基因操作原理.ppt

第二章基因操作的主要技术原理,核酸的凝胶电泳扩增原理分子杂交测序,核酸的凝胶电泳它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。,基本原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快,凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间,琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。,LMP琼脂糖熔点：6265熔解后，在37可保持液态数小时；在25可保持液态约10min,回收DNA分子在65下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液；直接酶切,琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1TAE（TBETPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小加DNA样品：1g，指示剂电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05g的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比,SeparationRangeVs.%Agarose,LowGelingAgarose4-60.02-0.4,用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算,SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,AgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:5-10ngDNA,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小,Agarosegelelectrophoresis,Agarosegelelectrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（10）。,PolyAcrylamideGels,脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。,在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。107bp的DNA大分子。,PFGEcanresolvelargeDNAfragments,基因扩增（geneamplification）主要内容：1.体外扩增2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增5.进化过程中的基因扩增,PCR技术在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。,ReactionConditionforaTypicalPCRAssay,TypicalPCRThermalProfile,*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength,SomeDNAPolymerasesUsedinPCR,CharacteristicsofTaqPolymerase,PCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在1530个核苷酸之间。2.简并引物atggctant3.嵌套引物PCR扩增的长度：腺嘌呤(A)的N3410倍,在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。,CS载体系统：末端标记载体核酸内切酶Th111特点：1.产生5单碱基的突出末端，便于标记；2.Th111位点十分稀少；3.5突出末端可以是G或A，也可以是T或C，选择性强；4.在载体中具有两个Th111位点，可对克隆在载体上的片断任何一段作选择性标记。,化学修饰法的优点：1.不需要体外酶切；2.只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。250个bp限制因素：测序胶的分辨率,DNA测序分析的自动化用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来,DNA杂交测序（sequencebyhybridization）SBH原理：如果一段短的DNA探针能够与较长的靶DNA片断杂交，并形成完全的双链体分子，那么我们便可以根据此来推断在靶DNA序列长存在着相应的互补序列。,步骤：1.将待测的靶DNA分子与一组已知核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交2.对能与待测DNA杂交的探针之间的碱基重叠关系作比较分析，据此推算靶DNA的核苷酸序列。,两种操作方式：1.将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交2.应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法,杂交的检测：磷光成像仪和图象分析软件错配的碱基会导致杂交信号强度下降。6mer500bp7me