（生物化学与分子生物学专业论文）高表达mnsod肝细胞模型的构建及应用.pdf

胁夕；z 学硕士靴论文高表达s 肝细胞模型的构建及应用 摘要 活性氧物质( r o s ) 是生物体内氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物的 总称，与细胞凋亡、细胞周期、信号转导，细胞分化、衰老等很多生理学现象密 切相关，一般被认为是具有有害和有利双重作用的过度的氧化应激将导致细胞 的坏死，而适度的氧化应激则诱导细胞增殖。r o s 处于一个动态平衡中是其行 使正常功能所必须，其中超氧阴离子( 0 2 。) 是胞内氧化压力的重要来源，并能 通过反应转化为其他各类r o s 。 作为活性氧的一种清除剂，超氧化物歧化酶能够催化超氧阴离子0 2 反应生 成h 2 0 2 和水，在降低胞内0 2 水平和胞内氧化压力起到重要的作用，尤其是位 于线粒体的m n - s o d ，是清除r o s 第一道防线，几乎任何癌的m n s o d 都明显 低于正常，而且也有研究表明m n s o d 可提高细胞对氧应激反应的耐受性。 在本研究中，我们通过转染含有m n s o d 的真核表达质粒进入肝细胞 h e p g 2 ，构建出高m n s o d 表达的肝细胞模型，证明m n s o d 在双氧水的刺激 下对线粒体活性存在保护作用，具有较高m n s o d 水平的细胞相对m n - s o d 缺 乏的细胞而言具有对双氧水的细胞毒性更好的抵抗作用。 此外，我们周流式细胞仪检测转染m n s o d 对细胞中r o s 水平和细胞周期 的影响，为了寻找m n s o d 抗氧化作用的具体信号通路，我们用w e s t e r n 检测了 a k t 的磷酸化的状态，用r t - p c r 检测了转录因子的表达水平。实验显示，m n s o d 的高表达抑制a k t 的磷酸化和降低氧化敏感转录因子c f o s e j u n 和p 6 5 的表达 水平，这些结果表明m n s o d 通过降低r o s 水平，调节a k t 的磷酸化从而抑制 转录因子c f o s e - j u na n dr , 6 5 的表达，终致抗氧化能力的提高。 关键词：活性氧；m n s o d ；肝细胞( h e p g 2 ) ；细胞色素c ；a k t 通路 一l v 加夕了z 掌硕士学位论文高表姗s 肝细胞模型的构建及应用 a b s t r a c t r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a r et h es e to fc e r t a i nm e t a b o l i t e so f o x y g e na n d p r o d u c t so fo x y g e nr e a c t i o n , w h i c hw e r ec l o s e l yr e l a t e dt oa p o p t o s i s ，c e l lc y c l e ， s i g n a lt r a n s d u c t i o na n dc e l ld i f f e r e n t i a t i o n ，a g i n g ，a n dm a n yo t h e rp h y s i o l o g i c a l p h e n o m e n o n s r o sa l ew e l lr e c o g n i z e df o rp l a y i n gad u a lr o l ea sd e l e t e r i o u sa n d b e n e f i c i a ls p e c i e s e x c e s s i v eo x i d a t i v es t r e s sw i l ll e a dt oc e l ln e c r o s i s ，h o w e v e r , a l l a p p r o p r i a t ed e g r e eo fo x i d a t i v es t r e s sw i l li n d u c et h ep r o l i f e r a t i o n ad y n a m i c e q u i l i b r i u mo fr o si sn e c e s s a r yi nt h ee x e r c i s eo fi t sn o r m a lf u n c t i o n s u p e r o x i d e ( 0 2 ) i sa ni m p o r t a n t s o u r c eo fi n t r a c e l l u l a ro x i d a t i o np r e s s u r ea n dc a nb e c o n v e r t e dt oo t h e rt y p e so fr o s a sas c a v e n g e ro fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s ec