（应用化学专业论文）罗丹宁化合物与DNA的相互作用研究.pdf

硕士学位论文 摘要 本文在查阅了大量的关于小分子化合物与d n a 的作用的研究论文的基础上， 较系统的研究了罗丹宁衍生物p d b r 、q a r h 和c p a r h 等与绿豆d n a 的显色反 应，提出了用p d b r 、q a r h 和c p a r h 等测定d n a 的新方法。 1 研究了d n a 与p d b r 的显色反应。在p h 9 5 的n h 3 h 2 0 n h 4 c l 缓冲溶液 中，在阳离子表面活性剂c t m a b 的存在下，p d b r 与d n a 形成橙色复合物， 入m 畎为4 8 0n m ，表观摩尔吸光系数为1 3 2 1 0 7 l t o o l c m 一，d n a 含量在1 2 5 m g l q 7 5 0m g l d 范围内服从b e e r 定律，线性回归方程为a = 5 3 7 c + 0 0 0 4 ，相 关系数r = 0 9 9 6 ，相对标准偏差为2 7 ，用提出的方法测定了绿豆d n a 提取过程中 d n a 的产率，回收率实验表明，回收率为9 9 1 0 2 。摩尔比法求得在c t m a b 存在下d n a 对p d b r 的最大结合数为2 0 4 ，无c t m a b 存在时最大结合数为3 4 。 另外研究还发现无c t m a b 时，d n a 与p d b r 的结合反应符合s c a t e h a r d 模型， 结合常数为2 5 7 1 0 5l m o l 。首次揭示，表面活性剂促进d n a 与有机化合物的 相互作用。 2 研究了d n a 与q a r h 的显色反应。在p h 9 5 的n h 3 h 2 0 n h 4 c 】缓冲溶液 中，在阳离子表面活性剂c t m a b 的存在下，q a r h 与d n a 形成橙色复合物， 入。为4 9 0n m ，表观摩尔吸光系数为4 4 x1 0 7l m o l e m ，d n a 含量在1 o o m g l _ l 5 0 0m g l - l 范围内服从b e e r 定律，线性回归方程为a = 8 l c + 0 1 6 ：相关 系数r = 0 9 9 8 ，相对标准偏差为4 1 。所提出的方法可用于测定生物样品d n a 提 取液中d n a 的产率，回收率在9 9 1 0 2 之间。首次揭示，d n a 浓度不同，q a r h 与d n a 之间存在逐级结合反应，形成三种复合物，在第一级复合物中，d n a 对 q a r h 的最大结合数为6 4 5 ；在第二级复合物中d n a 对q a r h 的最大结合数为1 1 l ； 在第三级复合物中d n a 对q a r h 的最大结合数为3 0 。同时研究了第三级结合反 应的结合模式为p e s a v e n t o 模式。 3 研究了d n a 与c p a r h 的显色反应。在p h 5 8 的h o a e n a o a c 缓冲溶液中，在 有阳离子表面活性剂c t m a b 的存在下，c p a r h 与d n a 形成橙红色复合物，入m a x 为5 1 0r i m ，表观摩尔吸光系数为1 1 1 0 1l m o l c m 一，在此条件下测定d n a 的线性 范围为2 0 m g l q 1 0 m g l - 1 , 线性回归方程为a = 1 7 7 c + 0 0 9 ，相关系数为r = 0 9 9 7 ， 相对标准偏差为4 8 ，所提出的方法可用于测定植物d n a 提取过程中d n a 的产率， 回收率在9 7 1 0 2 之间。 4 在比较上述三种罗丹宁衍生物的结构及它们与d n a 复合物光度参数基础 上设计了新型罗丹宁衍生物，预测了可能的性质及其应用。 关键词：分光光度法；罗丹宁；对一二甲胺基亚苄罗丹宁；5 ( 8 喹啉偶氮) 一 罗丹宁；5 【2 ( 4 一氯苯酚) 偶氮卜罗丹宁；植物；d n a ；测定 罗丹宁化合物与d n a 的相互作用研究 a b s t r a c t a f t e rc o n s u l t e dm a n ya r t i c l e sa b o u ts m a l lm o l e c u l ec h e m i c a l si n t e r a c tw i t h d n a ，t h es p c c t r o p h o t o m e t r i cc h a r a c t e r i s t i c so fd n ac o m p l e xw i t hp d i m e t h y l a m - i n o b e n z y l i d e n e r h o d a n i n e ( p - d b r ) 、5 一( 8 - q u i n a l i n e a z o ) - r h o d a n i n e ( q a r h ) a n d 5 - 【2 一( 4 - c h l o r o p h e n 0 1 ) a z o r h o