（生物化学与分子生物学专业论文）生孢噬纤维菌的分离、鉴定及生物学特性的研究.pdf

中文摘要 生孢噬纤维菌( s p o r o c y t o p h a g a ) 是能够降解纤维素的滑动细菌。以往 由于技术手段的限制，对生孢噬纤维菌的特殊纤维素降解机制，未进行 过系统而深入的研究。本项：_ i = 作的目的是通过发掘我国的丰富的纤维素 微生物资源，对能降解纤维素的好氧性细菌生孢噬纤维菌 ( s p o r o c y t o p h a g a ) 进行系统地研究，研究该类细菌的特殊的生活史以及纤 维素降解的特眭与规律，探讨其纤维素酶的性质和纤维素降解过程，同 时对其所合成的荚膜多糖的性质进行初步研究，以填补这一领域的国内 外空白。 ， 本论文的主要结果如下： 1 以滤纸纤维素为唯一碳源，从吉林省通化地区的黑土壤中，分离得 到一株可降解纤维素的滑动细菌；该菌株具有极强的纤维素降解能力，在 以纤维素为唯一碳源的培养基上可快速生长。通过对其形态学与生理生 化特性的研究，按b e r g e y sm a n u a lo fd e t e r m i n a t i v eb a c t e r i o l o g yf 9 t h c d ) ，鉴定该菌株为生孢噬纤维菌的一个新菌株，命名为s p o r o c y t o p h a g a s p 儿一0 1 。 2 对该生孢噬纤维素菌的生活史进行了重新研究，发现了一些新的 菌体形态，对既往的生活史进行了修正。 3 为了揭示生孢噬纤维菌的纤维素降解机制，本文采用扫描电子显 微镜观察了生孢噬纤维细菌( s p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 ) 对滤纸纤维素 的降解过程，分析了在此过程中滤纸纤维素的降解与菌体形态变化之间 的关系。结果表明：生孢噬纤维细菌在纤维素降解过程中，形成长度为 2 5 肛m 5 o “m 可弯曲的细长杆状细胞，该细长杆状细胞通过与纤维素分 子的吸附或嵌入纤维素中完成对纤维素的降解；在降解后期，杆状细胞 转化为直径约为0 6 - 1 o p x n 的小孢囊体眠细胞。 4 为了揭示生孢噬纤维菌的纤维素降解机制，本文对可旺盛降解滤 纸纤维素的生孢嗜纤维素菌s p o r o c y t o p h a g as p r e 一0 1 的纤维素酶进 行了研究。结果显示：生孢嗜纤维素菌s p o r o c y t o p h a g as p j l 一0 1 通 过细胞质膜向细胞外分泌c m c 酶，而滤纸纸维素酶则存在于细胞质膜 上。 5 为了进一步揭示生孢噬纤维菌的纤维素降解机制，本文从生孢噬 纤维细菌印o r o c y t o p h a g as p 儿- 0 1 的发酵上清液中分离纯化得到了一个 具有c m c 酶活性的组分c m c a s e - e 1 。研究表明：c m c a s e e 1 组分的分 子量为8 2 k d a ；其最适反应温度为5 0 。c ，最适反应p h 为5 0 。z n 2 对 该c m c 酶有抑制作用，f d + 对该酶有微弱的促进作用。h p l c 分析显示， 该酶为纯酶。该酶的氨基酸分析结果显示，c m c a s e e 1 中芳香族氨基酸 占1 0 5 1 ，酸性氨基酸含量较高，占到2 4 5 4 ；碱性氨基酸含量较低， 占到7 0 0 。c m c a s e e 1 组分的c d 光谱显示，其在2 1 8 n m 处有一个负峰， 说明t 3 一折叠结构是该c m c 酶具有酶活的主要构象：7 5 变性处理，在 2 2 3 n m 处的的峰位上移，表明组分中a 一螺旋的含量下降，酶蛋白处于松 散状态。而c m c a s e e 1 组分的荧光发射光谱显示，该酶在部分变性后， 荧光下降，可溶性蛋白质构象发生变化，显色基团被掩盖。 6 本文以滤纸纤维素为唯碳源，对s p o r o c y t o p h a g as p j l 一0 1 英 膜多糖的发酵条件的优化与多糖性质进行了系统地研究。对生孢噬纤维 菌进行液体培养，得到含荚膜多糖的发酵液，采用s e p h a d e x g 一7 5 柱层 析对荚膜多糖进行了层析分析，确定了该菌的荚膜多糖为糖蛋白，分子 量约为6 5 万；对该荚膜多糖的组成进行了气相色谱分析，该荚膜由g a l 、 g l c 、 3 1 c a 以及m a n 组成；对该荚膜多糖的红外光谱分析显示，该荚膜 多糖含甲基、亚甲基的量比正常多糖多；且含有不典型0 糖苷键特征吸 收峰，有可能是同时含有口糖替键与口糖苷键。 同时，本文对生孢噬纤维菌s p o r o c y t o p h a g as p j l o i 产生胞外多 糖的最佳发酵条件进行了优化研究，结果表明：添加有机氮源的培养基 中菌体生长较好；j l 0 1 菌株最适产糖的初始p h 为7 5 ，在此p h 菌体 的生长也最为旺盛；以葡萄糖和淀粉进行培养时，产糖量要比在纤维素 培养基中高；而j l 0 1 菌株对玉米皮和秸秆的降解率较低。