（水产养殖专业论文）三种鯻科鱼类的遗传多样性研究.pdf

三种剿科鱼类的形态学与遗传多样性研究 摘要 实验以三种蜊科鱼类为研究对象，研究内容包括形态学与框架结构分析、同工酶 组织特异性及群体遗传结构分析和m t d n a 控制区( d 1 0 0 p ) 核苷酸序列变异研究，结果 如下： 1 形态学与框架结构分析：运用传统形态学方法和框架比例数据分析法分析了 细鳞蜊、蜊和列牙蜊的形态差异。可数性状中，腹鳍和臀鳍的鳍条和鳍棘数在3 种蜊 中都一致，鳃耙数和侧线鳞数差别比较大，较适用于准确分类。对可量性状比例参数 进行m a n n - w h i t n e yu 检验显示细鳞鲥和蜊的相似程度大于它们各自与列牙鲥的相 似程度。利用聚类分析、判别分析、主成分分析的方法对可量性状的比例参数的进行 了分析。聚类分析显示：细鳞蜊和蜊首先聚为一支，列牙蜊独立为另一支。以判别分 析建立的判别函数，对三个不同种类的蜊科鱼类的判别准确率p 1 、p 2 均为9 8 1 0 0 ， 综合判别率为9 8 7 。主成分分析显示：数据和框架数据等3 6 项形态比例参数中， 尾部和头部的比例参数对各种群间的差异贡献率最大。 2 同工酶组织特异性及群体遗传结构分析：实验采用聚丙烯酰胺垂直板不连续 电泳法对3 种蜊科鱼类6 种组织( 脑、眼、心、肾、肝、和肌肉) 的9 种同工酶( a d h 、 e s t 、g d h 、l d h 、m d h 、m e 、p o d 、s d h 、s o d ) 进行分析，结果显示具有明显 组织特异性。此外，对每种鱼4 0 个个体的肝脏的7 种同工酶进行群体遗传结构分析， 共记录1 5 个基因位点，其中呈多态性的基因位点有2 个( m p o d 1 、s - s o d 1 ) ，多态 座位比例( p ) 为0 1 3 3 ，位点平均有效等位基因数( a e ) 分别为1 0 0 4 、0 9 9 7 和1 0 1 5 ， 平均每个位点预期杂合度( h 。) 值分别为0 0 6 8 、0 0 6 6 和0 0 4 5 ，平均每个位点实际 杂合度( h o ) 值分别为0 0 9 8 、0 0 8 3 、0 0 8 。与其它鱼类研究结果相比较，表明三种 蜊科鱼类的遗传多样性居于中等水平。 3 m t d n a 控制区( d 1 0 0 p ) 核苷酸序列变异研究：对三种蜊科鱼类4 4 个个体的线 粒体d n a 控制区进行了p c r 扩增并测序( g e n b a s e 登录号：f j 7 9 7 5 1 7 f j 7 9 7 5 6 0 ) ， 获得三种蜊科鱼的碱基序列长度) 白8 5 6 b p ( 细鳞蜊) 、8 8 4 b p ( 蒯) 、8 7 7 b p ( 列牙鲥) 。 比较分析三种蜊科鱼的序列显示：群体核苷酸多态位点分别为：细鳞蜊1 1 5 个、绷6 6 个、列牙蜊2 0 0 个，平均核苷酸差异系数分别为2 7 、1 4 0 8 0 8 8 和4 4 8 2 4 1 8 ，其它多态位 点和遗传多样性的参数也被测定并分析。通过软件拼接获得了3 种蜊科鱼类的线粒体 d n a 控制区全序列，对比其他已报道鱼类控制区的结构识别序列，对3 种蜊科鱼控制 区的结构进行了分析，识别了终止序列区、中央保守区和保守序列区，找到了d n a 复制终止相关的序列e t a s 和中央保守区的保守序y ) j c s 8 f 、c s b e 、c s b d 以及保守 序列区的保守序列c s b l 、c s b 2 、c s b 3 。并给出了它们的一般形式，同时在蜊和列 牙蜊控制区的37 端发现重复序列。利用控制区核苷酸序列构建的n j 个体聚类树中， 三种蜊科鱼类能很好的独立成族，蜊与列牙蜊聚在一起，细鳞蜊单独成一支。综合研 究结果表明，三种捌科鱼类具有较高的遗传多样性，蜊与列牙蜊的亲缘关系相对较近， 与传统按外部表形分类的结果不一致。 关键词：蜊科鱼类；形态学；框架结构；同工酶；控制区；遗传多样性 m o r p h o l o g ya n dg e n e t i cd i v e r s i t yo f t h r e es p e c i e so f t h e r a p o n i d a e a b s t r a c t t i l i sp a p e rs t u d i e st h em o r p h o l o g ya n dt r u s sn e t w o r k s ，t h et i s s u e - s p e c i f i c i t i e so f i s o z y m e sa n dt h eg e n e t i cs t r u c t u r ea n dt h eg e n e t i cd i v e r s i t yr e v e a l e db ym t d n ad l o o p s e q u e n c eo ft h e r a p o n i d a ei ns u r r o u n d i n gs e aa r e ai nz h a n j i a n g 1 1 1 er e s u l ts h o w sa s f o l l o w s ： 1 t h ea n a l y s i so