（市政工程专业论文）厌氧氨氧化菌种培养与动力学特性研究.pdf

摘要 摘要 厌氧氨氧化技术与传统的硝化反硝化生物脱氮技术相比，无需外加 有机物作为电子供体，即可节省费用，又可防止二次污染，节省能耗， 节省中和试剂等优点，厌氧氨氧化及其工艺技术很有研究价值和开发前 景。本文以s b r 为反应器，分别接种厌氧消化污泥和好氧硝化污泥培 养厌氧氨氧化细菌，研究了厌氧氮氧化反应器的启动、启动过程中的污 泥状态，以及在不同进水氨氮和亚硝氮浓度条件下，厌氧氨氧化过程的 动力学特点，并初步探讨了进水氮氮浓度和厌氧氨氧化反应速率的动力 学模型。主要研究结果如下： 1 分别采用厌氧消化污泥和好氧硝化污泥接种培养厌氧氮氧化 菌，均成功的启动了厌氧氨氧化反应器，可以有效地去除氮氮和 亚硝氮。采用厌氧消化污泥启动较快，但去除效果较低；接种好 氧硝化污泥启动速度慢，但去除效果较好。 2 研究了不同进水基质浓度条件下，n h + 4 - n 和n o z - n 对厌氧氨 氧化反应速率的影响。发现两个反应器中厌氧氨氧化反应速率均 随进水浓度的提高而增加，在进水n h + 4 n 和- n o n 浓度高达 4 0 m m o u l 的情况下，厌氧氨氧化活性仍没有受到抑制，说明厌 氧氨氧化反应还能适应更高浓度的n 一4 - n 和n 0 2 - n 。 3 接种两种污泥的厌氧氨氧化过程，其n 盯4 - n 、n o b n 和n o b n 的化学计量比不同，说明不同的微生物种群可能有不同的厌氧氨 氧化机制。 1 北京交通大学硕士毕业论文 4 接种厌氧消化污泥的厌氧氨氧化过程氨氮的动力学模型为： u = o 0 8 6 4 s ，亚硝氮的降解动力学模型是u7 = o 2 1 3 6 s7 ：而接种 好氧硝化污泥的厌氧氨氧化过程氨氮的降解动力学模型为： u ：旦型：粱( m g ，m ，d ) ，亚硝氮的降解动力学模 k s + s1 8 3 1 2 + s 7 。 型为：u7 = 0 1 7 2 8 s 7 。 关键词：厌氧氨氧化，硝化，反硝化，氨氮，亚硝氮，厌氧氨氧化细菌 垒! ! ! 翌坐 一 一 a b s t r a c t c o m p a r e d w i t ht r a d i t i o n a lt e c h n i q u e sf o rn i t r o g e nr e m o v a lb ym i c r o b i a l ， t h ea n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o nt e c h n i q u ei s as o r to fn e ws t ) ，l ea n d w i d e l yp r o m i s i n gm e t h o d f o ra m m o n i u mr e m o v a lw h i c hi sf r e ef r o mu s eo f n e u t r a l i z a t i o nr e a g e n t s ，s e c o n d a r yp o l l u t i o na n ds a v et h ec o n s u m p t i o no f e n e 唱y a s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o r w a su s e di nt h i si n v e s t i g a t i o n t h ec u l t u r e o fa n a e r o b i co x i d a t i o nb i o m a s ss e e d e dw i t ha n a e r o b i cd i g e s ta n da e r o b i c n i t r i f i c a t i o ns l u d g ew e r ec a r r i e do u ti nt h et w os e t so fs b r r e a c t o r f i r s t l y ， t h es t a r t u po fr e a c t o rw e r