f 关键词：生孢噬纤维菌；纤维素降解；菌株鉴定；荚膜多糖 a b s t r a c t 印o r o c y t o p h a g ai sak i n do fg l i d i n gb a c t e r i u mt h a tc a nd e c o m p o s e t h e c e l l u l o s e t h i sb a c t e r i ai sa n i m p o r t a n tm o i e t y i nt h e c e l l u l o l y t i c m i c r o o r g a n i s m s b u tm u c hl e s si n f o r m a t i o ni s a v a i l a b l eo f f t h ec e l l u l o s e b i o d e g r a d a t i o nb ya e r o b i cb a c t e r i a i ti sv a l u a b l ef o ru st ou n d e r s t a n da n d s t u d y t h ec e l l u l o 坼i cm e c h a n i s mo ft h e s ec e l l u l o l y t i ca e r o b i cb a c t e r i a t h e s ew o r k sw i l lh e l pu st od e v e l o pt h ec e l l u l o s er e s o u r c ei nt h en a t u r e i n t h i s p a p e ru s i n gf i l t e r - p a p e rp l a t ea n dc f 一1 ls o l i dp l a t e w ei s o l a t e da n a e r o b i cc e l l u l o l y t i cb a c t e r i u mf r o mt h ec o r ns o i l t h et a x o n o m i cp o s i t i o n ， l i f ec i r c l e ，c e l l u l o s e d e g r a d e dc h a r a c t e r i s t i c sa n de x - p o l y s a c c h a r i d e so ft h i s b a c t e r i u mw a s i n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r t h em a i nr e s u l t so b t a i n e df r o mt h i sw o r ka r ea sf o l l o w s 1 an o v e la e r o b i cc e l l u l o s e d e g r a d i n gb a c t e r i u mh a sr e c e n t l yb e a n i s o l a t e df r o mc o m s o i l a n dd e s i g n a t e da ss t r a i nj l 0 1 s t r a i nj l - 0 1c a ng r o w b yu s i n gt h ef i l t e rp a p e ro r b a l lm i l l e dc e l l u l o s ec f 一11a ss o l ec a r b o ns o u r c e c o n c o m i t a n tw i t ht h ec e l l u l o s e d e g r a d i n g t h e r ew a sa g r e a t d e a lo f e x p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c e d t h et a x o n o m i cp o s i t i o no fs t r a i nj l 0 1 w a s i n v e s t i g a t e d o nt h e m o r p h o l o g i c a n db i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s i t w a s i d e n t i f i e dan e ws t r a i no fs p o r o c y t o p h a g aa n dn a m e ds p o r o c y t o p h a g as p j l 0 1 2 j l 0 1w a so b s e r v e d b y t h e s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e a f t e r c u l t u r e do nt h ef p l i q u i d m e d i u m t h er e s u l t ss h o w nt h ed i f f e r e n t m o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c