a l lc a t a l y s i s s u p e r o x i d e0 2 一t oh 2 0 2a n dw a t e r p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e d u c ei n t r a c e l l u l a r 0 2 - l e v e l a n d ，e s p e c i a l l yt h em n s o d ，w h i c hw a sl o c a t e di nt h em i t o c h o n d r i a , w a s f i r s td e f e n s ei st oe l i m i n a t er o s m n s o da r es i g n i f i c a n t l yl o w e ri na l m o s ta n y c a n c e r r e s e a r c hs h o w st h a tm n s o dm a yb ei n c r e a s e dt h et o l e r a n c eo fo x i d a t i v e s t r e s s i nt h i ss t u d y , w eh a v ec o n s t r u c t e dah e p a t o c e l l u l a rc e l lm o d e lw i t hh i g hl e v e l so f m n - s o de x p r e s s i o nb yt r a n s f e c t i n gc e l l sw i t he u k a r y o t i ce x p r e s s i o n p l a s m i d s c o n t a i n i n gs e n s eh u m a nm n s o de d n a a d d i t i o n a l l y , t h ep r o t e c t i v ee f f e c to f m n - s o do nm i t o c h o n d r i a la c t i v i t ya g a i n s tt h ec y t o t o x i c i t yo fo x i d a n th 2 0 2w a s e v a l u a t e d c e l l s 、析t l le l e v a t e dm n s o dl e v e l sw e r em o r er e s i s t a n tt ot h ec y t o t o x i c e f f e c t so fh 2 0 2t h a nm n s o d d e f i c i e n tc e l l s i na d d i t i o n ，r o sl e v e lw a sd e t e c t e db yf l o wc y t o m e t e r ；a k t p h o s p h o r y l a t i o nw a s a n a l y z e db yw e s t e r nb l o t t i n ga n dt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r se x p r e s s i o nl e v e lw a s m e a s u r e db yr t - p c rt of i n dt h es p e c i f i cs i g n a lp a t h w a y t h e s ef i n d i n g ss h o w st h a t o v e r e x p r e s s i o no fm n s o ds e l e c t i v e l yi n h i b i t e dt h ea k tp h o s p h o r y l a t i o na n d d e c r e a s er e d o x s e n s i t i v et r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r se x p r e s s i o ns u c ha sc f o s e j u na n d p 6 5 o v e r a l l ，t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tm n s o dr e g u l a t e sb o t l lc e l l u l a rr e d o xs t a t u s a n ds e l e c t i v e l ym o d u l a t e sa k ts i g n a l i n g ，t h e r e b yd e l a y i n gt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r s a c t i v a t i o na n di