d a n i n e ( c p a r h ) h a v eb e e ns t u d i e d 1 i nap h 9 5n h 3 h 2 0 - n h 4 c lb u f f e rs o l u t i o n ，d n af o r m sa no r a n g ec o m p l e xw i t h p d b r i t sm a x i m u ma b s o r p t i o np e a ki sa t4 8 0n m w i t hm o l a ra b s o r p t i v i t yo f1 3 2x 1 0 7l m o l q c m - i b e e r sl a wi so b e y e di nar a n g ef r o m1 2 5 m g l 1t o7 5 0m g l t h e p r o p o s e dm e t h o di su s e df o rd e t e r m i n a t i o no fd n ai ne x t r a c t e dm u n gb e a nd n a s o l u t i o n t h em a x i m u mc o m b i n a t i o nn u m b e ro fd n ab o u n dt op d b ri s2 0 4i nt h e p r e s e n c eo fc t m a b ，a n dt h em a x i m u mc o m b i n a t i o nn u m b e ro fd n a b o u n dt op d b r w a s3 4i nt h ea b s e n c eo fc t m a b t h ei n t e r a c t i o no fd n aw i t hp d b ro b e y e d s c a t c h a r dm o d e l 2 i na p h 9 5n h 3 h 2 0 - n h 4 c tb u f f e rs o l u t i o n ，d n af o r m sa no r a n g ec o m p l e xw i t h q a r h i t sm a x i m u ma b s o r p t i o np e a ki sa t4 9 0 腿w i t hm o l a ra b s o r p t i v i t yo f4 4 1 0 7 l m o u t c m b e e r sl a wi so b e y e di nar a n g ef r o m1 0 0m g l “t o5 0 0m g 。l 一t h e p r o p o s e dm e t h o di sa p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no fd n a i ne x t r a c t e dm u n gb e a nd n a s o l u t i o n i ti sf i r s tf o u n dt h a td n af o r m st h r e ec o m p l e x e sw i t hq a r hw h i l et h e c o n c e n t r a t i o no fd n ai sc h a n g e d i nl s td n a q a r hc o m p l e x ，t h em a x i m u m c o m b i n a t i o nn u m b e ro fd n aw i t hq a r hw e r e6 4 5 ，a n di n2 - n d ，l ll ，a n di n3 - d ，30 t h em o d e lo ft h et h i r dc o m b i n a t i o no fd n aw i t hq a r ho b e y e dp e s a v e n t om o d e l 3 i nap h 5 8h o a c n a o a cb u f 诧rs o l u t i o n ，d n af o r m sa no r a n g e r e dc o m p l e x 谢t hc p a r h i t sm a x i m u ma b s o r p t i o np e a ki sa t510n mw i t hm o l a ra b s o r p t i v i t yo f1 1 1 0 7l m 0 1 - 1 c m 1 b e e r sl a wi so b e y e di nar a n g ef r o m2 0 0m g l t o1 0 0m g l 1 t h ep r o p o s e dm e t h o di sa p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no fd n ai ne x t r