so fs p o r o c y t o p h a g aj l 0 1 o nt h i sb a s i san e w p o s s i b l el i f ec i r c l ew a sb r o u g h t f o r w a r d 3 f o ru n d e r s t a n d i n ga n ds t u d y i n gt h e c e l l u l o l y t i c m e c h a n i s mo f s p o r o c y t o p h a g as p j l 一0 1 t h ep r o c e s sa b o u td e g r a d a t i o n o f f i l t e rp a p e rf i b r e w a ss t u d i e du s i n gs c a l a _ e l e c t r o n m i c r o s c o p y t h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e st h a t s p o r o c y t o p h a g as p j l 一0 1g r e wo f f f i l t e r p a p e rw e r eo b s e r v e d t h es t u d y r e v e a l e dt h ej l - 0 1a d h e r e dt i g h t l yt ot h es u r f a c eo ff i l t e r p a p e rf i b r eo r p e n e t r a t e di n t o i n t e r i o ro ft h ef i b r et h r o u g hi t s 2 5 u m 一5 0 b t mb a c i l l i f o r m c e l l si nt h ep r o c e s so fd e g r a d i n g t h eb a c i l l i f o r mc e l l sd e g r a d e t h ec e l l u l o s e s t r o n g l ya n dp r o d u c e dam a s so fs t i c k yp o l y s a c c h a r i d e s a tt h ea n a p h a s eo f c u l t u r e d ，t h eb a c t e r i ae x i s t e da sac y c l o i d a ld o r m a n c yb o d y s p o r o c y s t 4 w ed e t e r m i n e dt h ec m c a s ea c t i v i t ya n dt h ef p e n z y m ea c t i v i t y a b o u tt h es u p e m a t a n t ，c a p s u l e ，s o n i c a t e db r o k e nc e l l ，a n dt h ei n t a c tc e l lo f s p o r o c y t o p h a g as p j l 一0 1 a c c o r d i n g t ot h e s er e s u l t s w em a k et h ec e l l u l a s e l o c a l i z a t i o no f s p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 t h e r e s u l ts h o w e dt h a t s p o r o e y t o p h a g as p j l - 0 1h a v eae x t r a c e l l u l a rc m c a s e a n d i t sf p e n z y m e i sa tt h ec e l lm e m b r a n e 5 o n ec m c a s ea c t i v ec o m p o n e n tw a s p u r i f i e db yg e ls e p h a d e xg 1 0 0 f r o mt h ec u l t u r ef i l t r a t eo fs t r a i ns p o r o c y t o p h a g as p j l - 0 1 t h er a n g eo f o p t i m a lt e m p e r a t u r e sa n do p t i m a lp h o ft h i sc m c a s ef o rh y d r o l y s i so fc m c w a s5 0 ca n dp h5 0 d a t af r o mt h es d s - g e le l e c t r o p h o r e s i si n d i c a t