 在肠壁、肝、骨髓等组织中的叶酸还原酶所促进下，叶酸加氢生成还原产物一5 6 7 8 一四氢叶酸( t h f a 或f h 4 ) 四氢叶酸是转一碳基因酶系的辅酶，可参与多种反应。 它是甲基、亚甲基、甲酰基、甲川基等的载体，因而可形成各种四氢叶酸的衍生物。 四氢叶酸在代谢中起着重要的作用，其主要生理功能如下： ( 一) n ，n 1 0 亚甲基四氢叶酸作为弧甲基的载体，使甘氨酸转变成丝氨酸。 ( 二) n 1 0 甲酰四氢叶酸作为甲酰基的载体，在转甲酰酶的作用下，参与嘌呤环的 合成，形成环中卜2 0 作为甲川基的载体n 工m 甲川基四氢叶酸也参与嘌呤环 的合成。 ( 三) n 5 ，n 阳亚甲基四氢叶酸通过皿甲基的转移，使脱氧尿营酸转变为胸苷酸。 ( 四) n 甲基四氢叶酸，通过转甲基酶作用，使高半胱氨酸转变为甲硫氨酸。 由于叶酸参与嘌吟、嘧啶的合成，同时也影响到蛋白质的生物合成，冈此叶酸对予 正常红细胞的形成有促进作用。叶酸在细胞核的d n a 合成过程中是重要的辅酶，其缺 乏或代谢紊乱则导致d n a 的合成发生障碍，影响造血_ 功能在骨髓的增殖，造成巨红细 胞性贫血症。人体内叶酸的含量水平，与健康息息相关，而其时酸主要来源于摄入的食 品。因此，人体及其食物中叶酸的检测方法研究有着重要的意义。 1 2 叶酸的分析方法现状 近年来，叶酸的常用分析方法有分光光度法f i j 色谱法【2 】，毛细管电泳法【3 1 ，荧光 n h h c h 一 纱 n n c l c n c ，) “ c l n n 第一章 绪论张娟 光谱法 4 】和电化学法，其中运用最多的是色谱法，特别是高效液相色谱法。叶酸测定的 光化学法较少，且多为前期的报道。自六十年代以来，微生物学法一直被认为是测定生 物标本中微量叶酸最有用的方法，但9 0 年代以来，叶酸的电化学分析方法有了一些进 展，现将叶酸的各种方法简述如下： 1 2 1微生物法 微生物法是检验生物体内叶酸的经典方法。通常所用的微生物有干酪乳酸杆菌，粪 链球菌和啤酒小球菌，此三种微生物对不同的叶酸形式敏感度( 灵敏度) 不同。粪链 球菌只对非甲基化叶酸敏感，如单谷氨酸叶酸( p t e g l u ) 、二氢叶酸( d h f ) 和四氢叶 酸( t h f ) ，可以分别检测各种形式叶酸在不同生物样品中的分布，此法为试管法，它 灵敏度高，结果准确，但操作繁杂，有许多局限性，例如整个实验周期较长，批间的检 测结果重复性较差，检测结果容易受含抗叶酸药物或抗生素成份的影响等。 1 2 2 同位素放射免疫法： 尽管微生物法得到了不断改进，但是因为其费时，繁杂而不能得到广泛的应用，2 0 世纪7 0 年代，就已经提出了血清中叶酸的放射免疫法。该方法具有快速、简便的特点， 同时由于叶酸放射免疫试剂盒的出现，使该方法得到迅速普及，并广泛用于临床医学中。 但其对多谷氨酸叶酸反应的相对灵敏度有较大的差别，因而利用该法难以得到准确的叶 酸含量。 1 2 3色谱法 早在2 0 世纪7 0 年代，色谱分析法( 包括高效离子交换层析，离子对分配层析和高 效液相色谱) 就已经开始用于分离提取各种形式的叶酸，但由于当时检测器的灵敏度较 低，因此只有将其先分离再用微生物法检测。目前而言，h p i c 一电化学检测方法比紫 外和荧光法的灵敏度高1 4 个数量级。该方法可用于人类、大鼠等多种生物样品中叶 酸的检测。1 9 9 5 年，s a n t b o s hk u m a r 等p 埂出了用气相色谱质谱法检测红细胞 中的叶酸含量，该方法选择性好灵敏度高。而且结果准确。 1 2 4离子捕获法 1 9 9 5 年，w i l s o n 等【6 1 提出了离子捕获法检n r d - 酸。即在实验中，样品中加入变性剂 后，叶酸与内源性且反分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成 产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与喋酸结合物对叶酸结 合蛋白上游离结合位点的探测，定量分析样品中叶酸的含量。