es t u d i e d t h e nt h ee f f e c t so fa m m o n i u ma n d n i t r i t ec o n c e n t r a t i o nw e r es t u d i e d t h em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da s f o l l o w s ： 1 t h er e a c t o r sw a ss u c c e s s f u l l ys t a r t e du pb ya n a e r o b i cd i g e s ta n da e r o b i c n i t r i f i c a t i o n s l u d g e a m m o n i u m a n dn i t r i t ec o u l db er e m o v e d s u c c e s s f u l l yi nt h er e a c t o r s a n a m m o xp r o c e s ss e e d e db yd i g e s ts l u d g e s e tu pm o r er a p i d l yt h a nt h a tf o rt h ea e r o b i cn i t r i f i c a t i o ns l u d g e b u t n h ，- nr e m o v a le f f i c i e n c i e sf o ra e r o b i cn i t r i f i c a t i o ns l u d g ea r eb e t t e r t h a nt h o s ef o rt h ea n a e r o b i cd i g e s ts l u d g e 2 t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sf o rt h ee f f e c t so fc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t es u c h a sa m m o n i u ma n dn i t r i t es h o w 也a tt h ea n a r r t r n o xr e a c t i o nr a t e i n c r e a s e dw i t hi n c r e a s eo fn h 4 + - nc o n c e n t r a t i o n t h ea n a n u n o x f 北京交通大学硕士毕业论文 p r o c e s sw a s n o ti n h i b i t e dw h e nt h ei n f l u e n to fa n l l - n o n i u mw a s5 6 0 m g l ( 4 0 m m o l l ) 3 t h es t o i c h i o m e t f i cp r o p o r t i o n so fn i - 9 4 - 1 i 、n o 2 - na n dn o 。3 - ni nt h e a n a r n m o xp r o c e s s e ss e e d e db yt w ok i n d so fs l u d g ew e r ed i f f e r e n t ， w h i c hi n d i c a t e st h a td i f f e r e n ta n a m m o xb a c t e r i ah a v ed i f i e r e n t a g a m l r l o xm e c h a n i s m s 4 f o rt h ea n a m m o x p r o c e s ss e e d e db yd i g e s ts l u d g e ，t h ek i n e t i ce q u a t i o n f o rt h et r a n s f c ) r m a t i