e dt h e m o l e c u l a rw e i g h to ft h i sc m c a s ei s8 2 ，0 0 0 t h ez n 2 + h a v eao b v i o u si n h i b i t e f f e c ta n df e 2 + h a v eaw e a ki n c r e a s ee f f e c tt ot h i sc m c a s ea c t i v i t y t h e a n a l y s i so fc ds p e c t r u ms h o w e dt h a tt h ep 呻l e a t e ds h e e ts t r u c t u r eo f t h i s c m c a s ew a st h em a i nc o n f o r m a t i o nw i t hc m c a s ea c t i v i t y t h ea n a l y s i so f f l u o r e s c e n c es p e c t r u ms h o w e dt h a tt h et r y p t o p h a nm a yb ea tt h ea c t i v es i t e o f t h i sc m c a s e 6 t h ec o n d i t i o n sf o r p r o d u c i n ge x o p o l y s a c c h a r i d c s o fj l 0 1w e r e s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mo fn i t r o g e nr e s o u r c o ，p ha n d t e m p e r a t u r ew e r ey e a s te x t r a c tp o w d e r , p h 7 5 ，a n d3 5 c ，r e s p e c t i v e l y t h e r e s e a r c ho fd e g r a d i n gc o r l ls t a l ka n dc o mc o r t e xb ys p o r o c y t o p h a g as p j l 0 1s u g g e s t e dt h i ss t r a i nh a daw e a kd e g r a d a t i o na b i l i t yt ot h e s en a t u r a l c e l l u l o s e t h ec a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d eo fs p o r o c y t o p h a g as p 。j l 0 1w a si s o l a t e d b ys e p h a d e x g 7 5 t h em o l e c u l a rw e i g h ta n dc o n s t i t u t ew e r ed e t e r m i n e d t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h i sc a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e i s6 5 ，0 0 0 t h ec a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e w a sm a d e b yg a l a c t o s e ，g l u c o s e ，g l u e u r o n i e a c i da n dm a n n a n t h er e s u l to fi rs h o wt h a tc a p s u l a rp o l y s a c c h a f i d ei sam i x e da l i n k a g ea n d 1 3 l i n k a g ew i t hm o r em e t h y lg r o u pt h a no t h e rp o l y s a c c h a r i d e k e y w o r d s ： s p o r o c y t o p h a g a ； c e l l u l o s e d e g r a d e d ； b a c t e r i ai d e n t i f i e d ； c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名日 期：逸咝生：笪 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：逖指导教师签名：羞丝丞聋 日 期：2 鲍坌：篮 日 期：! 垒! 