fm o r p h o l o g ya n dt r u s sn e t w o r k s ：t r a d i t i o n a lm o r p h o l o g i c a ld a t a a n dt r u s sn e t w o r kd a t aw e l ec o m b i n e dt os t u d yt h em o r p h o l o g i c a lv a r i a t i o n sb e t w e e nt h r e e p o p u l a t i o n so ft h e r a p o n i d a e n er e s u l t sa 托s h o w e dt h a t ：a sc o u n t a b l ec h a r a c t e r s ，t h e n u m b e r so f p e l v i cf i na n da n a lf i n ，ss p i n e sa n dr a y sw e r ec o n s i s t e n ti nt h e s et h r e es 帜i e s ， a n dg i l lr a c k e r sa n dl a t e r a ll i n es c a l ei nw h i c hah i g hs i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e e d 1 1 1 em a n n w h i t n e yut e s ta n a l y s i so fm e a s u r a b l ec h a r a c t e r ss h o w e dm o r es i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sb e t w e e nr j a r b u aa n de q u a d d l i n e a t u sa n db e t w e e nt t h e r a i ma n d e q u a d r i l i n e a t u s ，t h a n d i f f e r e n c e sb e t w e e nt j a r b u aa n dt t h e r a p s c l u s t e r a n a l y s i s ， d i s e r i r n i n a n ta n a l y s i sa n dp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sw e r ea p p l i e dt ob a s eo n3 6 p r o p o r t i o n a lp a r a m e t e r so ft h em e a s u r a b l ec h a r a c t e rd a t aa n dt h et r u s sn e t w o r kd a t a , a n d t h ee u c l i d e a nd i s t a n c e sb e t w e e na n dw i t h i nt h e s et h r e ep o p u l a t i o n so ft h e r a p o n i d a ew e r e a l s oc o m p u t e d n er e s u l t so fc l u s t e ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h et h r e ep o p u l a t i o n sw e r e c l u s t e r e di n t ot w og l a d e s n ef i r s tg r o u pi n c l u d e dp o p u l a t i o n so ft j a r b u aa n d t t h e r a p s ，a n o t h e rw a s t h ee q u a d r i l i n e a t u sp o p u l a t i o na l o n e d i s c r i m i n a n ta n a l y s i si n d i c a t e d t h a tt h ei d e n t i f i c a t i o na c c u r a c yo ft h ed i s c r i m i n a n tf u n c t i o n so ft h e s ep o p u l a t i o n sw e r e 9 8 - 1 0 0 ( p 1 ) a n d ( p 2 ) ，a n dt h e t o t a ld i s c r i m i n a n t a c c u r a c yw a s9 8 7 p r i n c i p a l c o m p o n e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec o n t r i b u t i