n h i b i t i n gc e l ln e c r o s i s , r e s u l t i n gi ni n c r e a s eo fo x i d a t i v es t r e s s r e s i s t a n c e k e y w o r d s ：r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ；m n s o d ；h u m a nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a s ( h e p g 2 ) ；c y t o c h r o m ec ；a k tp a t h w a y v a b b r e v i a t i o n 8u s e d a m p ： a m p i e i l l i n a p ： a m m o n i u mp e r s u l f a t e1 d h e ：d i h y d r o e t h i d i u m d m s o ：d i m e t h y ls u l f o x i d e e d t a ： e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d l c s m ：l a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p e m p s ： m o n o n u c l e a rp h a g o c y t i cs y s t e m m t t ： m e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u m o d ： o p t i c a ld e n s i t y p b s ：p h y c o b i l i s o m e sp h o s p h a t eb u f f e r p e ：h o s p h a t i d y l - e t h a n o l a m i n e p e g ：p o l y e t h y l e n eg l y c o l p i ：p r o p i d i n e i o d i d e p s ：p h o s p h a t i d y l s e r i n e r o s ： r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s o d ： s u p e r o x i d ed i s m u t a s e s d s p a g e ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝垫太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：i 移橱磊 签字日期：秽韶年莎月膨日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 逝婆太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙婆太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 瓣勇 导师签名 签字日期：矽g 年月肛日签字日期：跏矿年6 月，2 日 致谢 在这篇论文完成之际，首先感谢我的导师龚兴国教授。龚老师谦和沉稳、 儒雅豁达的学者风范，对学生在学习和生活上严师慈父般的关怀，使我终生难忘 两年的学习过程中，导师严谨认真的教学治学态度，广博深厚的学识、以及理论 与实践相结合的产业化发展模式，都对我教益良多 本文从课题的选择，技术路线的构思、实验工作的开展，到论文的撰写，都 得到了导师的指教，在此致以由衷的敬意和诚挚的感谢，愿我今后能以出色的成 绩来回报。 另外，本实验的进行，得到其他许多老师和同学的大量帮助。感谢刘珊林老 师的研究成果为我的课题开展提供了基础；感谢邓旭芳同学在课题合作中的做出 的努力；感谢卢敏博士，周亮博士、郦剑勇博士在实验思路和论文撰写中的指导 和帮助。同时实验室的其他同学都给了我很多的启发和帮助，他们是：汪辰卉、 赖宗腾、倪源、卢曼衍，秦勇、陈福鼎、张昕等，在此我向他们致以诚挚的谢意 和美好的祝愿。还有一起成长的室友、朋友们，即使在此疏于列出，但仍感恩铭 记于心。 最后，感谢我的父母及家人，是他们一如既往无私的支持，给予了我追逐梦 想的力量，及自由翱翔的勇气。 再次对所有支持帮助我的师长和朋友们致以真诚的谢意! 此致 敬礼 王智勇 2 0 0 8 年5 月于启真湖畔 加夕了z 掌硕士学位论文 第一章论文综述 前言 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 是生物体内氧的某些代谢产物和一些 反应的含氧产物的总称 1 】，起初人们认为，需氧细胞在代谢过程中产生的r o s 主要是使细胞坏死，随着研究深入，人们逐渐认识到r o s 还可作为重要的信号 分子，参与细胞信号转导，激活转录因子，影响基因的表达，从而介导细胞的 凋亡及促进细胞的增殖、分化【2 】m n s o d 是一种位于线粒体的清除自由基的 超氧化物歧化酶，是清除自由基的第一道防线。