结果表明，该方法检测血 清或红细胞的叶酸，与同位素放射免疫法测定的结果具有良好的相关性。 1 2 5电化学分析法 l u c o c k m d 7 1 用制各内标的特效h p l c - - 电化学检测法测定了血浆中的内生5 一甲 基四氢叶酸。乔正道、潘定华【8 l 用交流示波极谱测定难溶盐的溶度积，表明叶酸与a r 反应定量进行，可用a g n 0 3 直接滴定。d a n n e r t s 9 l 用腺苷脱氨酶作为酶标记和电流发检 测了非均相结合的叶酸。c a k i r s l l o ) 提出了在药物制剂中核黄素和叶酸的同时方波伏安测 定方法。9 0 年代以来，叶酸的电化学分析方法有了些进展，但只是停留在一些理论 方面，并且是将研究叶酸的吸附性和示差脉冲极谱割裂开来j 。最近，万其进等【1 2 】报 道了聚溴甲酚绿膜修饰电极叶酸的差示脉冲溶出伏安测定方法，其检测限仅1 0 x 1 0 - 6 m o l l ，远达不到生物和食物实际样品的测定要求。 2 第一章绪论张娟 1 3 尿酸分子的测定意义 生物分子尿酸( 2 4 6 三羟基嘌岭) 是人体内嘌呤代谢的最终产物f 】引。在正常情况 下含量相对稳定。但在病理情况下，含量常发生变化，因此，检测尿酸可以间接反应出 与嘌呤代谢有关的一些疾病，如痛风和l e s c h - n y h a n 综合症。痛风是由于尿酸盐晶体在 关节、软组织、内鳃囊和筋等位置沉积所致；而l e s e h - n y h a n 综合症是x 线性染色体 杂乱导致的次黄嘌呤鸟苷转让酶缺乏。高尿酸血( 血液中尿酸浓度升高) 预示着某些疾 病，如肾脏损伤、自血病和肺炎等发生。测定血液或尿中的尿酸水平可以确诊这些疾病 的存在。健康成年人正常尿酸的水平为血清中0 1 5 - 0 4 m m o l l 1 1 引、尿液中2 5 0 - - 一 7 5 0 m g l ( 1 4 9 - - 一4 4 6m m o l l 2 4 h ) 【1 5 】 生活污水中尿酸浓度在o 2 1 0m g l 之间，尿酸可通过氧化和水解而发生降解， 因而造成的污染并不大1 1 6 1 。 尿酸【1 7 】在商业主要用于制备尿素，阿脲，双阿尿，乙二酰尿，骨螺紫和其它衍生 物。尿酸内服，可治疗心水肿，肺结核，妄想狂等等，外用可治疗痛风。4 的尿酸铵 软膏可用于慢性湿疹的治疗，内服也可治疗咳嗽和流行性感冒。 另外，因其具有紫外吸收的功能，所以o 0 3 5 0 2 的尿酸已广泛用于香波和其它 光敏感的化妆品中，起稳定颜色的作用。 1 4 尿酸分子的分析方法现状 尿酸往往不是单独存在的，因此尿酸的测定经常受到同类物质的干扰，这就要求我 们或者分离后测定，或者采取适当的方法和技术能够在混合状态时测定。尿酸当前的主 要分析方法有高效液相色谱( h p l c ) 、传感器法、酶法、电化学分析法和光度法等， 现分述如下： 1 4 1 高效液相色谱( h p l c ) 高效液相色谱法高效、迅速、方便，且能实现分离测定，目前是应用最为广泛的一 种。许素菊、柳天平等1 18 】用高效液相色谱法测定了脑脊液中的尿酸、次黄嘌呤及黄嘌 呤。c z a u d e r n am l 】9 j 等作了血液中尿囊素、尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤共存时h p l c 测定， 其校正曲线为6 1 4 2pm o l l ：f 1 i ge ；h e r m a n nt w 2 0 l 等测定了生物体液中的尿酸， 其尿酸标正曲线为2 5 - - - 2 5 0 0 “m o l l ，周永国t 2 q 以0 0 2 m o l lk h 。p 0 , ( p h6 5 ) 为流 动相，用h p l c 法同时测定了血清中肌酸、尿酸和肝，这三种物质可在2 m i n 内分离，其 中尿酸的检出限为o 2 11 tg m l 。 