o no fa m m o n i u ma n dn i t r i t ew e r eu = 0 0 8 6 4 sa n d u7 = 0 2 1 3 6 s 7 ，r e s p e c t i v e l y o n t h eo t h e r h a n d ，f o r t h ea e r o b i c n i t r i f i c a t i o n s l u d g e ，t h e k i n e t i c e q u a t i o n f o rt h et r a n s f o r m a t i o no f a r n m o n i u ma n dn i t r i t ew e r eu ：u m a x s ；! ! ：! ! 兰a n d u 7 0 17 2 8 s 7 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ，n i t r i f i c a t i o n ，d e n i t r i f i c a t i o n ， a m m o n i u m ，n i t r i t e ，a m m o n i u m - o x i d a t i o nb a c t e r i a i i 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 1 1 1 氮污染概况及危害 随着城市人口的增加及工农业的迅速发展，水体中氮氮的浓度在 不断增加。据国家环境保护总局发布的1 9 9 8 中国环境状况公报，目 前中国长江、珠江、海河、辽河等几大水系中，氨氮是主要污染指标之 一；而太湖、滇池、巢湖等主要湖泊氮磷污染严重，富营养化问题突出。 水体中氮氮的存在将会给环境及人类生活带来很多不良影响，这主 要表现在以下几个方面： ( 1 ) 引起水体的富营养化现象，使某些藻类恶性增殖，水质下降： ( 2 ) 增加给水处理的难度和成本； ( 3 ) 还原态氮在水体中大量耗氧。使水体发黑变臭； ( 4 ) 化合态氮对人体和生物会造成一定的毒害作用。 氨氮污染问题已引起广泛注意越来越多的国家和地区对氨氮制定 了排放标准，而且这些标准有逐渐变严的趋势。我国目前执行的污水 综合排放标准( g 酗9 7 8 一9 粥) 的一级标准规定氨氮排放浓度为 1 5 m g l ；合成氨工业水污染物排放标准( g b l 3 4 5 8 - - - - 9 2 ) 规定现有处 理设施氨氮排放标准为2 5 m g l ，新扩改工程氨氮排放标准为1 5 m g l 。 西方一些发达国家的污水排放标准已由考核氨氮转为考核总氮。 北京交通大学硕士毕业论文 1 1 2 高氨氮废水处理技术简介 目前，氮素污染的控制方法，包括物理化学方法和生物方法。物理 化学方法包括折点加氯法、吹脱法和选择性离子交换法等。物化方法因 费用高、效率低，易引起二次污染等问题而逐渐被淘汰。本节主要针对 各种生物脱氮方法作一介绍。 1 1 2 1 传统硝化反硝化生物脱氮 传统的生物方法是指通过微生物的硝化( n i t r i f i c a t i o n ) 和反硝 化( d e n i t r i f i c a t i o n ) 作用来脱除水体中的氮紊污染。其反应方程式 如下： 2 n 1 t + + 3 0 2 一n 0 2 一+ 2 h 2 0 十4 1 1 ( 卜1 ) 2 n o ；+ o2 - 2 n o ； ( 卜2 ) 6 n o ：+ 5 c h3 0 h 5 c o2 + 3 n2 + 7 h2 0 + 6 0 h 一 ( 1 3 ) 传统的生物脱氮工艺在处理高氨氮废水时由于高的游离氨浓度抑 制了硝化细菌的活性，导致出水难以达标排放，而对于低c n 比废水， 则常需要添加额外碳源物质。此外。传统的生物脱工艺还有耗氧多、易 引起二次污染等缺点。 1 1 。2 2 亚硝化，反亚硝化生物脱氮 近年来，许多研究者认为存在亚硝化( n i t r o z a t i o n ) 反亚硝化 ( d e n i t r o z a t i o n ) 生物脱氮途径，即n h + ；( n h ，) 在氧化为n o ：之后，直 接进行反亚硝化脱氮。