该节就目前关于细胞内r o s 的 主要种类、来源、生理作用中，胞内的动态平衡及调节因素作一简要介绍，并就 一种重要的r o s 清除剂m n s o d 的研究进展做一概述。 1 1 活性氧的种类与来源 1 1 1 种类 活性氧作为新陈代谢的产物广泛存在于生物体中，主要包括：( 1 ) 超氧阴离子 自由基h o o 、0 2 ；( 2 ) 羟基自由基，o h ；( 3 ) 过氧化氢h 2 0 2 , ( 4 ) 处于激发态的 氧、单线态氧、羰基化合物和不稳定的n o 自由基等【3 】 1 1 2 来源 生物体内的活性氧可来自环境( 外源性活性氧) ，亦可通过酶系统和非酶系统 产生( 内源性活性氧) 。炎症细胞可产生并释放活性氧，非炎症细胞在外界刺激或 内部细胞因子的刺激下产生活性氧细胞内产生活性氧的主要部位是线粒体，活 性氧的产生主要通过电子传递链、黄嘌呤黄嘌呤氧化酶途径，磷脂酶a 2 激活的 花生四烯酸代谢途径及精氨酸- n o 合成酶途径四条途径来实现【4 】 实验证明线粒体上的电子传递链的是细胞中产生活性氧的一个最主要的来 源，在胞内还原环境下，真核细胞呼吸链电子的传递过程，氧化生成h o 中，大 多数电子通过细胞色素氧化酶传递给艺，但是也有大约1 一2 的0 2 将在呼吸 链酶复合体i 和处泻漏的电子还原为r o s ，通过f e n t o n 反应生成氧化能力最 强的“o h 实验证明：当体内a t p 生成过多，呼吸链上电子传递受阻，会导致大 量r o s 生成加入呼吸链阻断剂如鱼藤酮、氰化物等，r o s 生成明显增多【5 】 这些都说明线粒体是产生r o s 的主要部位。但是由于线粒体内高浓度的s o d 存 6 即歹了z 鲈硕士学位论文 在，以及生成的0 2 一自身扩散出膜的能力差，所以只有少量形成的h 2 0 2 扩散入 胞浆，而使r o s 水平被控制在一个低而相对稳定的水平。另一方面，在正常状 态下，线粒体r o s 的生产速率受线粒体内跨膜质子梯度p h 和跨膜电位a y m 的调控：电子传递链中共有3 处引起质子泵作用，即复合物i 和，以及由复合 物i 、l i 、i i i 和辅酶q 组成的q 循环系统，p h 和v m 所蕴藏的能量供a t p 合成酶合成a t p , 这时膜外质子通过a t p 合成酶内流回到基质，于是a p h 和岬 都下降而抑制r o s 的生成【6 】。 此外，内质网( e r ) 也是细胞内另一个通过酶系统生成r o s 的膜性细胞器， 不同于线粒体，内质网主要参与脂肪和蛋白的合成，内质网中的细胞色素p 4 5 0 和b 5 家族通过氧化不饱和脂肪酸和外来生化物质生成0 2 一h 2 0 2 。而脂氧合 酶( l i p o x y g e n a s e ，l o x ) 和环氧合酶( c y c l o o x y g e n a s e ，c o x ) 是指细胞脂类 代谢中将花生四烯酸代谢为脂类过氧化物和r o s 的酶类【7 】目前作为细胞信号 研究的主要是c o x - 1 、c o x - 2 、5 - l o x 和1 2 l o x 。它们生成的r o s 以及r n s 单独或共同通过多种信号途径参与细胞葡萄糖摄取、受体活性和细胞因子释放等 活动。 1 2 活性氧的清除 1 2 1 生物抗氧化酶 生化抗氧的第一道防线，是通过酶促反应直接去除多余的分子氧，这就是承 担着胞内大部分分子氧去除功能的细胞色素c 氧化酶，它能通过四价还原反应 直接还原0 2 分子，而不释放任何活性中间物【8 】 但如前所述，活性氧是细胞正常生理代谢的必然产物，它们的去除依靠以 下诸多酶系：如超氧化物歧化酶s o d ( e c l 1 5 1 1 ) ，催化0 2 歧化为0 2 和水： 20 2 + 2 h + 一h 2 伤+ 0 2 此酶是已知酶中速率最快的酶之一，v m a x = , - - 2 x 1 0 9 m s 【9 】真核细胞中主要有位于胞浆、核、溶酶体中的c u z n s o d ( 2 m e r ) ；位于 线粒体中的r e f - 1 ( 4 m e r ) ；以及位于胞外的糖基化的c u z n s o d ( e c s o d ，4 m e t ) s o d 的抗氧化功能自7 0 年代末就有很多的实验证明 过氧化氢酶c a t ( e c l 1 1 1 6 ) ，催化2 h 2 0 2 - - - ，h 2 0 + 0 2 c a t 是人们最早 7 声所歹亨z 掌硕士学位论文 发现的酶之一，广泛存在于原核和真核生物中，有着古老的起源【1 0 】。由四个相 同的亚基组成，约2 4 0 k d a 。通常位于过氧化物酶体中，也在线粒体、胞浆中出 现。正常情况下在胞外体液中无c a t ，但当h i v 感染时会出现在入血清中 h 2 0 2 除了被c a t 分解外，还可以被过氧化物酶( p o x ) 分解：s h 2 + h 2 0 2 - - , s + 2 h 2 0 ( s h 2 代表还原性底物) ，当然p o x 顾名恩义还可分解有机过 氧化氢物( r o o h l o o h ) 。