o no ft h ed a t ao ft a i la n dh e a dt ot o t a l v a r i a n c e sw e r et h em o s ta m o n gt h e3 6p r o p o r t i o n a lp a r a m e t e r sm e t r i cc h a r a c t e r sa n dt r u s s n e t w o r k 2 t h ea n a l y s i so ft h et i s s u e - s p e c i f i c i t i e so fi s o z y m e sa n dt h eg e n e t i c 蛐m c t u r e ： h o r i z o n t a ls t a r c hg e le l e c t r o p h o r e s i sw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h et i s s u e - s p e c i f i c i t i e so f i s o z y m e sa n dt h eg e n e t i cs t r u c t u r eo ft h e r a p o n i d a e 1 1 1 ep e r f o r m a n c e so f9i s o z y m e s ( a d h ，e s t ，g d h ，l d h ，m d h ，m e ，p o d ，s d ha n ds o d ) i n6k i n d so ft i s s u e s ( b r a i n ，e y e ，h e a r t ，k i d n e y , l i v e r , m u s c l e ) i nt h r e es p e c i e so ft h e r a p o n i d a ew e r es c r e e n e d a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es c r e e n e di s o z y m e s d i s p l a y e dr e m a r k a b l et i s s u e - ! i i s p e c i f i e i t i e s b e s i d e s ，7e r t z y m e sf r o ml i v e rt i s s u e sw e r es e l e c t e df o rt h eg e n e t i ca n a l y s i s 1 1 1 ea n a l y s i sw a sc o n d u c t e do n4 0i n d i v i d u a l s t h e7i s o z y m e ss y s t e m sw e r ee n c o d e db y 15l o c i ，a n d2 ( m - p o d la n ds - s o d - 1 ) o ft h e mw e r ep o l y m o r p h i c n l ep r o p o r t i o no f p o l y m o r p h i cl o c iw a so 13 3 t h ea v e r a g ee f f e c t i v en u m b e ro fa l l e l e s ( a e ) i s1 0 0 4 ( t j a r b u a ) ，o 9 9 7 ( a tt t h e r a p s ) ，1 015 ( a te q u a d r i l i n e a t u s ) a n dt h em e a ne x p e c t e d h e t e r o z y g o s i t yp e rl o c u s ( h e ) a n dt h em e a na c t u a lh e t e r o z y g o s i t yp e rl o c u s ( h o ) a r e 0 0 6 8 、0 0 6 6 、0 0 4 5a n d0 0 9 8 、0 0 8 3 、0 0 8 t h e s ed a t ai n d i c a t e dt h a tm i d d l el e v e lo f g e n e t i cv a r i a t i o ne x s i t e di nt h e r a p o n i d a e 3 t h es t u d yo fg e n e t i cd i v e r s i t yr e v e a l e db ym t d n ad - l o o ps e q u e n c e ：t h e m i t o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) d l o o pc o n t r o lr e g i o no f 4 4i n d i v i d u a l sr e p r e s e n t i n g t h r e e s p