与传统的生物脱氮途径相比，亚硝化反亚硝化 途径具有以下优势： 1 由于硝化只进行到n 0 一：阶段，故可节约2 5 的耗氧量： 2 硝化可节约4 0 碳源，可在较低c n 比下实现完全脱氮目的； 第一章绪论 3 由于该途径省去了好氧过程的n o ；- n o ；步骤和缺氧过程的 n o ：一n o ；步骤，缩短了总的反应历程，加快了脱氮速率并提高了整 个反应的效率。 在亚硝化反硝化脱氮途径中关键是控制硝化在n o 一：阶段。影响亚 硝酸积累的因素有很多，目前得到公认的主要有温度、p h 值、氨浓度、 氮负荷、溶解氧、有害物质及泥龄，这些因素都会导致硝化过程中亚硝 酸积累。但目前对此现象的理论解释还不充分，认识有所不同，长久稳 定的维持n o 。积累的途径还有待探索，而且n o 一：是三致物，这些都影响 了亚硝化反亚硝化生物脱氮的推广运行。 l 1 2 。3 同时硝化反硝化生物脱氮 同时硝化反硝化( s i m u l t a n e o u sn i t r i f i c a t i o nd e n i t r i f i c a t i o n ， 简称s n d ) 工艺是指硝化与反硝化反应同时在同一反应器中完成。这个 工艺技术的开发充分利用了反应器供氧不均匀的客观现象，控制生物硝 化与反硝化的反应动力学平衡。s n d 工艺明显具有缩短反应时间，节省 反应器体积，不需投加碱中和酸，降低成本简化工艺等优点。 同时硝化反硝化的关键，就是要求比较有效的解决硝化反应好氧和 反硝化反应厌氧这一基本矛盾。影响s n d 的因素较多，一般认为将溶解 氧控制在较低水平可实现一定的s n d ，但同时也会出现活性污泥膨胀等 问题，另外s n d 不能解决低碳氮比废水的脱氮问题。 1 1 2 4 厌氧氨氧化 厌氧氨氧化( a n a e r o b i ca m m o n i ao x i d a t i o n ，简称a n a 删o x ) 是指 在厌氧条件下，微生物直接以n t h + 为电子供体，以n o - ，或n o 一：为电子受 体，将n o - 3 或n o - ：转变成n 。的生物转化氧化过程。发生的反应为： 5 n h ：+ 3 n o ；- 哼4 n 2 + 9 h 2 0 + 2 h + ( 1 4 ) 北京交通大学硕士毕业论文 n h ：+ n o ；斗n2 + 2 h2 0 ( 卜5 ) 与其它工艺相比，厌氧氨氧化具有不少优点1 2 j ：( 1 ) 无需外加有机 物作电子供体，即可节省费用，又可防止二次污染；( 2 ) 硝化反应每氧 化1m o ln h 4 耗氧2 m o l ，而在厌氧氨氧化反应中，每氧化l m o ln h 只需 要0 7 5 m o i 氧，耗氧下降6 2 5 ，使耗氧能耗大为降低；( 3 ) 传统的硝 化反应氧化l m o ln h 。+ 可产生2 m o lh + 反硝化还原i m o ln o 一，或n o ：将产 生lm o lh ，而厌氧氨氧化的生物产酸量大为下降，产碱量为零，可以 节省可观的中和试剂。故厌氧氨氧化及其工艺技术很有研究价值和开发 前景，尤其是经n 0 一：的厌氧氦氧化，在热力学方面更为有利。 但此方法要投入实际应用面临菌种产量少、污泥驯化时间长、生长 要求条件商、接种的可用污泥少的困难。本实验即针对这些问题，研究 厌氧氮氧化反应器的快速启动方法和运行进行研究。 1 2 国内外厌氧氨氧化技术研究现状 1 2 1 国外研究现状 继1 9 7 7 年b r o d e 【3 l 预言了厌氧氨氧化理论后，1 9 9 5 年荷兰d e l r 大学微 生物技术实验室在厌氧流化床中发现了厌氧氨氧化现象【4 】，v a nd e g r a a t 4 5 1 ( 1 9 9 5 ) 等人以污泥活性试验和抑制或灭活试验充分的证明，厌 氧氨氧化是一个厌氧生物化学反应， n 2 。在b r o d e 的预言发表十多年后， 反应物是氨和亚硝酸盐，生成物是 隐藏于自然界中的厌氧氨氧化现象 终于被发现了，这在生物脱氮史上是一次重大的突破。