临床微生物学下呼吸道感染细菌学检验操作规范ppt课件.ppt

临床微生物学下呼吸道感染细菌学检验操作规范,1,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体和原虫等。,2,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,社区获得性肺炎常见的病原菌有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、肺炎支原体及肺炎衣原体等。医院获得性肺炎常见的病原菌有铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和假丝酵母菌等。,3,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音、白细胞总数及嗜中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症，严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭，因此临床诊断一般不难；细菌学检验能明确感染病原及药敏结果，有助于疾病治疗、流行病学调查和医院感染的监测。临床呼吸道标本中常见分离细菌见表1,4,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,5,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,一、送检指征,痰液标本是临床微生物学检验最常见的标本，但不是下呼吸道感染的最佳标本。1.咳嗽咳嗽咳痰是下呼吸道感染最常见的症状，咳嗽的性质与痰的性状如脓或铁锈样痰具有鉴别诊断意义。2.咯血喉以下的呼吸道出血为咯血，包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等3.呼吸困难呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛4.发热伴白细胞增高尤其是中性粒细胞或CRP明显增高5.胸部影像学检查提示有感染可能,6,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,二、标本采集与验收,对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。痰液是临床微生物学检验最常见的标本，但不是下呼吸道感染的最佳标本。,7,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,（一）标本采集方法,1自然咳痰法以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或牙刷清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙。尽可能在用抗菌药物之前采集标本。用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应1ml。咳痰困难者可用雾化吸入加温至45的100g/LNaCl水溶液，使痰液易于排出。对难于自然咳痰患者可用无菌吸痰管抽取气管深部分泌物。标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存2h。,8,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,2支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法，均由临床医生按相应操作规程采集，但必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。3小儿取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。,9,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,（二）标本验收与拒收,遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告不合格标本拒收的具体理由。下呼吸道标本验收与拒收见下。1.呼吸道有大量的正常菌群存在，咽试子、咳痰、吸出的分泌物厌氧菌培养无意义。2.申请单填写应完整。标本标识必须唯一，并与申请单相符，未标采集时间、部位或检验要求等拒收。3.痰标本呈水样或唾液样，拒收。,10,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,4.标本涂片白细胞和鳞状上皮细胞计数：白细胞数10/低倍镜和鳞状上皮细胞数25/低倍镜，表示该标本已污染正常菌群，建议重送标本。5.标本容器必须符合规定，溢漏、无盖者拒收。6.送检时间超过2h拒收。7.同时同部位或同一天两份相同检测的标本（应与申请医师协商处理）。,11,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,三、实验室检查,（一）肉眼观察观察痰液的颜色、粘度、有无血丝和是否呈脓性，如见有颗粒存在，则应注意可能与放线菌属及奴卡菌属感染有关。（二）显微镜检查下呼吸道细菌学检验的标本均需涂片革兰染色进行细胞学和细菌学显微镜检查，其目的是判别送检标本是否适合做细菌培养，并初步判定有否病原菌、病原菌的数量及其类别，有助于初步报告、选择培养基和对培养结果的综合分析。推荐判别标本合格的标准见表2,12,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,13,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,近年来推荐简单的方法是痰标本涂片镜检10个白细胞/低倍镜时，就可判断是基本合格并可用于细菌培养的标本，尤其是白细胞减少的患者。油镜下观察细菌形态、排列和染色性，可初步推定菌属（或种），涂片中所见细菌的量及吞噬细胞内是否有细菌等。如发现酵母样菌、菌丝、孢子和放线菌或奴卡菌等，应予相应报告和按要求做相应的检查。,14,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,（三）分离培养,1痰标本培养前处理不含或含粘液很少的合格标本，可直接接种，遇有含大量粘液的标本，应加入等量的液化剂（如pH7.6的10g/L胰酶溶液等），放置35待充分液化再行接种。亦可加液化剂后用旋转混匀器搅拌混匀，3000r/min离心10min弃上清液，取沉淀物接种培养基。,15,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,2.一般细菌培养,（1）一般细菌培养应同时划区接种：1）血平板适用于分离肺炎链球菌和其他细菌。2）加抗生素的巧克力平板适用于分离嗜血杆菌。3）麦康凯/中国兰平板适用于分离革兰阴性杆菌。（2）分离培养血平板和巧克力平板需置5%CO2环境，麦康凯平板/中国兰平板，35孵育。,16,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,3挑取可疑菌落进行细菌鉴定和药敏试验，痰及下呼吸道分泌物标本易受到上呼吸道正常菌群的污染，临床微生物学实验室通常可从送检的呼吸道标本中分离出多种细菌，但分离细菌是否能真正代表下呼吸道感染的病原菌，这对临床诊断与治疗感染性疾病至关重要。实验室人员在检验过程中应重视判断所分离的细菌是污染的上呼吸道正常菌群还是引起下呼吸道感染的病原菌。