苎：塑 学位论文作者毕业后去向： 工作单位 通讯地址 电话： 邮编： 主要英文缩写词表 e g ( e n d o g l u e a n a s e )内切葡聚糖酶 c b h ( c e l l o b i o h y d r o l a s e s外切葡聚糖酶 g e ( p - g l u c a n a s e s )b 葡萄糖苷酶 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 c p c 氯化十六烷基吡啶 c b d ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n s纤维素结合域 x y n z ( x y l a n a s e ) ，木聚糖酶 s t m ( s c a n n i n g t u n n e lm i c r o s c o p e ) 扫描隧道显微镜 c d ( c a t a l y t i cd o m a i n s )催化域 c m c a s e ( c a r b o x y m e t h y lc e l l u l a s e )羧甲基纤维素酶 c m c ( c a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e )羧甲基纤维素 s e m ( s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e ) 扫描电镜 f p ( f i l t e rp a p e r )滤纸 p a g e ( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s )聚丙烯酰胺凝胶电泳 s d s - p a g e ( s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) s d s c d 光谱( c i r c u l a r d i c h r o i s ms p e c t r u m 、 e c o l i ( e s c h e r i c h i ac o l i ) t m c s ( t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n e ) g a l ，( g a l a c t o s e ) g l c ( g l u c o s e ) g i c a ，( g l u c u r o n a t e g l u c u r o n i ca c i d ) m a n ( m a n n a n ) g p ( g l y c o p r o t e i n ) d “d a l t o n ) m w ( m o l e c u l a rw e i g h t ) o d ( o p t i c a ld e n s i t y ) 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 圆二光谱 大肠杆菌 三甲基氯硅烷 半乳糖 葡萄糖 葡萄糖醛酸 甘露聚糖 糖蛋白 道尔顿 分子量 吸光度 s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) p b s ( p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ) r p m i r ( i n f x a r e ds p e c t r a ) 十二烷基磺酸钠 磷酸盐缓冲液 每分钟转速 红外光谱 月u舌 纤维素( c e l u l o s e ) 是地球上最丰富的有机物质，是一类取之不竭、 用之不尽的可再生资源。纤维素代谢则是生物圈碳循环的极其重要组成 部分，有资料表明：植物纤维的合成速率为1 0 亿吨年。伴随着能源紧 张、环境污染和人口剧增等世界性问题的日趋严重，纤维素资源的开发 和利用更加引起各国学者的关注。作为新能源、新食品、新材料的开发 的一个重要组成部分，对纤维素的生物降解以及纤维素酶学的研究j 下成 为这一研究领域的主要组成部分。 目前纤维素降解主要是酸解、酶解和微生物降解，其中，无论是酶 解还是微生物降解都离不开高效纤维素降解菌株。利用微生物降解纤维 素来有效利用纤维素资源是具有重大意义的研究课题。微生物对纤维素 的降解与转化不仅是自然界中碳素转化的主要环节，也是土壤微生物能 量代谢的主要来源，而且利用纤维素微生物及其纤维素酶把天然纤维素 物质转化为具有重要经济价值的食品、饲料、医药、化工原料等产品， 具有广阔的应用前景。 一、天然纤维素的结构与组成 作为组成木本植物和草本植物的主要成分，纤维素物质是地球上含 量最丰富的有机物质，是一类极其重要的可再生资源。天然的纤维素分 子化学性质稳定，不溶于水，也不溶于有机溶剂。纤维素分子是由b g 葡 萄糖残基通过b 一1 ，4 糖苷键联结而成的链状聚合物，每个纤维素分子中 的葡萄糖残基数随来源不同而不同，一般在30 0 0 个左右，最多可达1 5 0 0 0 个。脱结晶的纤维素分子本身组分单一，没有分支，化学结构并不复 杂。但天然纤维素分子都有复杂超分子结构；许多纤维素分子链之间通 过氢键相互作用，组成结构严谨的原纤丝( e l e m e n t a r yf i b r i l ) ，其内可 分为相对松散的无定型区，和排列整齐而规则的结晶区；结晶度一般在 3 0 一8 0 之间。