v a nd eo r a a t 5 】等 人研究出了一个无机盐培养基的配方，以此无机盐培养基重现了厌氧氨 4 - 第一章绪论 氧化反应，并且发现厌氧氨氧化菌的生长受有机物的抑制，由此初步判 断这种细菌是自养型细菌，也即厌氧氨氧化是自养型细菌所致的生物反 应。 此后，国外学者为了回答厌氧氨氧化反应的生物是什么生物，在厌 氧氨氧化微生物的鉴定及特性研究方面作了一系列探索。目前发现 a n a m m o x 的优势菌种是革兰氏阴性光损性球状菌，是专性厌氧的细菌， 在电子显微镜下表现出不规则微生物的特性【6 l 。通过1 6 sr r n a 的分析确 认了厌氧氨氧化菌是浮霉状菌( p l a n c t o m y c e t a l s ) 序列中自养菌的一个 新成员1 7 j 。 j e t t e n 等人( 1 9 9 9 ) 对厌氧氨氧化菌的生理特性研究发现，厌氧氨氧 化菌的基质谱较窄，一般只限于氨及其代谢中间产物( 羟胺和联胺) 。 高浓度的氨和亚硝酸盐会对a n a m m o x 细菌产生抑制。氮的抑制常数为 3 8 0 9 8 5 m m o l l ，亚硝酸的抑制常数为5 4 1 2 0m m o l l i8 1 。j e t t e n l 9 】等认 为n 0 2 大于2 0m m o l l u l 寸，a n a m m o x 会受到抑制，超过1 2 h 时，a n a m m o x 活性完全消失。厌氧氨化菌对0 2 非常敏感，当氨厌氧氧化过程中存在0 2 时，a n a m m o x 活性完全受抑，0 2 浓度必须小于2 um o l l l 。0 2 对a n a m m o x 的抑制是可逆的 m 1 。 s t r o u s i ( 1 9 9 8 ) 等人用s b r 反应器成功地确定t a n a m m o x 菌的几 个重要的生理参数，生物团细胞产率为( o 0 6 6 _ _ _ 0 0 0 1 ) m o l m o l ( 以单 位氨计) ，最大比氨消耗速率( 以单位蛋白质计) 为( 4 5 - - + 2 ) m o l ( m i n r a g ) ， 最大比增长率为0 0 0 2 7 h ，即倍增时间l l d 。j e t t e n 1 2 】( 1 9 9 9 ) 提出 a n a n u n o x - v 艺的温度范围为2 0 - - 4 3 ，最佳温度为4 0 ，p h 在6 7 8 3 ( 最佳p h 为8 ) 时运行的最好。最佳条件下比氨氧化速率( 以单位蛋白 质计) 大约是5 5 n m o l ( m i n r a g ) 。与我国学者邦平的研究结果( 最佳温 北京交通大学硕士毕业论文 度为3 4 c ，最佳p h 值为7 5 ) 有所差别。 j e t t e n 等人利用”n 同位素标记技术。研究了厌氧氨氧化的可能代谢途 径。实验结果表明，作为电子受体的n o 2 被还原为羟胺，在某种程度上， 羟胺可以与电子供体氨反应形成氮气。在分批实验中当过量的羟胺和氨 存在时，他们观察到联胺的暂时积累，表明联胺是一种中间产物【”1 。但 对厌氧氨氧化的机理仍不很明确，存在几种可能途径，主要是对中间产 物不是很明确。 在国外，a n a m m o x 过程已经在废水生物脱氮领域得到了广泛研究。 目前，主要有荷兰d e l r 工业大学生物技术实验室提出的s h a r o n a n a m m o x _ t _ 艺和断1 e t , j g e n t 微生物生态实验室提出的o l a n d ( 有限氧 条件下，自养硝化与反硝化) 工艺等。这些工艺在工程应用中还很少见， 同前主要处于探索阶段。 a n a m m o x 过程在微生物的特性和反应机理方面有了广泛的研究，但 从目前应用研究的情况来看，a n a m m o x 微生物团的培养技术还不能应用 于实际废水处理工程的自养硝化和氨的厌氧氧化微生物优势种群( 菌 株) 的培养和富集。目前报道的富集培养物多数取自流化床反应器，但 实际应用中流化床的动力消耗大，控制要求较高。不宜推广。因此有必 要对此方面作深入研究。 1 2 2 国内研究现状 目前已知的培养a n a m m o x 菌的方法有两类。一类是采用a n a m m o x 菌接种物在反应器中进行增殖培养，另一类是采用活性污泥进行富集培 养”1 。