a c t e dp l a n td n a s o l u t i o n 4 an e wc o m p o u n di sd e s i g n e dn o to n l yb yc o m p a r i n gw i t ht h es t r u c t u r eo f p d b r 、q a r ha n dc p a r hb u ta l s ob yc o m p a r i n gw i t ht h e i rs p e c t r o p h o t o m e t i c p a r a m e t e r w ef o r e c a s ti t sp o s s i b l ec h a r a c t e ra n da p p l i c a t i o n t h i sc o m p o u n dh a sb e e n s y n t h e s i s e da n daf u r t h e re x p e r i m e n t a ls t u d i e si se a r r i n g k e yw o r d s ：s p e e t r o p h o t o m e t r y ；d n a ；p - d i m e t h y l a m i n o b e n z y l i d e n e r h o d a n i n e ； 5 - ( 8 一q u i n a l i n e a z o ) - r h o d a n i n e ；5 - 1 2 ( 4 c h l o r o p h e n 0 1 ) a z o 卜r h o d a n i n e ； d e t e r mi n a t i o n ；p l a n t n 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特另j j j j n 以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：漾水蓬 日期：) - o o s1 1 月斗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密固，在圣年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：京水疋 导师签名：群矽旁 矿，tvj e l 期：知眵年i1 月碑e 1 日期：沙亏年，月纱日 硕士学位论文 第1 章绪论 核酸与蛋白质是一切生物体最不可缺少的组成部分。核酸是生命遗传信息的携带者 和传递者，它不仅对于生命的延续、生物物种遗传特性的保持、生长发育、细胞分化等 起重要作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等密切相关，因此核酸是现代 生物化学、分子生物学和医学的重要研究对象之一f l j 。1 9 5 3 年w a s t o n j 和c r i c k f 提出 的d n a 双螺旋结构模型【2 3 】无疑是生物科学发展史上的一个伟大事件，它深刻地影响着 生物科学几十年的发展。今天我们对细胞遗传信息储存的认识和利用都离不开这一发 现。随着重组d n a 技术的建立和发展，随着人类基因组计划的完成【2 3 】和后基因组计划 的实施，有关d n a 与小分子化合物相互作用研究也越来越多【4 ，5 1 。许多小分子化合物影 响到基因的调控和表达。因此研究小分子化合物与d n a 的相互作用有十分重要的实际 意义1 6 】，一方面可作为生物探针建立测定d n a 高灵敏的分析方法，另一方面可以作为靶 向分子，研究其与d n a 的作用模式及生物活性之间的关系。 1 1 小分子化合物与d n a 相互作用的研究进展 研究小分子化合物与d n a 的作用是当今分子生物学、生物化学的热点。许多小分 子化合物包括小分子药物、金属配合物、染料探针、酶抑制剂等都能与d n a 发生反应。 影响小分子化合物与d n a 相互作用的因素很多，最重要的是小分子的分子结构，因此 探讨小分子化合物的结构与其对d n a 的识别模式和其生物活性之间的关系，对于设计 具有特定功能的d n a 靶向分子既有理论意义，又有实用价值。 1 1 1 金属配合物与d n a 的反应研究 无机金属离子配合物( 尤其是过渡金属离子配合物) 构成了d n a 靶向化合物的一 大类 7 1 ，这方面的研究起源于六十年代。 1 1 1 1 铂配合物 自6 0 年代r o s h e n h e r g 发现二氯二氨合铂( i i ) 的抗癌活性以来，有关顺铂及其 他具有类似结构的平面四边形铂配合物的抗癌活性研究一直非常活跃。大量研究 表明，这类药物的抗癌活性与其能和d n a 链共价结合并导致d n a 结构变化的能力 密切相关【8 ，9 1 ，进而导致这类抗癌新药的开发和利用。 1 1 1 2 金属卟啉配合物 金属卟啉是一类广泛存在于自然界中的生物活性物质。