许多原纤丝连接组成微纤丝( m i c r o f i b r i l ) ，若干根微纤 丝聚集成为纤丝( f i b r i l ) 。在细胞壁中微纤丝或纤丝组成网状结构，纤 丝之间结合大量结构复杂的木素、果胶及丹宁等间隙物质，组成复杂的 天然纤维和初生壁、次生壁等细胞壁结构“4 3 。 二、降解纤维素的霉菌及其纤维素酶的研究进展 早在上世纪4 0 年代人们就开始研究利用纤维素分解菌及其产生的 酶来降解纤维素。自然界中，许多细菌、真菌、放线菌都能降解纤维素， 人们广泛地开展了降解纤维素的微生物菌株的研究o 。 长期以来，纤维素降解机制的研究主要以霉菌为研究对象展开的， 其原因是霉菌具有较高的胞外纤维素酶活性，如人们发现木霉属 ( t r i c h o d e r m a ) 、曲霉属( a s p c r g i l l u s ) 和青霉属( p e n i c i l l u r n ) 等多个 菌属的菌株均可产生胞外纤维素酶。在对霉菌的纤维素降解的研究过程 中，通过对纤维素酶各组分的分离纯化和性质研究，人们提出了纤维素 降解的协同理论( s y n e r g i s m ) 、原初反应假说( i n i t i a ld e g r a d i n g ) 和碎片假说 ( f r a g m e n t a t i o n ) 。其中，协同理论( s y n e r g i s m ) 和原初反应假说( i n i t i a l d e g r a d i n g ) 得到了实验结果的支持，受到了人们的广泛认同。协同理论认 为天然纤维素完全降解至少需要三类纤维素酶，即内切葡聚糖酶 ( e n d o g l u c a n a s e ，e g ，e c 3 2 1 4 ) 、外切葡聚糖酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e s ，c b h ， e c 3 2 1 9 1 ) 、p - 葡萄糖苷酶( p - g l u c a n a s e s ，g e ，e c 3 2 1 2 1 ) 。降解纤维素 的过程是：内切酶首先作用于纤维素分子非结晶区，形成外切酶需要的 游离末端，然后外切酶从糖链的非还原末端，b - 葡萄糖苷酶水解纤维二 糖单位，形成葡萄糖。r e e s e i ”】在5 0 年前首先证明宾菌纤维素酶在消化 纤维素时有协同性，而且协同性与酶解底物的结晶程度成正比；酶组分 混合液比例与发酵液中各组分相近时协同性最大，而不同菌源的内切酶 之间也具有协同性。1 9 8 5 年w o o d 等人【1 l - 1 2 1 用木霉和青霉的纤维素酶水 解纤维紊时发现，培养液中两种外切酶在液化微晶纤维时具有协同性， 对于这种外切一外切协同性的解释是两种外切酶具有两种不同类型的 非还原末端的一种，当一种外切酶从一种还原末端切下一个纤维二糖单 位后，暴露出另外一种类型的非还原末端，被在邻链上的第二种立体特 异性的外切酶切下纤维二糖单位。但此学说的一个重要缺陷是未能说明 天然纤维素结晶区的降解机制。 c o u g h l a n b 3 i 等人的原初反应假说则认为天然纤维素完全降解至少 需要三类纤维素酶，即c 1 纤维素脱结晶酶、c x 内切葡聚糖酶( e g ) 及 外切葡聚糖酶( c b h ) ，最后一类为b 葡萄糖苷酶( g ) 。而m a n d e l s 等 人 1 4 1 则更相信这种原初反应( i n i t i a ld e g r a d i n g ) 是由这些酶协同反应所引 起的，而不是一个独立步骤。其降解纤维素的过程是：c 1 酶对纤维素进 行脱结晶，然后由内外切酶及b 葡萄糖苷酶共同作用于纤维素分子的非 结晶区，形成葡萄糖。在此基础上，人们建立了目前的纤维素酶分析系统， 该系统广泛的应用于各种霉菌纤维素酶的分析。而细菌纤维素酶的产生 由于种属间差异较大，产生的纤维素酶的性质差异较大，故尚无完整的细 菌纤维素酶分析体系，目前借用霉菌的纤维素酶分析系统，进行细菌纤维 素酶的分析与研究。 与此同时，在纤维素酶结构与构象的研究方面，人们进行了大量的 工作，并取得了许多重要的进展 1 5 - 3 0 】。1 9 8 6 年，t i l b e u r g h 用木瓜蛋白酶 有限酶切t ，r e e s e i 的c b h1 分子发现c b d ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n s ，纤 维素结合域) 以来，之后用类似的方法和序列缺失的方法在多种细菌、真 菌的纤维素酶和半纤维素酶中发现了c b d 。1 9 9 5 年t o m m e 根据c b d 分子大小及氨基酸的相似性将已知的c b d 分成了1 0 个家族，大部分的 c b d 位于家族i 、i i 、i i i 家族i 的c b d 包括3 3 4 0 个氨基酸残基， 所有真菌的c b d 都属于家族i ；家族i i 的c b d 包括9 5 1 0 8 个氨基酸 残基，c f i m i 的c b d 都属于家族i ；家族i i i 的c b d 位于那些能产生纤 维小体的梭菌中1 9 8 9 年k r a u l i s 用核磁共振的方法对t r e e s e i 的c b hi 的c b d 、1 9 9 5 年x u 对c f i m ic e x 的c b d 的三维结构进行了研究；1 9 9 6 年t o r m o 用x 光衍射的方法对c t h e r m o c e l l u m 的c 幻的c b d 三维结构 进行了研究。