荷兰d e l f t 工业大学关于a n a m m o x 的研究主要利用第一类方法， 第一章绪论 其种泥来自于最早发现a n a m m o x 现象的脱氮流化床反应器。在国内开 展的研究只能依靠从活性污泥中富集培养的方法，浙江大学郑平、胡宝 兰等采用u a s b 反应器成功的富集到了高活性的a n a m m o x 污泥【1 4 】；北 京市环境保护科学研究院的杜兵【l5 】等人在推流固定化生物反应器中成 功获得了a n a m m o x 活性，并培养出了红色颗粒污泥。目前研究中使用 的反应器有u a s b 、流化床、填料床等，基本属于完全混合类反应器。 并且在实验过程中通常加入惰性气体，驱赶氧气，防止氧气对a n a m m o x 的抑制。这类实验仅限于理论研究，距离实际工程应用差距较大。 郑平等人根据1 4 n 和1 5 n 的示踪试验推断，厌氧氨氧化的宣接电子 受体可能是亚硝酸盐而不是硝酸盐，也即产物来自氨和皿硝酸盐的缩合 反应【i 乳。郑平等也对厌氧氨氧化菌的机制特陛、厌氧氮氧化的电子受体 及流化床反应器的性能等进行了较深入地研究，测得细胞产率系数 1 5 7 3 m g v s ( m m o l n h + 4 ) ，细胞衰减常数0 0 5 2 m g v s ( g v s d ) ，但 该数据是直接对厌氧氨氧化流化床反应器进行生物量平衡得到的，在分 批实验中未能得到混培菌的生长速率。他在连续式实验中认为厌氧氨氧 化最适p h = 7 6 0 5 。最适温度3 0 ，亚硝酸盐对厌氧氨氧化的抑制常数 5 4 0 1 1 1 9 9 5 m m o l l ，氨自身的抑制常数3 8 0 1 8 - - 9 8 4 6 5 m m o l l 1 1 6 。 在这些研究中，厌氧氨氧化混培菌的获得都经历了很长的时间，且 具体参与厌氧氨氧化反应的微生物目前尚未有报道，从厌氧氨氧化混培 菌的生长特性看，要进行该生物反应的工程开发，需解决接种物的增殖 问题。 北京交通大学硕士毕业论文 1 3 课题研究意义和目的 水体富营养化问题的日趋严重，对于生物脱氮技术的发展提出了更 为迫切的要求。厌氧氨氧化工艺凭借着自身能耗、物耗比传统硝化反硝 化工艺节省的优势。日趋成为该领域的研究及应用热点。但是，由于它 是一个新发现的生物反应，至今还不清楚他是如何进行的，也不知道哪 些微生物参与作用。以该生物反应为基础的新型生物脱氮技术也处于研 究初期，有待系统探讨。 从目前情况看，厌氧氨氧化( a n a m m o x ) 生物团的培养技术仅适 于实验室的理论研究还不能应用于实际废水处理工程的自养硝化和氨 的厌氧氧化微生物优势种群( 菌株) 的培养和富集。厌氧氨氧化工艺尚 处于理论研究和应用的初步阶段，如何在工程实际中合理控制运行条件 以实现该工艺的实用化和长期稳定性是尚待解决的问题。 目前为止，国际上厌氧氨氧化菌主要出自d e l f t 大学微生物技术实 验室。我国学者郑平等人得出以硝化污泥接种可以培养出厌氧氨氧化菌 1 1 7 1 。如何快速培养出厌氧氨氧化菌，是厌氧氨氧化技术应用于工程实际 的关键。本实验分别以垃圾填埋场渗滤液处理厂硝化污泥和城市污水处 理厂污泥消化污泥接种培养厌氧氨氧化菌分别培养，通过实验确定不 同污泥来源的厌氧氨氧化菌的可培养性，同时研究其培养过程的规律和 特点，为该技术的应用创造条件。 第二章厌氧氮氧化机理 第二章厌氧氨氧化机理 2 1 厌氧氨氧化的发现 传统的硝化理论认为，氨只有在好氧条件下才能被氧化，但是理论 上它也能作为反硝化的无机电子供体，为此奥地利理论化学家b r o d a i 【1 8 1 在1 9 7 7 年，根据化学反应热力学( 标准自由能变化) ，预言自然界中存 在2 种尚未发现的矿质营养菌其中之一为以氧或硝酸根或亚硝酸根为 电子受体，把氨氧化为n 2 的自养菌。几年4 - 氨氧化反应的标准自由能变 化见表2 1 。 表2 - 1各种氨氧化的标准自由能变化 序 电子受体化学反应 o 。