e c i e so ft h e r a p o n i d a ew a sa m p l i f i e du s i n gp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t e c h n o l o g y , a n ds e q u e n c e d ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：e u 518 6 4 0 e u 518 6 4 7 ) t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h er e g i o nf r a g m e n tw a s 8 5 6 8 8 4 b pi nl 锄g c h i nac o m p a r a t i v ea n a l y s i so ft h em t d n a d - l o o pr e g i o ns e q u e n c e so ft h r e es p e c i e so ft h e r a p o n i d a e ，t h ep o l y m o 叩m cs i t e sw e r e115 f o rt h ef i s ha tz j a r b u a 6 6a trt h e r a p sa n d2 0 0a te q u a d r i l i n e a t u s 砀ea v e r a g en u c l e o t i d e d i f f e r e n c es i t e so ft h ef i s ha tt h e t h r e es p e c i e sw e r e2 8 ( a tt j a r b u a ) ，1 4 0 8 0 8 8 ( a tt t h e r a p s ) ，4 4 8 2 4 1 8 ( a tp q u a d r i l i n e a t u s ) o t h e rp a r a m e t e r so f v a r i a t i o ns i t e sa n dg e n e t i c d i v e r s i t yw e r ea l s oo b s e r v e d c o m p l e t es e q u e n c e so ft h em i t o c h o n d r i a ld n a c e n t r e l r e g i o nf r o mt h e r es p e c i e so ft h e r a p o n i d a ew e r eg a i nb yt h es o f t w a r e ，t h em t d n ac e n t r e i r e g i o no ft h et h e r a p o n i d a ef i s h e sc o u l db es e p a r a t e di n t ot h r e ed o m a i n s ，n a m e l y , t h e t e r m i n a la s s o c i a t e ds e q u e n c ed o m a i n , t h ec e n t r a lc o n s e r v e ds e q u e n c ed o m a i na n dt h e c o n s e r v e ds e q u e n c eb l o c kd o m a i n t h ee x t e n d e dt e r m i n a la s s o c i a t e ds e q u e n c e ( e t a s ) ， t h r e ec o n s e r v e d s e q u e n c eb l o c k s ( c s b f ，c s b e ，c s b d ) i n t h ec e n t r a lc o n s e r v e d s e q u e n c ed o m a i na n dt h r e ec o n s e r v e ds e q u e n c eb l o c k s ( c s bi ，c s b 2 ，c s b 3 ) i nt h e c o n s e r v e ds e q u e n c eb l o c kd o m a i nw e r ea l s oi d e n t i f i e d r e p e a ts e q u e n c e sw e r ef o u n di n t h e3 e n d so ft h ec o n t r o lr e g i o ni nt t h e r a p sa n dp q u a d r i l i n e a t u s am o l e c u l a rt r e ew a s c o n s t r u c t e db yn jm e t h o d ，a n di ts h o w e dt h a tt h ei n d i v i d u a l sa tt h e t h r e es