张志忠等人 3 】已成功将扫描隧道显微镜( s t m ) 技术应用 于纤维素的结构，纤维素酶的结构及纤维素酶解动态过程的研究，首次 从纳米水平上直接观察到外切纤维素酶c h bi “蝌蚪”状的分子构象，解 决了因c h b1 分子高度不对称而难以用结晶的方法研究其结构的难题。 也从纳米水平上直接观察到天然纤维素结晶区和非结晶区及叉状结构 的存在，证实了基原纤丝是结晶纤维素的最小结构单元。 截止目前，木霉属、青霉属、曲霉属等属的菌株由于分泌胞外纤维素 酶的能力较强，同时适合于进行大规模的固体和液体培养，而在生产中得 到了广泛的应用，形成了目前市场前景极佳的纤维素酶工业。纤维素酶被 广泛应用于食品工业、饲料工业、烟草工业以及纺织工业，日化工业等 领域侧。 三、降解纤维素的细菌的研究进展 细菌作为自然界降解纤维素中重要的一个组成部分，其许多种属具 有较强的纤维素降解能力：但由于种种原因，对其降解纤维素的研究进 展缓慢。1 9 9 4 年n e e n ad i n ，h o w a r d g 等人 4 9 】在研究c e l l u l o m o n a sf i m i 时提出了个与艄e 理论类似的纤维素酶分子内协同理论。 c c l l u l o m o n a sf i m i 纤维素酶是由一个c b d ( 相当于c i ) 和一个c d ( c a t a l y t i cd o m a i n s ，催化域) ( 相当于c x ) 组成的复合酶体系，在降解纤 维素的过程中，c b d 结合到纤维素上，打开结晶区，使得c d 更容易附 着在纤维素上使纤维素发生降解。高培基等人1 5 0 j 在对噬纤维菌降解纤维 素的研究表明，噬纤维细菌属存在氧化性降解酶类，并且，该氧化性降 解酶类位于细胞膜上。但是，不论是哪种理论，对于细菌降解纤维素 的机制都没有作出完整的解释。 1 厌氧性纤维素细菌的研究进展 自然界中存在着能降解纤维素的厌氧细菌，其中以高温厌氧菌最为 典型，它们在高温厌氧的条件下具有较强的纤维素降解能力，并产生热 稳定的纤维素酶。对厌氧性纤维素细菌的研究由于对人们进一步了解纤 维素降解机制，并有效利用纤维素资源具有重大的理论和应用价值，长 期以来一宜吸引人们对此进行研究。在厌氧纤维素细菌的研究过程中， 由于厌氧细菌纯培养的难于获得，曾长期阻碍了对这些厌氧纤维素分解 细菌的研究的进行。如早在上个世纪初人们就观察到了高温厌氧纤维素 分解细菌对纤维素的分解现象。但直到上世纪5 0 年代人们才采用h u n g e r 滚管法吲获得了厌氧菌的纯培养；在此基础上，h a l i i w e l l ，p o n p i u m ，t a y a , s v e t l i c h n y v a h u d s o n 等人， 5 2 - 5 9 1 我国学者谭蓓英、赞延龄、于洪日【6 嘶3 等先后获得了多株以热纤梭菌( c l o s t r i d i u mt h a m o c e l l u m ) 为代表的厌氧 4 梭状芽孢杆菌的纯培养，并对其生理学、生物化学特性及产生c m c 酶 活的特性进行了详细研究，研究发现这些梭菌都是严格厌氧的，发酵产物 中多含有乙醇，并产生一定的c m c 酶活。在对c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 等细菌的纤维素酶进行研究的过程中，l a m e d 6 7 1 、c h o is k 6 5 - 6 6 等 人均发现在这些细菌细胞表面上存在着一种刺状的具有纤维素酶功能 的胞连结构，称之为纤维素酶体( c e l l u l o s o m e ) ，这些小刺与纤维素降解紧 密相关。研究表明，纤维素小体由多种纤维素酶组成，只有完整的纤维素 酶小体方可降解微晶纤维素( c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ) 。此外，人们进一步发 现 6 4 种】，这一类细菌的纤维素酶体( c e l l u l o s o m e ) 是由多个c b d 、c d 通过d o e k i np r o t e i n 和l i n g k e r 连接在一起的复合体系，其降解产物多为 纤维寡糖。人们通过对r u m i n o c o c c u s 这一典型菌株对纤维素降解的过程 的系统研究，从形态上加深了厌氧菌对纤维素降解的了解，研究显示这 类菌对纤维素的降解主要分为四个过程：( 1 ) 非杆状细胞到达底物部位的 转移；( 2 ) 细菌与暴露位点的非特异性结合；( 3 ) 通过纤维素酶体、菌毛、 酶的c b p 及c b d 的特异性结合；( 4 ) 菌体的扩增。