1 4 2 传感器法 近年来传感器用来测定尿酸的报导较多，王氢、邓家祺等陇1 用鱼肝、生姜和生姜 粉末制成的组织传感器测定了血浆中尿酸，并同时测定了过氧化氢：u c h i y a m as 等心引 用二硫苏糖醇化学放大尿酸传感器的响应的方法测定尿酸，当在l 肛m o l l 尿酸中加入 5 0 m m o l l 题示糖醇时，其放大因子为1 3 3 ，含5 0 m m o l l 题示糖醇时，尿酸的检出限为 8 0 m m o l l ；g il m a r t i nm a t ；h a r tj p 等曙刖研制了化学修饰石墨一环氧树脂和含肽菁 钴筛析一印刷电极的电流传感器，制备该电极并研究其电化学性质，通过尿酸与尿酸酶 反应生成h 2 0 z 的性质间接测定尿酸：e l m o s a l - l a m ym a f 等伫5 1 应用新的尿酸电位膜传 3 第一章 绪论 张娟 感器来测定血清和尿中的尿酸，对尿酸氢离子的能斯特反应范围为0 。0 l m o l l 0 1 0 m o l l ，此法可用来测定尿、血清、及商品试样；刘宝红，胡仁其等幢引以r 氧化铝 固定尿酸氧化酶的尿酸传感器测定尿酸，检出限为2 。0 x 1 0 啼m o l l ，其线性范围为1 0 1 0 一7 5 1 0 m o l l ：m i t s u b a y a s h ik 等他7 1 用生物传感器法和离子选择电极法 测定汗中的尿酸，从而由代谢物衡量身体状况。 1 4 3 酶法 k a y a m o r i y ，k a t ay a m ay 1 2 8 】用能产生水溶性甲基染料的新四唑盐酶来测定血清中的 尿酸；a o k i y ，l h a r ah 等【2 9 l 通过尿酸酶一过氧化酶复合反应测定了尿酸，并研究了各种 血清胆红素对其的影响。h u l l i n ，d ，a 等【3 0 】研究了胆红素对尿酸酶一过氧化酶偶合反应 的影响，并对临床样品中尿酸进行测量，并评价了外在质量关系。酶反应的选择性为最 好，其反应机理是在尿酸酶的存在下，借助溶氧将尿酸化成尿素： u r i ca c i d + 0 2 + 2 h 2 0 竺竺a l l a n t o i n + h 2 0 2 + c 0 2 基于检测此反应过程尿酸在2 9 2 n m 处吸光度的降低( 尿酸酶在2 9 3 n m 处不产生光吸收) 的比色法( 分光光度法) 和检测反应过程的电流变化的酶电极( 电化学方法生物传感 器) 得到发展并在临床得到应用【3 l - 3 倒。这类方法的主要缺点是必须把样品中的蛋白质分 解并保持测定过程溶氧恒定。 1 4 4 分光光度法 m a t s u b a r a e 等1 3 7 】用肽( ) 卟啉配合物分光光度测定血清中的尿酸，具体方法 是将血清与水，尿酶和p h8 2 的h 3 8 0 3 缓冲液混合等处理后，于4 3 2 n m 相对水测吸光 度，5 1 0 0l am o l l 尿酸的校正曲线呈直线。a b d e l 一h a ym h 等1 3 8 j 分别测量2 8 4 n m 一 阶导数信号和2 9 3 n m 二阶导数信号，用分光光度测定混合物和尿中的尿酸。吴辉、夏 寿阳等【3 9 】利用尿酸与二氯苯醌氯亚胺与尿酸在碱性条件下生成黄色复合物的性质，在 4 4 0 n t o 处用分光光度法测定尿中尿酸的含量。 1 4 5 伏安法 伏安法测定尿酸时，存在的主要问题就是共存物质( 主要是抗坏血酸，神经递质如 多巴胺和多种氨基酸) 的干扰，因为它们的氧化还原电位几乎相同，从2 0 世纪7 0 年代 后期化学修饰电极的出现，为解决这一问题提供了希望。在电极表面修饰一层化学物质 分子，赋于电极以特定的性质，能有效地降低某些氧化还原物质的过电位，从而达到分 离或同时测定的目的。例如，穆绍林、阚锦晴等m o l 利用聚吡咯尿酸酶电极的生物电化 学活性，测定了人体血液中的尿酸的含量。s p a r l o c k 1 d 4 t l 等用电聚合法将腺苷、腺 苷一5 三磷酸。次黄苷模链超溥过氧化吡咯膜沉积于玻碳电极上，用慢伏安法研究电极 对六胺钌、尿酸、腺嘌呤的选择性与灵敏度。