( k j m o l 、 可能性 号 2 n h ：+ 3 02 2 n o ；+ 1氧 - 2 4 l 可能 2 h 2 0 + 4 h + 2 亚硝酸盐 n h ：+ n o ；一n 2 + 2 h 2 0 一3 3 5 可能 5 n h ：+ 3 n o ；一4 n 2 + 3硝酸盐 - 2 7 8 可能 9 h 2 0 + 2 h + 4 铁( i i i )2 n h + 4 + 6 f e 3 + 一n 2 + 6 f e 2 + + 8 h - 1 0 0可能 8 n h ：+ s o 叫4 n 2 + 3 h 2 s有时可 5硫酸盐 2 2 + 1 2 h 2 0 + 5 h + 能 北京交通大学硕士毕业论文 4 n h ：+ 3 h c o ；一2 n 2 + 6 h2 c 6碳酸盐 + 3 c h 2 0 + h + + 9 4不可能 众多研究表明：硝化过程中氮氧化物的产生随着氧浓度的降低雨增 加。p o t h i 坶1 等人从一系列的”n 同位素示踪试验发现：亚硝化菌 ( n i t r o s a m o n a se u r o p a e a ) 可利用n o 2 作为终端电子受体进行反硝化， 导致氮氧化物的产生。b ot h a m d r u p l 2 0 】的研究也发现n 2 是通过硝酸盐和 氨之间氮元素的一一配对而形成的。 2 0 世纪8 0 年代末，荷兰d e f c 工业大学的m u l d e r 2 t l 等人利用流化床 反应器研究生物反硝化时，发现氨可直接作为电子供体进行反硝化反 应。经过试验确认，m u l d e r 等人认为，生物脱氮流化床反应器中的氮和 亚硝酸是按b r o d a 所预言的方式进行的，并将其称为厌氧氮氧化，即 a n m n m o x ( a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ) 。在b r o d a 的预言发表近十 多年后，隐藏于自然界的厌氧氨氧化终于被发现了。 九十年代初，荷兰d e l f t 技术大学k l u y v e r 生物技术实验室利用这些 生化反应原理开发了生物脱氮新工艺a n a m m o x 工艺( a n a e r o b i c a m m o n i u mo x i d a t i o n ) 。 2 2 厌氧氨氧化原理 厌氧氨氧化是指在厌氧条件下，厌氧氨氧化混合菌直接以n h + 4 为电 子供体，以n 0 3 ( n o 2 ) 为电子受体，将n h + 4 、n 0 - 或n o 。2 转变成 n 2 的过程m l 。该过程利用独特的微生物种群以硝酸盐，亚硝酸盐作为电 子受体把氨氮氧化成n 2 ，最大限度地实现了n 循环的厌氧硝化，这种 - 1 0 第二章厌氧氮氧化机理 耦合的过程对于从厌氧硝化的废水中脱氮具有很好的前景，对于高氨 氮、低c o d 污水由于硝酸盐的部分氧化，该工艺还可以大大地节约能 量1 2 3 】。发生的反应可假定为【2 4 】： 5 n h ：+ 3 n o ；斗4 n 2 + 9 h 2 0 + 2 h + ( 2 - 1 ) a g = 2 9 7 k j t o o ln h + d n h ：+ n o ；_ n2 + 2 h2 0 ( 2 - 2 ) g = 3 8 5 k j m o ln h + d 2 2 1 厌氧氨氧化的化学反应模型 根据对脱氮流化床反应器中厌氧氨氧化的示踪研究，v a i ld eg r a a r 4 2 s l 等人提出了如图2 1 所示的厌氧氨氧化反应器模型。根据这个模型，厌 氧氮氧化菌以羟氨为氧化荆，把氨氧化成联胺：联胺再氧化为氮气。 fe 、 n d ：羔：n d n 2 h 2。7 1 图2 - 1 厌氧氨氧化反应模型1 2 5 1 氨被羟胺氧化形成联胺；联胺产生n 2 和还原当量，后者被用于还原亚 硝酸盐产生更多的羟胺；亚硝酸盐被氧化成硝酸盐，产生还原当量用于细胞 北京交通大学硕士毕业论文 生长 在这个模型中。亚硝酸盐具有三种功能： 1 作为羟胺的前体： 2 作为电子汇，处置反应产生的电子； 3 ，作为能源，在其氧化成硝酸时，产生还原当量。 