阳离子的四( 4 n 甲 基吡啶基) 卟啉( t m p v p ) 及其金属配合物比阳离子型卟啉对癌细胞的光动力效 1 罗丹宁化合物与d n a 的相互作用研究 应强，因而被当作与d n a 反应的模型化合物而广泛研究。研究表明，这类阳离子 卟啉不仅在癌症与肿瘤的光动力疗法中有诱人的应用前景，而且具有抗逆转录病 毒作用。一般认为，没有轴向配体的金属卟啉阳离子优先嵌入结合在5 - c g 3 序列 的碱基对平面之间【10 1 ，同时引起d n a 构象发生相应变化】；具有轴向配体的金属卟 啉阳离子因为有较大的空间阻碍，则以空间匹配及静电作用优先对螺旋小沟中连 续的a t 碱基对识别【1 2 】。除了中心金属离子、卟啉核上的取代基体积及卟啉的荷电 性以外，溶液的离子强度也是影响卟啉和金属卟啉与d n a 结合模式的重要因素。 1 1 1 3 其它金属配合物 d n a 与过渡金属如r u 、r h 、c o 的配合物相互作用的研究一直受到人们的重视。 许多r u 配合物具有的独特发光性能，使其成为研究d n a 性质的一种有效的光物理 和光化学探针 1 3 , 1 4 l 。因此某些d n a 序列特异性识别分子可以作为由基因突变所引 起的特殊的d n a 拓扑形变的结构探针，也可以作为诊断试剂。另外，许多r u 配合 物还可作为d n a 损伤的光敏剂。 其它与d n a 反应的金属配合物主要有d 氨基葡萄糖混配金属配合物【l5 1 、2 氯 代苯甲醛丙氨酸席夫碱类金属配合物16 1 、巯嘌啉金属配合物【17 1 、8 羟基喹啉与l a ( h i ) 、y ( i i i ) 、s c ( i i i ) 或a i ( m ) 等所形成的金属配合物【1 8 捌】、t b ( h i ) 邻菲咯啉配合物 2 2 , 2 3 】、四环素与e u ( i i i ) 或a i ( i i i ) 所形成的配合物【2 4 1 、t b ”钛 铁试剂( t r ) 配合物【2 5 1 以及氧氟沙星t b 3 + 配合物【2 6 】等，均有较深入的研究。 1 1 2 抗生素药物与d n a 的作用研究 1 1 2 1 多肽及蛋白质类抗生素 博莱霉素( b l m ) 是此类抗生素的代表，它是一种天然存在的糖肽，临床上 常被用来治疗头、颈及鳞状细胞癌。b l m 的抗癌活性被认为是f e 或c u 等具有氧化 还原活性的金属离子与氧同时存在的条件下，断裂d n a 所致。v a n d e r w a l l 等提出一 种新的模型，认为b l m 分子无需从d n a 链上解离，即可同时催化互补的双链被切 割。除b l m 外，人们从海洋生物中还发现了一系列高活性的抗癌肽，其结构多为 小分子环肽。它们不仅抗癌活性高，且稳定性好。 1 1 2 2 蒽环抗生素 此类抗生素的代表是诺加霉素、阿克拉霉素a 、阿霉素( a d m ) 、道诺霉素 ( d n m ) 等，其共同的特征是含有一个由3 个共平面的六元环所构成的四氢并四苯 醌发色团，它与d n a 的结合主要为嵌入结合和静电作用。 1 1 2 3 烯二炔抗生素 2 硕士学位论文 烯二炔是一类在临床与理论研究中都有很大价值的抗癌抗生素，此类抗生素 结构上的独特之处在于其分子中含有一个张力较大的烯二炔环，一个能与靶d n a 接近的引导系统，另有激发系统以激活并启动级联反应。研究表明这类抗生素通 过与d n a 序列特异性结合，进而引起s s 或d s d n a 的损伤，从而抗癌 2 7 , 2 8 】。新制癌 素( n c sc h o r m ) 是一种较早发现的此类抗生素的代表，此外还有d y n e m y c i na ， c a l i c h e a m i c i n ，e s p e r a m i c i na 及c 10 2 7 等。 1 1 2 4 乙撑亚胺型抗生素 此类抗生素是一类重要的烷化剂，丝裂霉素c ( m c ) 是这类抗生素的代表， 它在临床上是一种常用的重要抗肿瘤剂。研究表明m c 所具有的抗肿瘤能力及强细 胞毒性均与它和d n a 双链共价交联的能力有关。作为一种生物还原性烷化剂，m c 在与d n a 结合之前，必须经一还原活化过程，活化后的m c 先与d n a 结合，使之单 烷基化，然后产生双烷基化产物。研究表明，m c 在单烷基化d n a 时具有高度的序 列选择性【2 9 1 ，即优先与5 ，c g 和5 ，g g 序列上的鸟嘌呤结合。 1 1 3 除草剂与d n a 相互作用 新的除草剂尤其是以d n a 为靶向的除草剂的开发一直以来是农药工作者研 究的热点，张正奇等用紫外分光光度法和伏安法对苯噻草胺与植物d n a 的相互作 用进行了详细的研究【3 0 铷】，提出了用除草剂除草的新机理，苯噻草胺用于水田除 草，苯噻草胺在d n a 分子上堆积，抑制d n a 的复制而除草；用于旱地除草时，苯 噻草胺依靠苯并噻唑环嵌入d n a 双螺旋中，使双螺旋解链，阻止d n a 复制而除草。 同时还发现，水稻等作物对除草剂有解毒作用。 1 1 4 有机染料与d n a 的反应 有机染料与d n a 的反应一般用于定量测定d n a ，在此方面的报道较多，常用的 有中性红( z r ) 、甲酚红、苏木色精、茜素红、结晶紫、吖啶橙藏红t ，碱性品 红( r l ) 等，它们与d n a 的反应灵敏度高，选择性好。