p e c i e sc l u s t e r e d i n t ot h r e ei n d e p e n d e n tg r o u p sa n dt t h e r a p sa n de q u a d r i l i n e a t u sf o r m e das i s t e rg r o u p ， t j a r b u af o r ma ni n d e p e n d e n tg r o u p t h er e s u l ti n d i c a t e dav e r yh i g hg e n e t i cd i v e r g e n c e o f l h r e e s p e c i e s o ft h e r a p o n i d a e ，a n dt t h e r a p si sc l o s e ri nb l o o d r e l a t i o n s h i pw i t h e q u a d r i l i n e a t u s t h i sc o n c l u t i o ni sd i f f e r e n tf r o mt h et r a d i t i o n a lc u l t i v a rc l a s s i f i c a t i o n k e y w o r d s ：t h e r a p o n i d a e ；m o r p h o l o g y ；t r u s sn e t w o r k ；i s o z y m e ；c o n t r o lr e g i o n ； g e n e t i cd i v e r s i t y i v 缩写词 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究 成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：乡下t 訇清 2 0 伊歹年月p 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：彳呵f 虱段 翮签名：诲蚺 2 0 年 2 0 o 夕 年 厂月，) ，日 苦具t 弓b 广东海洋大学硕士学位论文 1 生物多样性概述 1 1 生物多样性概念 第一章引言 生物多样性( b i o l o g i e a l d i v c r s i t y ，b i o d i v e r s i t y ) 简单说是生命有机体及其借以存在的 生态复合体的多样性和变异性【l 】。确切地说，生物多样性是所有生物种间、种内遗传 变异和它们的生存环境的总称，包括所有不同种类的动物、植物和微生物，以及它们 所拥有的基因，它们与生存环境所组成的生态系统。生物多样性包含遗传多样性、物 种多样性和生态系统多样性三个层次【2 】。由此可见，生物多样性是一个内容十分广泛 的概念。 1 1 1 生物多样性研究的目的和意义 生物多样性是地球生命的基础。生物多样性在维持气候、保护水源、土壤和维护 正常的生态学过程等方面，对整个人类做着巨大的贡献。然而，近几十年来，由于人 口剧增、环境退化、自然资源愈趋枯竭以及工业发展对生物原材料的需求越来越快【2 1 。 人类对地球资源的需求量日益增加，人类的活动正不断的侵害着地球维护生物生存的 能力，从而导致生物多样性不断降低，许多物种已灭绝或濒临灭绝，物种灭绝的速度 也在加快【3 1 。 生物多样性丧失的原因是多方面的，其直接原因主要有生境丧失和破碎化、外来 物种的入侵、生物资源的过度开发、环境污染、全球气候变化、工业化的农业和林业 等：其根源在于人1 3 剧增带来的自然资源的高速消耗，不断狭窄的农业、林业和渔业 产业体系，环境及其资源的价值不能得到正确的认识、保护和达到可持续利用，以及 法律和制度的不合理，都会导致生物多样性的丧失。目前，加强对生物多样性的保护 已成为全球瞩目的问题【4 1 。 随着分子生物学的飞速发展，生物多样性的检测手段日益成熟和多样化，人们对 生物多样性的研究也将逐步深入和细致，从不同的角度和层次来揭示生物多样性的根 源，这对当前生产生活的需求，具有重要的现实意义和深远的历史意义【4 】。 1 2 遗传多样性概述 1 2 1 遗传多样性概念 遗传多样性( g e n e t i c d i v e r s i t y ) ，又称为基因多样性，是生物多样性的重要组成部分。 目前，遗传多样性有狭义和广义两个定义，其狭义的遗传多样性指：“种内基因的变 化，包括同种显著不同的群体问或同一群体内的遗传变异，这里的种内的遗传变异 三种蜊科鱼类的形态学与遗传多样性研究 既包括群体内的个体间变异，也包括群体间或群体系统、地理型、生态型、变种、亚 种间以及农作物品系、品种间的遗传差异；广义的遗传多样性指：“蕴藏在地球上植 物、动物和微生物个体基因中的遗传信息的总和一，从这个角度上讲，遗传多样性可 泛指地球上所有生物携带的遗传信息，包括不同物种的不同基因库所表现出来的物种 多样性【5 】。 任何物种都具有其独特的基因库和遗传组成，可以说物种是构成生物群落进而组 成生态系统的基本单元。而物种多样性已经包含了基因遗传的多样性，故遗传多样性 是生态系统多样性和物种多样性的基础【6 1 。 