c a i x ，k a l c h e r ，k 等【4 2 l 用预阳化碳糊电极， 差示脉冲伏安法测定了尿和血清中的尿酸1 4 引，其检出限为2l ag l 。k i n o s h i t ah u s u i t e th 副用覆盖石墨糊电极伏安法测定人血清中的尿酸，同时介绍了电极的制备。可测 定1 2 0 0l am o l l 的尿酸。z e n 和c h e n 引粘士修饰经过阳极极化的玻碳( g c ) 电极， 方波伏安法实现了在高浓度抗坏血酸存在下选择性测定尿酸和多巴胺。检测尿酸的灵敏 度达5 0 1 0 一m o l l c s a b a 等h 叫利用聚n - 甲基吡咯修饰的金盘电极并借助酶反应， 在大量抗坏血酸存在下测定了尿中的尿酸，测定线性范围为1 1 0 m o l l 9 1 0 4 第一章绪 论张娟 m o l l h i r o s h i 等h 酗在金电极上修饰了聚磷脂和含硫烷烃双层聚合膜，并同时将尿酸 酶夹在聚合膜中。该电极屏蔽了几乎所有其它干扰信号而仅对尿酸响应。j y h m y n gz e n 等h 将n a f i o n 膜修饰在阳极极化了的玻碳电极上，阳极极化g c 电极是为了提高g c 对 尿酸的响应灵敏度，而n a f i o n 是只允许阳离子穿过的聚合膜，在p h5 o 的条件下，尿 酸是以阳离子形式存在( p k a = 5 4 ) 而抗坏血酸是以阴离子形式存在( p k a = 4 1 ) ，这样 n a f i o n 膜可以选择性地让阳离子尿酸通过而有效地屏蔽了抗坏血酸，该电极检测尿酸 的检测下限达1 0 一m o l l 。 随着研究的进展，发现病人血清中尿酸含量的增长与高血压和局部缺血性心脏病有 关。尽管尿酸增高与局部缺血性心脏病关系的生物机理还不能确定，但对尿酸的检测以 提出在线分析的要求。在线分析必须使用微电极，最近，a n g n e s 等h 训发表了他们的研 究成果，他们将钯电沉积在金微电极上，借助流动注射分析法测定尿酸在该微电极上的 氧化电流，检测尿酸的线性范围为2 0 i 0 一m o l l 1 o 1 0 一m o l l 。 1 5 工作设想 随着人类对自然世界认识程度的提高，其它行业对分析学提出了更高的要求之一， 就是实现人体生物分子的在线分析。而在线分析必须使用微电极。微电极的面积与常规 电分析化学所用电极相差近千倍，那么在常规电极的分析方法和分析现象，能否在微电 极上实现的前提就是需要有足够高的灵敏度，因为电极的峰电流与电极面积成正比。所 以在叶酸和尿酸的测定时，我们设想通过利用它们所具有的吸附性和高灵敏度的示差脉 冲技术相结合等手段，提高测定的灵敏度，使用碳纤维微电极达到在线检测灵敏度的要 求，并能消除常见干扰物质的干扰和其反应机理的了解。实现从常规电极到微电极的跳 跃，向在线分析的目标向前迈进一大步。 5 第一章绪 论张娟 参考文献 1 r a og r ，k a n j i l a lg ，m o h a nkr e x t e n d e da p p l i c a t i o no ff o l i n - c i o c a l t e ut e a g e n ti nt h e d e t e r m i n a t i o no fd r u g s j a n a l y s t ，l9 7 8 ，10 3 ：9 9 3 2 s t e f a n i ar l i i s atv , a l t e r oa ，p a u lfe ta i d e t e r m i n a t i o no ff o l a t ev i t a m e r si nf o o d a n di ni t a l i a nr e f e r e n c ed i e tb yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y j j o u r n a lo f c h r o m a t o g r a p h ya l9 9 9 ，8 5 5 ( 1 ) ：2 