黄承志等对染料与d n a 的反 应机理已作深入研究。 1 2 小分子化合物与d n a 作用的研究方法及分析应用 1 2 1 光谱法 d n a 分子中的碱基具有光学活性，在2 6 0 n m 附近有强吸收。许多d n a 靶向分 子，或本身具有光学活性，或与d n a 结合后产生光学活性，因此用光谱法来考察 d n a 结合小分子化合物后结构上的变化，进而建立定量测定d n a 的方法，并研究 结合机理。在光谱法中，仪器价廉，操作简单，因而光谱法是非常有效和应用最 3 罗丹宁化合物与d n a 的相互作用研究 为广泛的方法。 1 2 1 1 紫外一可见分光光度法 紫外可见分光光度法是研究小分子化合物与d n a 相互作用最方便、最常用的 方法。许多小分子化合物与d n a 作用后引起吸收谱带变宽、吸收峰红移或蓝移、 增色或减色效应【3 4 1 ，尤其是当小分子化合物以嵌入方式结合在双螺旋碱基对之间 时，变化会更加明显【35 1 。因此可采用紫外光谱或可见分光光度法进行观察研究。 此方法在近十年来一直发展比较迅速，现简单介绍如下。 ( 1 ) 二苯胺法 在酸性溶液中，d n a 与二胺苯试剂作用形成蓝色复合物，舣为5 9 5 n m ，d n a 浓度在2 0 - 2 0 0 9 9 m l 1 范围内，吸光度与d n a 浓度成正比。 ( 2 ) 甲基绿法 在p h 7 9 的t r i s h c i 缓冲液中，将甲基绿与d n a 混合加热至4 5 。c ，3 h 之后，在 最大吸收峰6 3 0 n m 处测溶液的吸光度，吸光度与d n a 浓度成正比。 ( 3 ) 甲基胺蓝法【3 6 l 甲基胺蓝的水溶液在6 2 8 n m 处有一最大吸收峰，当有痕量d n a 存在时，d n a 与甲基胺蓝形成复合物，从而游离的试剂减少，导致最大吸收峰值减小，峰值减 小程度与d n a 浓度成正比，从而用于d n a 的定量测定。 ( 4 ) m e s o 四( 对羟基苯基) 卟啉( t h p p ) 法f 3 7 】 在p h 为4 9 5 4 的条件下，d n a 能与聚合态的t h p p 作用，产生不规则的电子吸 收光谱，当体系中含有3 0 乙醇，d n a 与t h p p 作用产生4 5 9 0 和7 0 0 0 r i m 两个新峰， 根据4 5 9 0 r i m 吸收峰可以测定o 2 - 5 0 m g l 。1 的小牛胸腺d n a 和o 2 - 6 0 m g - l 1 的鱼精 子d n a 。 ( 5 ) 乙基紫法 3 8 1 在p h 值6 4 7 4 的条件下，乙基紫的最大吸收波长为5 9 5 n m ，当加入d n a 后， 乙基紫的在最大吸收波长处的吸光度显著下降，根据吸收峰下降的程度可用于 d n a 的定量测定。 ( 6 ) 甲基紫法【3 9 1 在中性条件下，甲基紫的最大吸收波长为5 7 9 n m ，随着d n a 的加入，产生明 显的减色效应，且吸光度的变化与一定浓度的d n a 成比例，据此可建立测定d n a 的新方法。 ( 7 ) l a p h e n 法 4 0 】 在l a p h e n 溶液中加入d n a 溶液后，在2 2 7 2 n m 处产生一新峰，且使d n a 在 2 5 8 2 n m 峰移至2 6 2 7 n m 处，由此可以确定l a p h e n 与d n a 的碱基对发生了作用。 ( 8 ) 3 氨基6 二甲氨基2 甲基吩嗪盐酸( z r ) 法1 4 l l 4 硕士学位论文 在p h 为7 8 的缓冲溶液中，z r 与d n a 相互作用，生成红色配合物，此配合物 的最大吸收峰为5 2 0 n m ，反应前后的吸收光谱变化明显，配合物的吸收峰值红移 7 0 a m ，在一定的d n a 浓度范围内吸光度值与d n a 浓度成线形关系，据此建立了测 定d n a 的新方法。 ( 9 ) 喹哪啶蓝法【4 2 j 在p h 为5 o 8 2 的水溶液中，喹哪啶蓝在d n a 表面形成了h 聚集。随着d n a 的 加入，其在5 9 8 n m 处的吸收峰明显下降，且下降的程度与d n a 的浓度有关，据此 可建立测定d n a 的新方法。 ( 1 0 ) 维多利亚蓝b 法【4 3 】 在p h 5 5 6 5 的条件下，维多利亚蓝b 在6 1 6 n m 有最大吸收，随着d n a 的加入， 最大吸收波长处的吸光度明显下降，且随着一定范围内的d n a 浓度的增加，其吸 光度值有规律的下降，此现象可用来测定d n a 的量。 ( 1 1 ) c u ( i i ) t z a d m a b 法【4 4 】 在p h 为2 5 的条件下，在一定浓度的k n 0 3 介质中显色剂2 ( 2 ，3 ，5 三氮唑 偶氮) - 5 甲氨基苯甲酸( t z a d m a b ) 与c u ( i i ) 形成蓝紫色络合物，最大吸收 波长为4 8 0 n m ，在此条件下，t z a d m a b c u ( i i ) 配合物与脱氧核糖核酸能迅速 生成超分子化合物，使t z a d m a b 的吸光度迅速降低，因此利用c u ( i i ) t z a d m a b 配合物吸光度降低现象可以检测d n a 。 ( 1 2 ) 灿烂绿法【4 5 1 在p h 8 0 1 0 5 的条件下，灿烂绿( b g ) 在6 2 5 n m 处有最大吸收，随着d n a 的 加入，吸光度值显著下降，下降的程度与一定浓度的d n a 成线性关系，据此建立 了用b g 测定d n a 的新方法。 1 2 1 2 荧光光谱法 荧光光谱法是研究生物大分子与小分子或离子相互作用的重要的手段。荧光 分析法比分光光度法的灵敏度高，但由于d n a 的内源性光较弱，一般引入有机小 分子荧光探针来研究相互作用。它是基于荧光试剂的加入，导致溶液中荧光强度 的增强或猝灭来测定d n a 的。常用的荧光试剂有有机染料、稀土离子和过渡金属 配合物【4 6 1 。表1 1 汇总了以荧光分析法测定d n a 的常用体系。 1 2 1 3 圆二色光谱( c d ) 法 c d 是以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，一方面根据d n a 在2 6 0 n m 处的吸收能量提供有关其结构的信息，另一方面对一些本身虽然没有c d 信号，但 在与d n a 结合后能产生诱导c d 的分子，可获得一定的有关其结构的间接信息。王 云普等研究了水溶性高分子金属钴卟啉配合物与小牛胸腺d n a 的相互作用，由c d 5 罗丹宁化合物与d n a 的相互作用研究 图发现，当加入金属钴卟啉配合物时，d n a 的c d 图基线向负峰移动，正负峰之间 的差值减小，且正峰由2 6 9 n m 红移至2 7 7 n m ，而2 4 0 m n 的负峰也红移至2 4 3 n m 。表 明该金属钻卟啉配合物与d n a 发生了较强的作用( 金属卟啉配合物大的平面环疏 水结构和亲水基团的引入促进了这种作用) ，使d n a 发生变性。 表1 1 测定d n a 的荧光光谱法 1 2 1 4 拉曼光谱法 共振拉曼光谱( r r s ) 和表面拉曼光谱( s e r s ) 近几年来在d n a 复合物的结 构研究中应用较为普遍。该方法无论在均相递质还是多相递质都可以方便地应用， 并有可能提供多相微环境对其他分子与d n a 相互作用的影响。r r s 由于具有对生 色团振动的选择性及其对d n a 复合物结构的敏感性而广泛应用，而s e r s 贝j j 有效地 克服了r r s 无法对荧光分子干扰的化合物进行研究的缺点，而它们所有的短程增 强特性可用于d n a 复合物拓扑结构的研究【5 9 1 。叶勇等1 1 5 1 研究了d 氨基葡萄糖甘氨 酸混配金属配合物( m g i u g ) 与d n a 的作用，结果表明，在配合物一银胶体系加入 d n a 后，s e r s 光谱发生了变化一u g l u 与d n a 发生了配合物整体平面插入d n a 碱基对的作用，c o g l u g 与d n a 发生了配合物与d n a 磷酸氧的共价键合。 6 硕十学位论文 1 2 1 5 光散色技术 光散色技术是近年来发展起来的新技术，它是指光通过介质后在入射光以外 的各个方向观察到一种光辐射现象。1 9 9 3 年p a s t e r n a c k t 6 0 】首先用该方法研究生色 团在生物大分子的聚集作用，显示出高灵敏度和高选择性。在一定条件下，光散 射信号同生物大分子的浓度呈线性关系，可用于d n a 的测定，国内童沈阳研究小 组【6 i l 率先将该技术应用于生物大分子的测定，表1 2 汇总了近年来光散射技术在 测定d n a 方面的应用 6 1 表1 2 测定d n a 的光散射技术 1 2 1 6 核磁共振法 目前，一种新型的探索方法核磁共振法( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ， n m r ) ，开创了研究小分子配合物与d n a 相互作用的新阶段。核磁共振光谱在表 征药物与d n a 作用时，药物的构型和动力学性质的变化，通过观察药物与d n a 作 用时核磁共振光谱中谱峰形状和化学位移的改变，能够得到药物与d n a 键合类型 7 罗丹宁化合物与d n a 的相互作用研究 iii 和反应基团等信息。如1 h n m r 、p n m r p u 谱可用来研究配合物与d n a 反应的插 入位置、交换速率的大小、键合位点的特异性以及键合类型。杨铭等 7 9 】用1 h n m r 研究了环斑铂与d n a 的作用机制，用1 3 c n m r 研究了环方铂与d n a 的作用机制，揭 示了环方铂的作用是随着方酸根的离去，而形成了新的共价键，用此键与d n a 结 合，而环斑铂与d n a 的作用却无离去基团的存在，呈现了与传统顺铂完全不同的 结合方式。