1 2 2 遗传多样性的产生 遗传变异是生物体内遗传物质发生变化而形成的一种可以遗传给后代的变异，是 遗传多样性最直接的表现。众所周知，遗传信息记录在d n a 序列中，通常d n a 忠 实地进行复制，故每次复制形成的两个d n a 分子彼此相同且与其亲本一致，但d n a 分子在复制过程中偶尔也会发生错误，导致子细胞或后代在d n a 的顺序或数量上不 同于母细胞或亲本【4 】。 遗传多样性产生的根本来源在于这种偶然发生的错误，即突变( m u t a t i o n ) ，及有 性生殖过程中基因型不相同的亲本基因组之间所进行的新组合，即重组 ( r e c o m b i n a t i o n ) ，突变包括染色体畸变和基因突变。染色体畸变即为染色体数目和结 构的改变，这里染色体结构的变化包括染色体的缺失、重复、倒位、易位；基因突变 是种群遗传多样性的基础，生物因素和环境因素引起的基因位点内部核苷酸的改变， 它包括d n a 的插入、缺失、重复、移位、修饰、碱基的替换和基因的重组，造成了 种群内与种群间不同个体的遗传差异，而动物个体的遗传差异组成了动物种群的遗传 多样性【4 1 。 遗传多样性的表现是多层次、多水平的。在d n a 、m r n a 、多糖、脂肪、蛋白 质等，在生物大分子、细胞器、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统、 景观等不同层次上都有所表现，在结构、形态、行为、生理、功能等方面也有表现。 1 2 3 遗传多样性研究的意义 ( 1 ) 评估现存各种生物生存状况，并对其今后的发展做一定的预测。遗传多样 性水平高低和其群体遗传结构，是长期进化的结果。遗传结构是遗传变异在群体内的 存在格局或特征，它反映了遗传多样性的组成形式和变化特征。遗传多样性在一定程 度上决定了物种的分布以及数量多样性，并将影响该种未来的生存和发展。因此，遗 传多样性研究将可以评估现存的各种生物的生存状况，预测其未来的发展趋势【6 】。 ( 2 ) 在遗传多样性研究的基础上制定生物多样性保护策略和措施。生物多样性 保护的重点就是保护物种的遗传多样性和进化潜力。近年来，由于资源的过度开发、 生境恶化及外来物种入侵等诸多因素的影响，一些物种正濒临灭绝的境地，其有效的 繁殖群体太小、性别失衡、遗传漂变，导致遗传衰退和近交衰退等现象，遗传多样性 2 广东海洋大学硕士学位论文 置詈詈置詈詈詈詈詈詈量昌置鲁詈量量皇暑皇量皇一i ne i r p 穹詈富盲| 一 极为贫型7 1 只有掌握了物种多样性水平及其群体的遗传结构，我们才能制定更有效 的保护策略和措施，否则任何物种水平上的保护活动都可能成效不大【4 1 。 ( 3 ) 揭示生物进化历史，探究生物进化潜能。遗传变异是生物进化的内在源泉， 研究生物的遗传多样性可以追朔生物进化的历史，探究生物进化的潜能，是进化生物 学研究的核心问题之一【6 】。一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于群体 的遗传变异的大小，也依赖于群体的遗传结构【引。群体的遗传变异大小与其进化速率 成正比【7 】。因而，对群体进行遗传多样性研究可揭示群体进化历史( 起源时何、地点及 方式等) ，也可为进一步分析其进化潜力提供重要的资料和依据。 ( 4 ) 遗传多样性是人类生存和发展的基础。遗传多样性具有十分重要的理论意 义和实际意义。遗传多样性是生物界几十亿年进化产生的宝贵资源，是人类生存和社 会生产的基础【6 】。如遗传多样性的研究对野生生物的驯化，牲畜、农林业新品种培育、 遗传改良，人类遗传疾病的诊断治疗，新药剂开发、生物活性物质的制备生产、有害 生物的检测和控制、生物资源的鉴别等方面均具有重要的作用。近年来，随着分子生 物学技术的飞速发展，分子标记辅助技术的成熟，遗传多样性必将对人类的生活生产 带来更大、更深远的影响【4 1 。 1 3 鱼类遗传多样性的研究 1 3 1 鱼类遗传多样性概述 鱼类多样性是生物多样性的重要组成部分。全世界鱼类目前己有记录的物种数目 多达2 2 3 9 6 种和亚种，分属4 纲5 7 目4 7 9 科3 8 4 8 属，是脊椎动物中分布最广、种 类最多的类群，也是在各个层次多样性最丰富的类群，这些多样性最终归因于遗传多 样性【9 】。在水生生物资源中，与人民生活关系最密切、经济价值最大的应数鱼类资源。 我国幅员辽阔，江河湖泊众多，水环境特征差异显著。全世界现巳发现的淡水鱼类种 类为8 4 0 0 多种【2 】。中国有6 9 1 种，将近占1 0 。中国淡水鱼养殖产量居世界第一位。 同时，鱼类在形态、行为、生活史、体色以及各种附属器官上均多姿多彩。例如，由 于生存环境和习性的不同，鱼类的体型变化多样，适合于快速游泳的纺锤型( f u s i f o n n ) ， 适于水流缓静的侧扁型( c o m p r e s s i f o n n ) ，适于底栖生活的扁平型( d e p r e s s i o n f o r m ) 和善 于穴穿烁石泥土的圆筒型( a n g n i i l i f o r m ) ，还有很特殊的如海马型、球型、带型以及不 对称型等【1 0 1 。