3 7 3 s t e e nb ，p e t e rm ，h i l m e rse ta 1 d e t e r m i n a t i o no fv i t a m i n si nf o o db a s e do n s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o np r i o rt om i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s e so f i n d i v i d u a lv i t a m i n s j j o u r n a lo f c h r o m a t o g r a p h ya1 9 9 8 ，s 0 2 ( 1 ) ：2 3 3 4 l a p ar a s 。l i m aj l f c r e i sb fe ta 1 p h o t o c h e m i c a l f l u o r i m e t r i cd e t e r m i n a t i o no f f o l i ca c i di nam u l t i c o m m u t a t e df l o ws y s t e m j a n a lc h i ma c t a1 9 9 7 ，3 5 1 0 3 ) ：2 2 3 5 s a n t h o s n k u n m a rcr ，e t a l a n a l b i o x h e m ，1 9 9 5 ，2 2 5 ：1 6 w i l s o ndh ，e t a l ，c l i nc h e m ，1 9 9 5 ，4 1 ：1 7 8 0 7 用制备内标的固相试样快速及特效h p l c 电化学法测定血浆中的内与一甲基四氢叶 酸：l u c o c km d jh a n l e yk ；s m i t h e l l sr w b i o m e d ，c h r o m a t o g r 1 9 8 9 ，3 ( 2 ) ，5 8 6 3 8 用高流示波极谱测定难溶盐的溶度积：乔正道潘定华分析测试通报；1 9 9 1 ，1 0 ( 3 ) ： 4 3 _ 4 5 9 用腺苷脱氨酶作为酶标记和电流检测非均相结合测定叶酸d a n n e r ts ，jm e g e r h o f f m e q u i m a n a l1 9 9 4 ，1 3 ( 3 ) ，1 4 8 一1 5 l 1 0 药物制剂中核黄素和叶酸的同时方波伏安测定c a k i rs ：a t a y m a ni ，m i k r o c h i m a c t a 1 9 9 7 ，1 2 6 ( 3 4 ) ，2 3 7 - - 2 4 0 1 1 陈乔、张祖训，线性交位极谱法的研究叶酸的吸附波【j 】，分析化学1 9 9 2 ，2 0 ( 2 0 ) ：4 4 0 1 2 万其进，喻玖宏，杨年俊等。聚溴甲酚绿膜修饰电极示差脉冲溶出伏安法测定叶酸。 见：分析化学的成就与挑战 m 】。重庆，西南师范大学出版社，2 0 0 0 ：6 1 9 13 m a ni n d kr g ，j a m m e d t e c h n o l ，19 7 0 ，3 2 ，2 3 3 1 4 p u i gj ，g ，a n dm a t e o sf a ， 15 k i s s i n g e rp t ，p a c h l al ，a ，e t a i ，j a s s o c o f fa n d c h e m19 8 7 ，7 0 ，1 1 6 “k i r k - o t h r e r ”，3 r d e d ，v o l2 3 ，p p 6 0 8 6 1 4 ，1 9 7 8 1 7 。张俊忠，王常用，化工百科全书( 1 2 ) ，3 9 1 1 8 许素菊，柳天平等。