根据对还原性底物的选择不同，p o x 分为非特异 性过氧化物酶、细胞色素c 过氧化物酶、n a d h 过氧化物酶、抗坏血酸盐过氧化 物酶、谷胱甘肽过氧化物酶( g p o x ) 等。其中g p o x 催化r o o h + 2 g s h _ g s s g + r o h + n 2 0 ，是一种极少见的硒依赖酶【1 1 1 。k e s h a n 病是由于硒缺陷造成的退 行性心脏病，就与g p o x 活力低下相关。经典的g p o x ( e c l 1 1 1 9 ，4 m e r ) 存在 于胞浆中，也发现有胞外血浆中( p l g p o x ，糖基化蛋白，并无正常的g p o x 功能) 在以过氧化脂肪酸为底物催化时，经典g p o x 只能催化游离的过氧化 脂肪酸，所以需要磷脂酶a 2 先将过氧化脂肪酸从质膜上切下来 1 2 1 。但另有一 种可以直接作用于膜上的过氧化脂肪酸的磷脂单体g p o x ( p h g p o x ) ，它需 要更高的硒来维持活性。 谷胱甘肽转移酶g s t ( e c 2 5 1 1 8 ) 是一个多功能的酶家族，参与对异源物 质过氧化物等的结合、解毒。g s t p x 是指其过氧化物酶活性，催化2 g s h + r o o h - - , g s s g + r o h + h 2 0 。g s t 从细菌到脊椎动物普遍存在，真核细胞中分 布于胞浆及线粒体中，结构功能的研究将g s t 家族分为q 、肛、兀、0 四个亚族 1 3 1 。 各类活性氧清除酶是互相协调、互为补充的。如在豚鼠的肝、肾的胞浆中检 测不到g p o x ，但大量存在c a t 来清除h 2 0 2 ，同时由g s t p x 分解l o o h ，就 足以弥补g p o x 的缺陷；相反，大鼠肝中有很高的g p o x ，而没有c a t 1 4 。 1 2 2 生物抗氧化剂 逃脱活性氧清除酶的r o s 还会被一系列的生物抗氧化剂所捕获这些物质 “牺牲自己，顾全大局”，及时阻断自由基的链式反应，防止了其他生物大分子的 氧化其中脂溶性的有类胡萝卜素家族和维生素e 类，水溶性的有抗坏血酸( 维 生素c ) 、谷胱甘肽、和蛋白类的硫氧还蛋白、各类金属结合蛋白等 类胡萝卜素家族已发现有6 0 0 多种，其高度共轭双键系统能非常有效地清除 窖 加岁? z 鲈硕士学位论文 0 2 一，从而阻断脂类过氧化的链式反应。在正常生理条件的较低氧分压下，p 胡 萝卜素是最有效的( 1 3 _ 0 1 0 m s e c ) ，可防止低密度脂蛋白的氧化，在防止 或减缓动脉粥样硬化中起关键作用。类胡萝卜素广泛存在于各组织中，其中肝、 肾上腺、肾、卵巢、脂肪等组织中主要为p 胡萝卜素，而睾丸中主要是番茄红素， 视网膜斑区域含羟化胡萝卜素、黄体素和玉米黄质，却无b 胡萝卜素。这些组织 分布的不同提示着类胡萝卜素种类作用的专一性( s i e s e t a l ，1 9 9 2 ) 维生素e 包括生育酚和生育三烯酚，是保护细胞膜免受自由基损伤的主要抗 氧化剂。生育酚可被自由基氧化成生育酚自由基，再到生育酚醌。此外，生育酚 也是人低密度脂蛋白中的主要抗氧化剂【1 5 】。 抗坏血酸是血浆中最有效的水溶性抗氧化剂( 大概也正是其名称的由来原 因) ，直接淬灭自由基，并间接影响其他抗氧化系统【1 6 】。抗坏血酸盐抗坏血酸 具有很低的氧化还原电位( 0 2 8 2 m v ) ，所以几乎可以还原生物体内所有的自由 基。抗坏血酸的氧化可以是单电子传递，生成抗坏血酸自由基；也可以是双电子 传递，生成脱氢抗坏血酸( d h a ) 。抗坏血酸自由基和d h a 不稳定，可自发地 降解为无生物活性物质如二酮古洛糖酸。 肽蛋白类抗氧化剂主要有谷胱甘肽( g s h ) 和硫氧还蛋白( t r x ) 。g s h 由 丫谷氨酰半胱氨酸合成酶、g s h 合成酶连续催化合成，胞内浓度约o 5 1 0 m m 。 如前所述，g s h 是诸多活性氧清除酶的还原性底物，反应后生成氧化态谷胱甘 肽( g s s g ) 【1 7 】。胞内g s h 、g s s g 比例约为3 0 0 ：1 。t r x 是1 2 k d a 的小蛋白， 其保守序列( t r p c y s g l y p r o - c y s k s ) 中有两个半胱氨酸残基，可作为氢供体 还原其他蛋白中的二硫键，调节靶蛋白巯基的状态。 另一类蛋白类抗氧化剂是金属结合蛋白如转铁蛋白能高效结合铁离子，从 而阻断铁催化的自由基生成；白蛋白可以高效结合铜，阻断铜催化的自由基生成； 血浆铜蓝蛋白( c p e c l 1 6 3 1 ) 具有除了结合铜，参与铜离子的转运外，还具有 亚铁铜氧化酶活性，可以催化两价铁到三价铁、一价铜到两价铜的反应，而不 会有 r o s的产生： c p - c u ( i i ) 4 + 4 f c ( i i )_ c p - c u ( i ) 4 + 4 f e ( i i i ) ， c p c u ( i ) 4 + 0 2 + 4 i - i + - - * c p 一 c u ( i i ) 4 + 2 h 2 0 ，在阻断铁铜介导的脂类过氧化和o h 生成中起了重要作用。