鱼类的生活史也很奇特，除具有洄游的特性外，一些鱼类( 如溪鲻科 ( a i h e r i n o m o r p h a ，c y p r i n o d o n t i f o r m e s ) 类群) 在胚胎发育过程中存在滞育( d i a p a u s e 或 d e v e l o p m e n t a la r r e s t ) 现象，以适应其生活过程中可能遇到的生境干旱或潮湿变化【l i 】。 鱼类中还存在脊椎动物中仅有的雌雄同体的类群【1 2 1 。此外，鱼类除有性繁殖外，还有 特殊的雌核发育方式【1 3 l 。 中国的生物多样性居世界第8 位，是生物多样性十分丰富的国家，又是遗传多样 性受到严重威胁的国家之一。对鱼类遗传多样性的的认识和研究在我国起步不久，其 三种蜊科鱼类的形态学与遗传多样性研究 中有许多薄弱环节，研究的种类少，研究的水平低。因此，尽快采用各种研究方法如： 形态学、细胞遗传学、生化水平、分子生物学等技术手段来研究、评估我国鱼类的遗 传多样性，并制定出合理的利用和保护措施，是我国生命科学工作者刻不容缓的责任 【9 j o 1 3 2 鱼类遗传多样性研究的意义 鱼类遗传多样性的研究具有重要的理论和实际意义。首先，鱼类遗传多样性大小 是长期进化的产物，是其生存和发展的前提。一个鱼类的群体遗传多样性越高或遗传 变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。 理论推导和大量实验证据表明，鱼类群体遗传变异的大小与其进化速率成正比，因此 对遗传多样性的研究可以揭示群体的遗传结构、生活背景，分析其进化的历史和潜力， 以及探讨品种濒危的原因和现状，从而进一步提出合理的保种措施【1 4 1 。其次，鱼类遗 传多样性是保护生物学研究的核心之一。不了解种内遗传变异的大小、时空分布及其 与环境条件的关系，我们就无法采取科学有效的措旆来保护人类赖以生存的遗传资 源，来挽救濒于绝灭的鱼类，保护受威胁的种类。对珍稀濒危物种保护方针和措施的 制定，如采样策略、迁地或就地保护的选择等方式方法的制定和实施，都有赖于我们 对物种遗传多样性的认识程度【1 5 】。再次，遗传多样性为鱼类的分类提供有益的资料， 进而为鱼类良种选育和遗传改良奠定基础；鱼类育种与病害防治等方面的进步，是以 鱼类的遗传和生理等基础研究为条件的。因此，鱼类遗传多样性研究对于培育抗病品 种、种质资源研究及合理的杂交育种都具有重要的作用。可以说，遗传多样性的高低 体现了一个生物体对自然条件的耐受力，进而关系到一个物种的兴衰【1 6 】。 2 遗传标记概述 2 1 遗传标记的发展 遗传标记( g e n e t i e m a r k e r s ) 是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离且易于识 别的可遗传的等位基因变异【1 7 。9 1 。它一般具有较强的多态性、表现的共显性、不影响 重要的农艺性状和经济方便、易于观察记载等优点，同时也是作物遗传育种的重要工 具，它在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。随着生物技术的飞速发展，遗传 标记的种类和数量也在不断增加，目前，己经历了形态学、细胞学、生化及分子标记 等几个主要发展阶段。 ( 1 ) 形态学标记( m o r p h o l o g o c a lm a r k e r s ) 是与目标性状紧密连锁，表型上可识别 的等位基因突变体。在形态学标记中，通常所用的表型性状主要有两类：一是符合孟 德尔遗传规律的单基因性状( 如质量性状、稀有突变等) 【2 0 1 。另一类是由多个基因决定 的数量形状如：大多数形态形状、生活史形状等。在许多场合，利用形态性状来估测 遗传变异是最现实的方法，尤其是当需要在短期内对变异性有所了解或在其他生化方 法无法开展之时，形态学手段不失为一种有价值的选摺1 5 l 。 4 广东海洋大学硕士学位论文 ( 2 ) 细胞标记( c y t o l o g i e a l m a r k e r s ) 主要指染色体组型和带型。染色体组型是指生 物体细胞所有可测定的染色体特征总称。包括染色体总数、染色体组数、每条染色体 大小和形态、着丝点的位置等。它是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性 和再现性。对鉴别真假杂种、对研究染色体结构和数目的变异、物种起源和生物的遗 传进化等具有重要价值。带型是用染色体分带技术体所产生的明显的染色带( 暗带) 和 未染色的明带相间的带纹，有q 带、g 带、r 带、t 带等类型，使染色体呈现鲜明的 个体性【2 1 1 。因此，染色体的变化可作为一种遗传标记，用于测定基因所在的染色体及 位置，或通过染色体代换等遗传操作进行基因定位可以把染色体带型作为一种遗传标 记，有效地识别不同物种之间、同一物种不同染色体之间的差异【4 1 。 ( 3 ) 生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 也叫同工酶标记，它是指生物的生化特征特 性，主要有同工酶。同工酶是结构和理化性质不同，但催化功能一样的酶类，由不同 基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂聚体。