由此可见，对典型菌 株对纤维素降解的过程的系统研究，将有助于人们了解有关细菌对纤维 素降解的机制。 国内对厌氧菌的研究起步较晚，目前多限于菌株的分离纯化。谭蓓 英、贺延龄等人先后获得了多株厌氧梭状芽孢杆菌的纯培养，并对其生 理生化特性进行了研究。研究中还发现许多嗜热厌氧纤维素降解细菌在 降解纤维素过程中对纤维素具有较强的粘附作用。此外，曹月青等口o 】 利用纤维素刚果红琼脂培养基从桑粒肩天牛幼虫中肠分离到一株兼性 厌氧纤维素分解菌，被鉴定为纤维单孢菌属的菌株。 2 好氧性纤维素降解细菌的研究进展 对分解纤维素的好氧性细菌的研究是整个纤维素微生物降解研究 中非常重要的环节。目前已经报道的好氧性纤维素分解细菌主要为 c y t o p h a g a 、s p o r o c y t o p h a g a 、b a c i j u s 以及放线菌中的s t r e p t o m y c e s 等属的菌种。国内对好氧性纤维素分解细菌的研究开始于2 0 世纪5 0 一6 0 年代，山东大学王祖农教授”“对好氧性纤维素细菌的分离纯化方法作了 系统改进，并且得到了嗜盐性菌株。官家发等人啪3 也从堆肥土样中分离 得到了几株原核好氧纤维素酶产生菌，有细菌和放线菌，其中有一株芽 孢杆菌属的好氧细菌一芽孢杆菌菌株，能在5 5 温度下生长良好并在 培养液中积累大量胞外纤维素酶，此酶为单的羧甲基纤维素酶( c m c 酶) ，不能水解棉花纤维、微晶纤维和滤纸等天然纤维素；而且只有羧 甲基纤维素钠能诱导该菌产酶，而微晶纤维等天然纤维不能诱导该菌产 酶。石晶瑜等”从呼和浩特地区碱性土样中分离和筛选出一株产纤维素 酶活力较高的好氧性细菌菌株h t 3 ；该菌产酶为胞外分泌，在最适条件 下培养，酶活可达5 1 u 。熊世勤【74 】从西双版纳温泉水样中分离到嗜热脂 肪芽孢杆菌的c c 2 2 菌株；刘永生等人f7 5 】在广西分离到了降解天然纤维 素的地农芽孢杆菌并克隆到了一个纤维素酶基因c e l 5 a ；9 6 年李宪臻等 对链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p l x ) 进行了研究。此外，9 0 年代后 期，s u b r a m a n i y a n ，s 7 6 - 8 2 等人对多株细菌的纤维素酶进行了研究。 在纤维素降解细菌的研究过程中，人们发现许多细菌具有较强的纤 维素降解能力，人们可以明显地看到纤维素分解现象，但却很难像真核 生物一样测到相应的胞外酶活，因此极大的限制了对其进一步的研究。 1 9 9 0 年刘东波、高培基、王祖农等人”1 分离到一株同时具有降解纤维素 和固氮能力的诺卡氏放线菌，但在研究过程时发现该菌株具有较强的纤 维素分解能力，但未发现任何胞外纤维素酶的存在，但同时却发现该菌 株的菌体细胞和细胞碎片对纤维素具有较强的降解能力。在降解纤维素 的细菌的研究过程中，人们发现生孢噬纤维菌( s p o r o c y t o p h a g a ) 具有完 全降解天然纤维素的能力，也仅产生极低的胞外内切纤维素酶活性，却 不分泌其它胞外纤维素酶，故其纤维素降解机制至今仍不清楚。这类纤 维素细菌的典型菌株是生孢噬纤维菌( s p o r o c y t o p h a g a ) 和纤维素诺卡 氏放线菌( n o c a r d i ac e l l u l a n s ) 。由此可见，由于技术与条件的限制， 人们对于这类特殊的好氧性细菌的纤维素降解机制还很不清楚，甚至至 今没有开展相关的研究工作，更没有合理完整的降解机制提出。 四、细菌多糖的研究进展 多糖与脂类、蛋白质、核酸一起被称为构成生命的四大基本物质。 6 随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖类的作用不仅限于提供能量 和作为结构材料，而是蕴涵十分丰富的生物语言信息的高密度的信息载 体【8 4 1 ；对植物多糖的研究表明，多糖具有抗凝血作用【8 ，增强免疫功能抗 肿瘤抗病毒等作用【8 6 ；此外多糖还具有许多其它功能如降血糖、血脂的作 用，解毒保肝的作用 8 7 - 8 8 等，因此对多糖的研究已成为人们十分关注的一 个热点。 细菌多糖是一类带有复杂基团的生物聚合物，其组成与结构具有鲜 明的原核生物特征，有关细菌多糖生物合成、结构与功能的研究，具有重 要的理论和应用价值 9 ”。细菌多糖的组成与结构研究表明，化学类型上不 同的特异性细菌多糖的结构中，含有许多阴离子基团1 9 ”，如己糖醛酸、神 经氨酸、氨基己糖醛酸、乙酰取代物、磷酸或硫酸，它们也被称为阴离子 多糖。如噬血杆菌( h c m o p h i l u s ) 的特异性荚膜，由磷酸核糖、聚磷酸葡萄 糖、聚氨基半乳糖以及多聚乙酰磷酸氢酸所组成，为阴离子多糖。此外象 细菌异质聚糖、硫酸微纤维素和透明质酸、取代多糖以及荚膜多糖等从 本质上讲，都是阴离子多糖。 细菌多糖是一类物理化学和免疫学上具有高度活性的化合物。大 多数的细菌多糖具有重复单位，而在重复单位中一般只含有3 5 种单糖组 分，常见的单糖组分是葡萄糖、半乳糖和鼠李糖。从功能角度讲，细菌多 糖可分为两部分，即胞内多糖和胞外多糖。胞内多耱主要有糖原、淀粉、 甘露聚糖等，它们除了作为营养储藏物外，可能还具有生理活