这三种抗氧化蛋白占了人血浆蛋白的4 此外还有金属 硫蛋白( m t s ) ，是一类低分子量的富含半胱氨酸的金属结合蛋白，从细菌到人 9 所歹# z 学硕t 学位论文 均广泛存在，可以结合铜、锌、镐、汞，防止重金属中毒。m t s 基因还能受r o s 的诱导而增强表达r 1 8 1 。 其它如尿酸、卵巯基蛋白c 等也具有生物抗氧化的功能。所有这些抗氧化 剂并非各自独立的，而是形成了一个彼此联系、相互协同的网络。例如生育酚和 b 一胡萝h 素在生物膜上协同作用，阻止脂类的过氧化；生育酚和抗坏血酸联合作 用则有效阻止人低密度脂蛋白的氧化【1 9 】。 图1 - 1 胞内活性氧的产生和清除 1 3 活性氧对细胞的调控作用 r o s 参与细胞多条信号通路和多个功能的调控，其确切部位尚未完全阐明， 目前越来越多的证据显示，r o s 可能通过改变细胞氧化还原状态或对蛋白质修 饰来调节信号转导通路中细胞膜到细胞核不同水平多种信号转导分子的活性，行 使其第二信使的角色【2 0 。 131r o s 对细胞内氧化还原状态的调控 相对于胞外环境，细胞内通常维持稳衡性还原态，这主要依靠g s h 和硫氧 还蛋白( t r x ) 这两种巯基氧化还原系统来维持【2 1 】。胞内还原态的g s h 和t r x 总是多于氧化恋，这些还原态的含巍抗氧化剂通过消除胞内h 2 0 2 、脂质过氧化 泐，z 掌硕士学位论文 物等r o s 来调节细胞内的氧化还原状态【2 2 】r o s 对氧化还原敏感的转录因子 的调节在很多情况下都是与细胞内氧化还原状态相偶联的如n f - r b 、a p 1 、 p 5 3 等转录因子都含有保守的c y s ，这些活性c y s 的巯基是直接调节基因表达的 开关。n f 一心是最早发现的与细胞氧化还原状态密切相关的转录因子静息状态 下，n f 1 由p 6 5 、p 5 0 和抑制亚基i - r d 3 组成，定位于胞浆，在外来信号的作用 下，i 1 出磷酸化并被蛋白酶体降解，n f r b 活化进入核与特异的d n a 结合，调 节其表达。研究发现，如用d i t h i o t h r e i t o l 预处理抑制t p a 引起n f r b 的活化， 应用g s h 抑制g r 后，这一效应被部分逆转，相反，在t p a 处理l h 后加入 d i t h i o t h r e i t o l ，n f r d 3 的活化效应得到增强，这提示n f 1 ( b 激活过程中从胞浆易 位至胞核存在氧化型向还原型转变【2 3 】。目前认为，n f r b 在胞浆与胞核不同氧 化还原状态时通过t r x 和g s h 参与调节的。同样，氧化应激或胞内g s s g 增高 引起转录因子a p 1 的活化，但抑制其与d n a 的结合【2 4 】。 1 3 2r o s 对细胞周期的调节作用 能否进入并完成细胞增殖周期决定着一个细胞的命运。细胞增殖周期在 g 1 s 和g 2 m 有两个调控点，特定的周期蛋白在这两个调控点上特异性表达， 与特定周期蛋白依赖性蛋白激酶结合成复合物，激活激酶活性，催化靶蛋白磷酸 化，通过一系列磷酸化与去磷酸化信号传导过程，刺激细胞开始s 期的d n a 合 成和m 期的细胞分裂，使细胞增殖周期越过这两个调控点，完成增殖。因此， 细胞增殖主要受周期蛋白依赖性蛋白激酶( c y c l i n - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e ，c d k ) 和周期蛋白的活性【2 5 】生长因子等细胞增殖因子促使细胞进入细胞增殖周期， 它们与细胞表面特异性受体结合后，激活细胞的第二信使系统，启动一系列级联 的信号传导过程，使细胞能够越过细胞周期的两个调控点，进行增殖现有充分 的证据显示一定生理浓度r o s 促进细胞增殖，如肝癌细胞、成纤维细胞、血管 平滑肌细胞等【2 6 】最新的研究表明，细胞停滞在g 1 期与细胞避免氧化损伤及 细胞死亡有关另一项研究显示，半致死剂量的h 2 0 2 导致老化的成纤维细胞长 期停滞在g 1 期，在成纤维细胞n i h3 i 3 细胞中，这一停滞只是暂时的【7 0 】。还 有研究表明，r o s 能够阻滞细胞周期使其停留在g 2 m 期。 总而言之，r o s 对细胞周期的调控是多重的，调控的结果与细胞种类、r o s 的种类、r o s 的水平以及某一水平下r o s 的作用时间有关【2 7 】对于无增殖能 胁夕z 掌硕士学位论文 力的细胞而言，低水平的r o s 短时间作用，可以引起细胞增殖。对于有增殖能 力的细胞，同样处理则能促进增殖。如果用低水平的r o s 持续作用有增殖能力 的细胞，则会导致细胞周期停滞在g l 期，细胞增殖受到抑制【2 8 】如果用高水 平的r o s 作用这些细胞，那么细胞周期可能会停滞在各个时期，尤其是g 1 和 g 2 期，最终导致细胞凋亡或坏死 1 3 3r o s 对蛋白的氧化修饰 大量在信号传导和基因表达调控中起着重要作用的蛋白都对胞内氧化还原 状态敏感，这些蛋白包括了细胞因子、受体、c e + 通道蛋白，激酶磷酸酶和转录 因子等。