s a n d s t r o m i s o 】等用1 h n m r 研究证明诺氟沙星与d n a 的作用方式是嵌插 蚀厶 # 目口o 1 2 2 电化学分析法测定d n a 电化学分析法在研究d n a 的结构形态、碱基序列、d n a 损伤、基因诊断等方 面应用广泛，它作为光度分析法的补充，可以获得光谱法难以获得的信息，尤其 是对于一些主要通过静电结合模式与d n a 作用的分子，采用表面电化学方法可获 得许多其他方法无法得到的信息。这类方法通常是基于考察加入d n a 分子前后电 活性有机试剂的电化学性质的变化，如反应体系的电位变化、电流变化、扩散系 数的变化等电化学参数的差别【8 1 1 ，其主要是利用极谱和伏安技术，如直流极谱法 ( d c p ) 、交流极谱法( a c p ) 、微分脉冲极谱法( d p p ) 、循环伏安法( c v ) 、 线性扫描伏安法( l s v ) 、吸附溶出伏安法( a d s v ) 、吸附转移溶出伏安法( a d t s v ) 、 计时库仑法( c c ) 、阴极( 阳极) 溶出伏安法( c s v ，a s v ) 、方波伏安法( s w v ) 等。表1 3 列出了一些测定d n a 的电化学分析方法。 表1 3 测定d n a 的电分析化学方法 8 硕+ 学位论文 1 2 3 印迹法 印迹法是生物学中用来研究d n a 与药物分子相互作用的最基本手段。多数药 物与d n a 的结合是一种可逆的平衡方式的相互作用( 非共价结合) ，它们并不与 d n a 发生持久的结合，所以研究这类药物的结合点必须用d n a 印迹法。在该分析 法中用高分辨率的聚丙烯胺凝胶电泳可以获得药物与d n a 结合的热力学、动力学 数据以及药物与d n a 的精确结合点。1 9 8 6 年p h i l l i p s 和c r o t h e r s 发明了转录印迹法， 应用转录印迹法除了获得位点特异性动力学信息外，还可以测定药物较高的序列 特异性。利用这种方法，p h i l l i p s 等测定了放线菌素d 、偏端霉素、棘霉素、阿霉素 和诺加霉素的序列特异性。近些年对这种技术的研究已经扩展到了新的双向转录 印迹法，该方法可以高度精确地定位各个药物结合位点( - 4 - 1 个碱基对) 1 2 4 其他方法 药物分子与d n a 相互作用的研究还可采用色谱法，如h p l c 和c e 。x 射线晶 体衍射1 9 3 1 、微量热法【9 4 - 9 8 1 、平衡透析、黏度测定【9 9 1 、t m ( 解链温度) 测定、原子 力显微镜( a f m ) 、扫描隧道电镜( s t m ) 、质谱法等在该领域都有报道。 目前，质谱法在小分子d n a 结合物的结构分析中发挥独特的作用【1 0 0 , 1 0 1 ，m s 和m s m s 能灵敏、快速地获得小分子与d n a 结合位点数，结合区域以及非共价结 合方式，随着软电离技术的发展，l c m s 在核酸及其结合物的分析中应用增多【1 0 甜。 w a n g t l 0 3 】等用该技术研究发现药物d i s t a m y c i n 是小沟结合剂，小沟结合部位在a t 富 集区 一般，药物与d n a 相互作用的研究同时采用多种方法，相互补充，相互印证， 而不是单靠某一种方法。y a n g 1 0 4 】等通过测定d n a 双螺旋结构的变化，包括黏度、 3 1 p n m r 、c d 谱的测定及紫外光谱的减色效应和化合物环质子的1 h n m r 谱的变化 来阐明咔啉类衍生物与d n a 的结合方式，通过光谱法及微量热法测定了与d n a 的 结合强度。j fg o o s s e n s t l 0 5 】等采用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱、凝胶c e 的方法发现以d n a 为药靶的抗肿瘤药物溴化苯胺基喹啉衍生物以嵌插方式和d n a 相互作用。 1 3 罗丹宁衍生物用于分析试剂研究 罗丹宁衍生物，尤其是罗丹宁偶氮化合物，是七十年代发展起来的一类光度显色剂， 主要包括罗丹宁偶氮化合物、硫代罗丹宁偶氮化合物、3 取代罗丹宁偶氮化合物和硫代 丙酰罗丹宁偶氮化合物。这类试剂与贵金属离子如铂、钯、铑、钌、铱、金和银的显色 反应具有很高的灵敏度和选择性，到八十年代中期，俄罗斯科学家c a b b r f l a 发表了相关研 究论文二十多篇，近十多年来，我国的科研工作者在这方面也有深入的研究。 9 罗丹宁化合物与d n a 的相互作用研究 i 一 i i j _ 目e e l i l _ e i _ ( 1 ) 5 ( 4 卤素2 羧基苯偶氮) 罗丹宁与c u 的显色反应【1 0 6 j 在弱酸性时三种苯偶氮罗丹宁5 ( 4 氯2 羧基苯偶氮) 罗丹宁，5 ( 4 溴2 羧基苯偶氮) 罗丹宁，5 ( 4 碘2 羧基苯偶氮) 罗丹宁均与铜形成配位比为2 ：i 的 配合物其中5 ( 4 氯2 羧基苯偶氮) 罗丹宁与铜的显色反应在铜浓度为 o 2 5 肛g m l j 时符合比耳定律，此法可用来测定合金中铜的含量。 ( 2 ) 5 ( 4 氯2 羧基苯偶氮) 罗丹宁与银( i ) 的显色反应i l d 7 l 在p h 5 0 的缓冲介质中，该试剂与银形成黄色配合物，其配位比为a g ( i ) ： r = i ：2 ，摩尔吸光系数为1 1 1 0 5 l t o o l 1 c m 一。a g ( 1 ) 的浓度在0 2 0 9 9 m l 。的范 围内服从比耳定律，用该方法测定了阳极泥中银含量，结果满意。 ( 3 ) 5 ( 8 喹啉偶氮) 罗丹宁与a g ( 1 ) 的显色反应【1 0 8 l 在p h 5 0 的h o a c - n a o a c 缓冲溶液中，当有0 1 0 s l s 存在时，a g ( 1 ) 与q a r h 形成l ：l 配合物，x 为5 3 5 n m ，6 为1 0 5 x 1 0 5 l m o l - 1 c m 一，a g ( i ) 含量在 0 0 0 5 1 0 0 掣t g m l o 范围内服从b e e r 定律，稳定常数为i 7 9 x 1 0 1 5 。所提出的方法用于 精铜矿中微量银的测定，结果满意。 ( 4 ) 5 ( 2 ( 4 氯苯酚) 偶氮) 罗丹宁与a g ( i ) 的显色反应f i 叫 在p h 6 9 5 的n h 4 0 a c 缓冲溶液中，当有o 1 8 的s l s 存在时，a g ( i ) 与5 ( 2 ( 4 氯苯酚) 偶氮) 罗丹宁形成l ：l 配合物，九m 积为4 8 0 n m ，为1 o 1 0 5 l m o l q c m ， a g ( 1 ) 含量在0 0 11 5 4 0 1 1 9 m l 。1 范围内服从b e e r 定律。所提出的方法用于精铜 矿中微量银的测定。 ( 5 ) 5 ( 2 羟基3 。5 二硝基苯偶氮) 罗丹宁与钯( i i ) 的显色反应【u o l 在非离子表面活性剂t r i t o n x 1 0 0 存在下，于1 5 m o l l 。1 硫酸介质中，该显色剂 与钯( i i ) 生成稳定的橙色配合物，其最大吸收波长位于4 9 0 n m 处，摩尔吸光系数 为1 6 1 0 4 l t o o l l - c m 1 ，钯( i i ) 含量在o 3 2 1 1 9 m l 。范围内服从b e e r 定律，此法用 于催化剂中钯含量的测定。 ( 6 ) 5 ( 2 ( 4 氯苯酚) 偶氮) 罗丹宁与铂( i i ) 的显色反应【l 1 在h 2 s 0 4 h 3 p 0 4 介质中，当有表面活性剂c t m a b 存在时，该试剂与p t ( i i ) 形成有色配合物，k 甑为4 2 6 n m ，摩尔吸光系数为3 2 4 1 0 5 l t o o l - i c m ，p t ( i i ) 含量在4 0 0 1 0 9 9 m l 。1 范围内服从b e e r 定律。 ( 7 ) 5 ( 4 磺酸基苯偶氮) 罗丹宁与钯( i i ) 的显色反应2 j 在非离子表面活性剂t r i t o nx 1 0 0 存在下，于p h 5 8 的磷酸二氢钾氢氧化钠缓 冲溶液中，试剂可与钯( i i ) 生成2 ：1 的橙色配合物，其最大吸收波长位于4 6 0 n m 处，摩尔吸光系数为8 3 1 0 4 l t o o l 1 c m ，钯含量在0 1 0 l a g m l d 范围内符合b e e r 定律，此方法用于测定催化剂中钯的含量。 ( 8 ) 对氯苯酚偶氮罗丹宁测定微量钯【1 1 3 1 在磷酸介质中钯( i i ) 与对氯苯酚偶氮罗丹宁形成l ：2 的橙红色络合物，于 1 0 硕士学位论文 i 5 2 0 r i m 处有最大吸收，表观摩尔吸光系数为2 9 6 xl0 4 l m o l q c m ，钯的含量在 0 - 2 5 i _ t g m l 以范围内符合b e e r 定律，此方法用于钯碳催化剂中钯的测定。 ( 9 ) 5 ( 6 甲基2 吡啶) 亚甲基罗丹宁测定金【1 1 4 】 在p h 5 6 的醋酸醋酸铵缓冲介质中，在吐温8 0 存在下，该显色剂和a u ( ) 生成黄色产物，最大吸收波长为4 5 0 n m ，摩尔吸光系数为8 1 6 x 1 0 4 l m o l q c m ，a u ( ) 含量在o i 6 1 x g m l 。1 范围内符合b e e r 定律，该方法可用于矿石中金的测定。 ( 1 0 ) 5 ( 3 甲基2 毗啶) 亚甲基罗丹宁( m p m r ) 测定铂i l j 在p h 7 0 的醋酸铵缓冲介质中，在乳化剂o p 存在下，m p m r 与铂反应生成黄 色配合物，最大吸收波长为4 6 5 n m ，摩尔吸光系数为6 2 6 x 1 0 4 l m o l - ! c m 一，铂浓度 在0 2 1 x g m l 。1 范围内符合b e e r 定律，已用于精矿中铂的测定。 ( 1 1 ) 对磺酚偶氮罗丹宁与p d ( i i ) 的光度性质研究【1 1 6 l 在p h 4 1 0 的缓冲溶液中，当有质量分数为0 1 0 的t w e e n 8 0 存在时，p d ( i i ) 与对磺酚偶氮罗丹宁形成l ：2 的红色配合物，最大吸收波长为5 1 0 n m ，摩尔吸光系 数为3 8 l 1 0 4