h p l c 测定脑脊液中的黄嘌呤，次黄嘌呤和尿酸，临床检验杂 志，1 9 9 8 ，1 6 ( 2 ) ，9 7 9 9 19 c 2 a u d e r n am ；k o w a l e 2 y k j ；j c h r o m a t o g r , b ：b i o m e da p p l ，l9 9 7 ，7 0 4 ( 112 ) ，8 9 9 8 2 0 f l i ge ；h e r m a n nt w ：c h e ma n a l ( w a r s a w ) 19 9 7 ，4 2 ( 3 ) ，4 5l 4 5 8 2 1 周永国，h p l c 同时测定血清中肌酸、尿酸和肌肝，分析科学学报，1 9 9 8 ，1 4 ( 1 ) ， 5 2 - 5 4 2 2 王氢，邓家祺，用鱼肝，生姜和生姜粉末组织传感器分别测定血浆中尿酸药中v c 和过氧化氢，化学传感器1 9 9 4 ，1 4 ( 2 ) ，1 3 5 一1 5 6 6 第一章绪论 张娟 2 3 u c h i y a m as ；s c h i m l i z nh 。，a n a l 。c h e m1 9 9 4 ，6 6 ( 11 ) ，1 8 7 3 - 1 8 7 6 2 4 g i l m a r t i nm a t ；h a r tj p ，a n a l y s t ( l o n d o n ) ，1 9 9 4 ，1 1 9 ( 2 ) ，2 4 3 - 2 5 2 2 5 e l m o s a l - l a n gm a f ：m o h a m e dr a ，a n a l l e t t , 1 9 9 7 ，3 0 ( 1 2 ) ，2 1 7 5 - 2 1 8 7 2 6 刘宝红，胡仁其等，以卜氧化铝固定尿酸氧化酶的尿酸传感器研究，分析化学，1 9 9 7 ， 2 5 ( 1 ) ，l 卿4 2 7 m i t s u b a y a s h ik ：s u z u k im ，a n a l ，c h a n ，a c t a , 19 9 4 ，2 8 9 ( 1 ) ，2 7 - 3 4 2 8 k a yam o r ；y ；k a t a y a m ay ，c l i n b i o c h e m ，1 9 9 7 ，3 0 ( 18 ) ，5 9 5 5 9 9 2 9 a o k iy ；i h a r ah ，c l i n c h a i n w i n s t o n - s a l e n ，( n ，c ) ，19 9 2 ，3 8 ( 7 ) ，l3 5 0 13 5 2 3 0 h u l l i n d a ：m eg r a n em t g ，a n n ，c l i n b i o c h e m ，1 9 9 1 ，2 8 ( 1 ) ，9 8 1 0 0 31 k i l e n ab a ，p e a k em j ，p a r d u eh l ，s k o r gj w ，c l i n c h e m 19 8 6 ，3 2 ，4 8 6 3 2 刘宝红，邓家棋，胡仁其，分析化学，1 9 9 7 ，2 5 ( 1 ) 。1 9 3 3 穆绍林，阚锦晴，化学学报，1 9 9 3 ，5 1 ，6 3 2 3 4 w i l l n e ri ，k a t ze ，r i k l i na ，k a s h e rr ，j a m c h e m s o c ，1 9 9 2 ，11 4 ，1 0 9 6 5 3 5 r i k l i na ，k a t ze ，a n a l c h e m 19 9 5 ，6 7 ，41 18 3 6 。b a r d e aa ，k a t ze ，b u c k m e n na ，w i l l n e ri ，j a m c h e m s o c ，19 9 7 ，1 19 ，91 l4 3 7 m a t s u b a r a c ：y o k o j xy 药学杂志。