r o s 可以通过修饰蛋白中关键氨基酸的位点或者磷酸化状态来改变蛋 白质的结构与功能，从而参- 9 信号传导、基因表达调控【2 9 】。这里就r o s 调节蛋 白质磷酸化与脱磷酸化作简单阐述。蛋白质磷酸化是是细胞内信号转导过程中的 重要一环，是指由蛋白激酶催化将a t p 或g t p - ) , 位磷酸基转移到蛋白质氨基酸 残基上的过程，其逆过程是由蛋白磷酸酶催化的。研究较多的有s e r t h r 激酶 磷酸化酶和酪氨酸激酶磷酸化酶。丝氨酸蛋白激酶特异性地作用于s e r 或t h r 残基，是第二信使的主要靶蛋白，通过受体的信号传递，对多种细胞功能产生重要 影响。酪氨酸激酶仅作用于酪氨酸残基，主要介导生长因子刺激的信号传递【3 0 】。 外源性r o s 或细胞接受其它信号后产生的r o s 常会引起某些蛋白激酶或磷 酸酶活性的变化，从而激发一系列磷酸化、脱磷酸化反应的信号传递。如表皮生 长因子与其受体结合诱导生成h 2 0 2 激活蛋白酪氨酸激酶，而在同一刺激下生成 的0 2 一抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的活性，c h e n 等用萘醌作用于鼠肝质膜，使质膜蛋 白的酪氨酸磷酸化，提示活性氧参与醌诱导蛋白磷酸化。有关氧化剂抑制酪氨酸 磷酸酶的可能机制是酪氨酸磷酸酶活性位点有半胱氨酸，加入氧化剂后会抑制酶 活性【3 1 】。除了蛋白酪氨酸激酶蛋白酪氨酸磷酸酶外，r o s 的某些信号传导过 程中还激活p k b 、p k c 和m a p k 来实现p k c 能被r o s 调节是由于其调节亚 基中的巯基对氧化压力敏感，低浓度的r o s 使酶活化，而高浓度则可使酶灭活，上 述作用可用二硫苏糖醇逆转s t e v e n s o n 等研究h 2 0 2 、电离辐射及佛波酯处理的 n i h 3 t 3 细胞，丝裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 被活化佛波酯对m a p k 的活化作 用能被抗氧化剂拮抗【3 2 】。 1 2 却夕z 掌硕士学位论文 1 3 4r o s 调控细胞凋亡 细胞凋亡( a p o p t o s i s ，a p o ) ，又称程序性细胞亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ， p c d ) ，是指由细胞基因控制的一种自主性的自杀现象它不仅与细胞增殖、分 化、衰老、癌变及个体发育具有重要的意义过度的细胞凋亡或凋亡不足，均能 导致疾病。过度的细胞凋亡将致使器官萎缩及器官衰竭，引起神经系统疾病、病 毒性肝炎及老年性进行性病理过程等；而细胞凋亡不足，将会导致肿瘤、自身免 疫疾病、病毒感染以及先天性畸形等。而且与许多病理过程有紧密联系凋亡的 基本过程( 1 ) 决定死亡：细胞自杀受许多细胞内外因素的影响，例如死亡受体的激 活、生长因子的撤走、d n a 受损、代谢和细胞周期紊乱等可激活细胞死亡中心 信号，使细胞作出自杀决定。( 2 ) 执行死亡：执行死亡可能始于i l 1 p 转换酶或类 似的半肤氨酸蛋白酶的激活，进而激活细胞核内的一种c a 2 + m 9 2 + 依赖性内切核 酸核酶，使d n a 在核小体之间的连接处被切断( 3 ) 残体清除：死亡的残体可被 邻近的巨噬细胞或有核的实质细胞清除；或先裂解为两个或多个由完整的膜包裹 的球形小体而被邻近的细胞吞噬和消化【3 4 】。 g e o r g e 等则把细胞凋亡的过程分为4 个阶段：相应的受体感受器和活性因 子表型的表达；暴露于诱导原；发生细胞凋亡；凋亡小体形成并被吞噬。 细胞凋亡过程全程仅耗时数分钟至几小时。此外，因能量代谢和能量产生未 发生障碍，跨膜渗透压仍能维持，故膜相对完整，细胞内容物不泄露到膜外，不 引起炎症反应。细胞凋亡是由一系列有序的细胞内级联反应导致的。这也正是凋 亡细胞特有的形态学变化的分子基础。来源与细胞内外的信息，通过多种信号传 导通路决定细胞凋亡的发生目前认为凋亡过程中一般经过两条途径，一条是死 亡受体途径，由细胞表面受体启动，直接激活下游c a s p a s e ，这些受体属于肿瘤 坏死因子神经生长因子( t n f n g f ) 受体超家族另外一条途径是线粒体介导 的通路，通过线粒体释放c y t c ，间接激活下游c a p s i z e 3 5 已有研究发现，当增加r o s 刺激可诱导细胞凋亡目前已经发现主要的细 胞凋亡信号传导途径，一条途径是受体f a s 、t n f 受体途径，由相应的配体f a s l 、 n 师a 诱导，引发c a s p a s e - 8 和c a s p a s e 1 0 作为最上游启动酶的c a s p a s e 级联反 应另一条则是线粒体途径，在r o s 等凋亡信号子的诱导下，早期即出现线粒 1 3 胁夕z 掌硕士学位论文 体膜通透性改变，线粒体内膜跨膜电位降低，细胞色素c 及凋亡诱导因子( a i f ) 释放进入胞浆，引发胱冬肽酶一9 ( c a s p a s e 9 ) 激活及c a s p a s c 级联反应；这两 条途径都与r o s 密切相关，也就是说r o s 参与了细胞凋亡信号调控。