与其他蛋白质一样，同工 酶也是基因表达的产物，由于不同的同工酶所带的电荷不同，可通过电泳分离，并经 与底物反应或染色，检测它们的存在与否和分子质量的大小，因而可作为遗传标记【2 2 1 。 现在已有几十种同工酶系统，例如：酯酶同工酶、过氧化物同工酶等。同工酶标记已 被广泛用于建立遗传图谱、种群分析等研究i t ：1 2 3 , 2 4 。 ( 4 ) 分子标记( m o l e c u l ar m a r k e r s ) 有广义与狭义两种情况，广义的分子标记是指可 遗传的并可检测的d n a 序列或蛋白质。狭义的分子标记是指以d n a 多态性为基础 的遗传标记。分子标记是基于研究d n a 分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或 由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性，它们广泛地存在于高等 生物d n a 分子的编码区和非编码区。分子标记也必须有相应的技术来揭示它们的存 在。8 0 年代d n a 多聚酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术的出现，推 动产生了许多新型的分子标记如随机扩增多态性d n a 标记( 凡廿d ) 、限制性酶切片 断长度多态性标记( r f l p ) 等。1 9 9 2 年由z e b e a u 和v o s 发展起来的扩增片段长度多 态性( a f l p ) 技术被认为是迄今为止最有效的分子标记，既有r f l p 可靠性，又有r a p d 的方便性【2 5 1 。 与其他3 种遗传标记相比，分子标记具有以下优越性：直接以d n a 的形式表 现，在生物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表 达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，自然界存在着许多等位变 异，不需专门创造特殊的遗传材料；表现为“中性( 无基因多效性) ，即不影响目标 性状的表达，与不良性状无必然的连锁：有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别 出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息【2 6 , 2 7 1 ：丌发成本和使用成本低廉： 在实验室操作时重复性较好。因而现已形成了许多分子标记系统。 5 三种鳎科鱼类的形态学与遗传多样性研究 2 2 分子标记技术的种类及简介 随着分子生物学技术的发展和以d n a 多态性研究为基础的分子标记技术成熟， 逐渐应用于鱼类的种质鉴定、遗传育种和品种鉴定等方面【2 引。相对于形态学和同工酶， d n a 遗传标记直接反映的是基因组d n a 信息，不受环境和其它因素影响，因此其显 示的多态性较高【2 9 1 。d n a 是遗传物质的载体，其多态性是生物多样性的本质内容， 而遗传信息就是d n a 的碱基排列顺序，因此直接观测d n a 的变异是分析物种遗传 多样性最理想而直接的方法。目前d n a 分析技术主要是针对部分d n a 进行。 自b o s t o n 等于1 9 8 0 年首次提出d n a 限制性片段长度多态性方法和1 9 8 5 年p c r 技术的诞生以来，分子技术不断运用创新于遗传多样性的研究。从原理上可大致分为 两类：一类是检测基因组的一批识别位点从而估测基因组的变异性，另一类是直接测 序即分析一些特定基因或d n a 片段的核苷酸序列来度量这些片段d n a 的变异性 1 3 0 。目前，研究遗传多样性的分子生物学方法主要有【3 1 。3 】： d n a 杂交( d n ah y b r i d i z a t i o n ) 。 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 。 限制性酶切片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m , r f l p ) 。 扩增片断长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 。 单链构象多态性( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 。 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 。 可变数目串联重复序列多态性( v a r i a b l en u m b e ro f t a n d e mr e p e a t s ，v n t r ) ， 近年来，国内外部分学者在原有分析技术上不断发展新的技术分析物种遗传多样 性，如基因间隔区序列( i n t e r g e n i c t r a n s c r i b e ds p a c e r , i t s ) 【3 4 1 、随机微卫星扩增多态 d n a ( r a n d o mm i c r o s