1 9 9 4 ，1 1 4 ( 1 ) ，4 8 3 亡 3 8 a b d e l - - h a ym h ；b a r a r ym h ；e l s a y e dm a a n a l l e t t , 1 9 9 1 ，2 4 ( 9 ) ，1 5 1 7 - 1 5 3 0 3 9 吴辉，夏寿阳，程国翔，临床检验杂志。1 9 9 2 ，1 0 ( 1 ) ，1 l 4 0 穆绍林，阚锦晴，酶电极法测定人体血液中尿酸的含量，化学学报，1 9 9 3 ，5 1 ( 7 ) ， 6 3 2 6 3 8 4 1 s p a r l o c kl d ；j a r a m i l l oa ，a n a l c h e m a c t a ，1 9 9 6 ，3 3 6 ( 1 3 ) ，3 7 3 6 4 2 。c a i x ；k a l c h e rk ，t a l a n t a ，1 9 9 4 ，4 1 ( 3 ) ，4 0 7 4 1 3 4 3 k i n o s h i t ah ：u s u it 分析化学，1 9 9 l ，4 0 ( 8 ) ，3 8 3 - 3 8 7 4 4 j y h m y n gz e na n dp i n g - j y hc h e n ，a n a l c h e m ，19 9 7 ，6 9 ，5 0 8 7 4 5 r o b e r td 。，g a b o rh ，c s a b av ，a n a l c h i m a c t a , 1 9 9 9 ，3 8 5 ，1 8 7 4 6 1 钛a h i r on ，s h i n i c h i r oi ，s u u m uk ，h i r o s h iy ，a n a l c h e m ，1 9 9 9 ，7 1 ，4 2 7 8 4 7 j y h - m y n gz e n ，j i a - j e nj o u ，g o v i n d a s a m yi ，a n a l y s t19 9 8 ，12 3 ，13 4 5 4 8 f r e e d m a n d j ，w i l l i a m s o nd l ，g u n t e r 、m e ，b y e r st ，a m j e p i d e m o i ， 1 9 9 5 ，1 4 1 , 6 3 7 4 9 r e n a t o c m ，m a r c i oa a ，c l a u d i m i rl l ，a n g n e sl ， a n a l c h i m a c t a 2 0 0 0 ，4 0 4 ，1 5 1 7 第二章差示脉冲溶出伏安法测定粮食中叶酸的研究 张娟 第二章 差示脉冲溶出伏安法测定粮食中叶酸的研究 摘要：利用差示脉冲溶出伏安技术和叶酸在电极表面的吸附特性，建立 了测定痕量叶酸的电化学分析方法。方法具有快速、简便、灵敏度高、干扰 少的优点。在不富集的实验条件下，差示峰电流与叶酸浓度在3 3 9 1 0 川m o l l 3 7 3 1 0 。7 m o l l 范围内呈良好线性关系：而在- 0 2 5 v 电位吸附 富集7 0 s 条件下，其线性范围为6 7 8 1 0 o m o l l - 2 7 2 l0 - s m o l l ，检测 限达1 o 1 0 - 1 1 m o l l 。将该方法应用于小米和玉米中微量和痕量叶酸的测 定，结果满意，回收率在9 4 1 0 2 之问。 关键词：差示脉冲溶出伏安法；叶酸；玉米；小米；电分析 2 1 前言 叶酸( v b 6 ) ，广泛存在于粮食和蔬菜中，动物的肝和肾脏中也含有较丰富的叶酸，是 一种生理上具有重要作用的维生素b 族化合物。它的生理功能主要是用于生血，在血细胞 的形成和分裂过程中也起着重要的作用。当体内叶酸缺乏时，会出现巨红细胞性贫血骨髓 中血红细胞变化的典型症状。人体内叶酸主要来源于摄入的食品，因此，作为人类营养主 要来源的粮食中叶酸的检测方法研究有着重要的意义。 叶酸的常用分析方法有分光光度法f i j 、色谱法【2 1 、毛细管电泳1 3 1 、和荧光光谱法 4 1 ，但 灵敏度较低。9 0 年代以来，叶