具体表现 在：1 ) 许多因素诱导细胞凋亡的信号传导过程产生r o s ；2 ) 加入一定浓度的 r o s 或耗竭细胞内抗氧化剂可诱导体外培养细胞凋亡；3 ) 适量抗氧化剂抑制多 种因素诱导细胞凋亡；4 ) 某些凋亡抑制因素通过抑制r o s 发挥作用。 m a c h o 等在研究胸腺细胞凋亡机制中发现，早期凋亡细胞胞内g s h 下降和 r o s 含量轻度升高。后者进一步引起n a d h 和n a d p h 下降，产生大量超氧阴 离子自由基。在凋亡过程中，r o s 既是促发和加速线粒体膜通透性转运孔( m p t ) 开放重要效应分子，又是m p t 开放的产物。这种正反馈机制使m p t 开放具有自 我放大效应和“全”或“无”的特点，使线粒体线粒体跨膜电位( 、i ，m ) 的下降进入不 可逆过程，细胞发生凋 f f 3 6 。 1 3 5r o s 对转录因子活化的刺激作用 信号转导可通过信号对d n a 的直接作用来调节基因转录。一般来讲，信号传 递到转录元件的过程中，有一类称为转录因子的蛋白参与，转录因子可以与特异的 d n a 序列结合，调节r n a 聚合酶i i 活性。r o s 对一些哺乳类转录因子有一定 的调节作用 a p 1 是一种重要的细胞增生和肿瘤促进的核转录因子，是目前肿瘤研究的焦 点。a p 一1 能与d n a 中的佛波酯( t p a ) 响应位点( 1 1 也) 结合，对诱导p k c 活化的 基因起作用，它由c f o s 和c o u r t 异二聚体蛋白组成，c f o s 和c j u n 是原癌基因c - f o s 和c - j u n 的表达产物。m a l 【i 等在大鼠表皮细胞研究中发现，0 2 。对黄嘌呤黄嘌呤 氧化酶诱导c f o s 表达的作用比h 2 0 2 更强【3 7 】。相反，r a t ) 等则证实在大鼠平滑 肌细胞中h 2 0 2 对于c f o s 表达的作用更大 另有研究发现，在一些细胞系中h 2 0 2 和l p o 可活化n f r b 转录因子，并能 促进h i v - l t r 指导的霉素乙酰转移酶受体基因的表达。 1 3 6 活性氧对不同信号分子的影响总结如下 1 4 却歹了z 旁硕士学位论文 表1 1 活性氧对细胞信号分子的影响 | 信号分子 氧化作用 下 1 蛋白质酪氨酸激酶e g f 受体，胰岛素受体，p d g f 受体，i 激活 s r c ，l c k ，f y n ，z a p 7 0 ，s y k ，l y n ，f g r , h c k ，b t k ，l t k 2 蛋白质酪氨酸磷酸酶 失活 。一一一 3 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶m a p k ，j n k ，p 3 8 ，b m k l ，a k t ，s 6 1 激酶p k c 激活 。一：一： 一：二：t ：= ：= 二：_ 二?= “ 4 蛋白质丝氨酸苏氨酸磷酸酶p p l ，p p 2 a ，钙调磷酸酶失活 5 小g 蛋白r a s激活1 6 脂类信号通路p l c ，p l d ，p l a 2 ，p i3 一激酶激活； 7 c a 2 + 通路肌醇三磷酸受体，r y a n o d i n e 受体，c a 2 + - a t p a s e ， c a 2 + n a + 交换蛋白 激活 8 转录因子a p l ( c f o s ，c - j u n ) ，n f r , b ( p 5 0 ，r e l ) ，u s f , t t f 1 ， g r ，b r v l e 2 ，n f i ，m y b ，n f yp 5 3 ，p e b p 2 a m l ，o c t 2 ，e g r - 1 ，失活 b z l f l ，e t s ，g a b p , a h 受体，a t f , c r e b ，k u 1 5 胁夕，z 穿硕士学位论文 甾 r o s 对细胞命运的影响一网吻烈 气：峄、k | 妊麓添锄张魄踟池e r 蟛 | 氟零手- i | 阍水平- 高水平： 垂ll 促遂有丝分袭生长停雳细l 冤謦 | 基因表警水平 桃 舞亡鳝死 存活r 1 死亡 图1 2 r o s 对细胞命运和基因表达的影响 1 4 活性氧在细胞内的动态平衡 由于不同胞外刺激引起胞内r o s 产生的部位不同，导致的信号通路以及相 应的生物学效应不同( 如表1 1 ) ，但不同的细胞和不同的应激因素下，r o s 对 各种信号通路的调控具有特异性，从而导致不同的生物学效应改变。细胞内r o s 和生理活动是一个相互制约调节的过程，当细胞内的r o s 水平上升时，细胞反 馈调节r o s ，使其恢复到正常水平。如磷酸酶可能在r o s 引起m a p k 介导的磷 酸化激活过程中起反馈调节作用【3 9 。 表1 - 2r o s 产生部位、有关信号通路及相应生物学变化 1 6 胁夕多z 掌硕士学位做 1 5m n s o d 对活性氧的清除作用 生物体内的超