在实际工作中，有时也由于细菌生长速度不一，如肺炎链球菌可能被生长速度快的细菌（包括正常菌群）菌落掩盖，不仔细观察就会忽略检验。,17,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,当在同一培养基上分离出多种病原菌（复合菌）时，应主动与临床医师联系，结合患者的临床症状、痰涂片染色镜检及近期细菌培养结果（如近期同一病人多次分离培养出同一种菌）等综合判断所分离的多种细菌中哪一种菌可能为优势病原菌。当分离优势菌与涂片染色镜检结果相符时，优势菌必需进行药敏试验。若分离培养结果与涂片染色镜检结果不相符时，或少量生长优势可疑病原菌时，也需做药敏试验，但在报告中提示，此结果请结合临床和涂片所见进行分析。痰及下呼吸道分泌物标本检验流程见下图。,18,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,图1痰及下呼吸道标本细菌学检验的操作流程,19,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,四、结果报告,（一）下呼吸道标本细菌学检验结果报告由于检验结果报告的时效性，下呼吸道标本细菌学检验结果分为初步和最终结果报告。1.初步报告应包括标本涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告（发现有诊断价值时应及时向临床口头报告，并作相关纪录）；(1)涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告,20,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,细菌学镜检的描述性报告：如镜检见到排列成葡萄状的革兰阳性球菌，可报告“找到革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；如见到瓜子仁形成矛头状端相背，成双排列，具有明显荚膜的革兰阳性球菌时，可报告“找到革兰阳性球菌，形似肺炎链球菌”；如见到不易识别的细菌时则报告“找到革兰性形细菌”；如检见其他病原菌应主动描述性的报告观察结果，并与临床联系和追踪进一步检查。(2)白细胞和鳞状上皮细胞计数的描述性报告：包括白细胞和鳞状上皮细胞数/低倍镜、细胞内有否含有细菌和胞内细菌染色及形态学特性。,21,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,2.最终结果,报告应包括送检标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告、分离致病菌的鉴定结果、药敏试验结果。,22,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,(1)痰标本涂片革兰染色后白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检未发现有临床诊断意义结果（可不用初步报告）：细菌分离培养为正常菌群时，最终检验结果应报告“正常菌群”生长。若无菌生长应报告经48小时培养无细菌生长，有意义的培养基(巧克力平板、血平板)，再置2天仍无生长可弃之。但对偶然分离的“优势可疑病原菌”，还需做药敏试验，并及时与临床联系，最终检验报告应包括标本肉眼观察结果，涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数及细菌学镜检的描述性报告，细菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果。但应提示所报告的结果请结合临床进行分析。,23,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,(2)标本涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检发现有诊断价值时，细菌分离培养检出优势菌，并与涂片染色镜检结果相符时，除及时初步报告外，最终检验结果应报告标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告、优势菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果等。细菌分离培养未检出优势菌，通常提示可能厌氧菌感染、大量应用抗菌药物、培养基及培养方法或送检标本保存和运送不当等原因。,24,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,附录,25,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,1放线菌及奴卡菌涂片检查：将痰液用生理盐水洗涤数次，然后挑取黄色颗粒（硫磺颗粒）或不透明的着色斑点，置载玻片上覆以盖玻片，轻轻挤压，置高倍镜下观察，如见中央为交织的菌丝，其末端较粗杆形呈放线状排列，揭去盖玻片，干后作革兰及抗酸染色镜检。（1）如镜检见有中间部份的菌丝为革兰阳性，而四周放射的末梢菌丝为革兰阴性，抗酸染色为非抗酸性菌，可报告送检标本肉眼观察的结果和细菌学镜检的描述性报告“直接涂片找到细胞内或细胞外大量或少量革兰阳性杆菌型似放线菌”。,26,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,（2）如镜检见有革兰染色反应及形态学特性与放线菌相似，但抗酸染色为弱抗酸性时可报告送检标本肉眼观察的结果和细菌学镜检的描述性报告“直接涂片找到细胞内或细胞外大量或少量似奴卡菌”。2结核分枝杆菌涂片检查与培养：见“操作规范”有关章节。3厌氧菌、真菌、支原体、衣原体等检验见“操作规范”有关章节。,27,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,4嗜肺军团菌检查(1)标本选择：以气管穿刺抽出液，胸腔液或肺、肝组织为好，最好不用痰标本。(2)标本处理：必须在生物安全柜内操作，操作者必须戴口罩及手套。液体标本：如胸腔液或气管穿刺液，不需处理，可直接接种到BCYE平板，血平板、巧克力平板。固体标本：如肺、肝、脾等需经处理，1份组织加9份磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.2)制成10%混悬液，如液体标本接种。环境标本：以冷气机之冷却水为标本，可取3-5升的冷却水以过滤法(用0.45m孔径滤膜)过滤后，将滤膜取出经酸液洗涤后，按上法接种。,28,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,(3)培养鉴定：将接种好的BCYE平板，血平板和巧克力平板，352-5%CO2环境培养，底部必须放湿纸巾，以防培养基干燥。每天检查培养基生长情况，如生长，革兰染色镜检，如无发现持续培养，直至2星期。如生长在BCYE平板，而不生长血平板，巧克力平板，可能为军团菌，应进一步鉴定。如生长在血平板，巧克力平板，则非军团菌。(4)直接涂片检查：以Dieterle镀银染色法染色，也可用改良革兰染色法(用Carbolfuchsin代替Safranhe作复染液)可得到甚好结果。,29,下呼吸道感染细菌学检验操作规范,(5)其他检查：有直接荧光抗体染色法(DFA)检查标本中抗原，ELISA、核酸探针及凝集试验等。5加抗生素的巧克力培养基：可在常用巧克力培养基中，加入万古霉素50mg/L、杆菌肽300mg/L(冷至55时加入)或至少加万古霉素和杆菌肽两者之一。亦有商品培养基供应，可选用。6半定量细菌