厌氧氨氧化涉及的化学反应为： n h 2 0 h + n h 3 - - 4 n2 h 4 + h 2 0 n 2 h4j n2 + 4 【h 】 h n 0 2 + 4 【h 】_ n h2 0 h + h2 0 n h ，+ h n o2 - + n2 + 2 h2 0 h n 0 2 + h2 0 + n a d + _ h n 0 3 + n a d h2 2 2 2 细胞和生化反应模型 ( 2 1 ) ( 2 2 ) ( 2 3 ) ( 2 4 ) ( 2 5 ) 2 2 2 i 细胞反应模型 根据透射电镜观察。b r o c a d i aa n a m m o x i d a t i o n s 的细胞结构如图2 - 2 所示。细胞可区分为内室和外室。内室中间有一个由双层膜包围的厌氧 氨氧化体，它可能是厌氧氨氧化发生的场所。除了厌氧氨氧化体，内室 还含有拟核和核糖体等成分。外室包围着内室，外室与内室之间由细胞 膜隔开。外室中含有被称为“p a r y p h o p l a s m ”的细胞质。细胞壁和细胞 膜位于外室外围。在厌氧氨氧化体中，含有羟胺氧还酶和少量d n a ，并 具有未知功能的管状结构。j e t t e n 等人认为厌氧氨氧化体是一个多功能 的细胞器，可能与细胞分裂、d n a 复制以及其他生理活动有关【2 9 1 。 第= 章厌氧氩氧化机理 b ) 图2 - 2 厌氧氨氧化菌细胞结构1 2 6 j c a ) ：超薄切片模型：( b ) ：投射电镜照片 厌氧氨氧化体细胞质 一； 一j 一一、 一、 、 、 t n u l i , 专# 。 一 7 1 ( 4 e ) 、一7 7 n 陆( 5 h 一一一一 、7。 ，一 n & 图2 - 3 细胞反应模型f 2 9 】 根据化学反应模型( 图2 1 ) 和细胞结构模型( 图2 2 ) ，j e r t e n 等人 提出了厌氧氨氧化的细胞反应模型【2 7 】( 图2 3 ) 。亚硝酸盐在细胞质中被 还原成羟胺，并与氨反应生成联胺：联胺在厌氧氨氧化体内被氧化成氮 气。 1 3 北京交通大学硕士毕业论文 2 2 2 2 生化反应模型 根据化学反应模型( 图2 1 ) 以及羟胺氧还酶( h a o ) 的催化特性， j e t t e n 等人提出了厌氧氨氧化的生化反应模型 2 7 】( 图2 - 4 ) 。按照这个模 型，亚硝酸盐还原酶( n r ) 定位于细胞膜的细胞质一侧，催化亚硝酸盐 还原成羟胺；假设存在一个跨膜的联胺水解酶( h h ) ，催化羟胺和氨缩 合成联胺：联胺转化成氮气：释放电子通过传递联交给亚硝酸盐还原酶。 图2 - 4b r o c a d i a a n a m m o x i d a t i o n s 生化反应模型【2 7 1 n r 一亚硝酸还原酶( 假设产物为羟胺) ：h h 一联胺水解酶( 缩台氨与羟胺) h z o 一联胺氧化酶( 可能是h a o ) 2 3 厌氧氨氧化细菌及其特性 2 3 1 优势细菌类型 1 9 7 7 年b r o d a 以“自然界中遗失的两种无机营养微生物”为名发表 的文章中指出，化能自养细菌能以n 0 3 ，c 0 2 和n o 2 作为氧化剂把氨 第二章厌氧氨氧化机理 氧化为n 2 。目前有研究发现氨氧化菌n i t r o s o m a n a se u r o p a e a 和 n i t r o s o m o n a se u t r o p h a 能同时硝化和反硝化，利用n h 2 0 h 还原n o 2 或 n 0 2 ，或者在缺氧条件下利用氨作为电子供体，把n h + 4 转化为n 2 2 6 】。 这些细菌存于超负荷处理系统中，在利用n o 2 为电子受体时，其厌氧氨 氧化的最大速率( 以单位蛋白质计) 约为2 n m 0 1 ( r a i n m g ) 。在反硝化 的小试实验反应器中发现了一种高度富集的特殊自养菌的优势微生物 群体它以n 0 1 2 作电子受体，最大比氨氧化速率( 以单位蛋白质计) 约为5 5 n m o l ( m i n m g ) 。虽然此反应比n i t r o s o m o n a s 快2 5 倍，但它允 许的增长率仅为o 0 0 3 h “( 倍增时间为1 i d ) 。研究者把这种细菌称为厌 氧氨氧化( a n a r n m o x ) 细菌盯1 。v a n d e g r a f t 用c 0 2 和有机电子供体做 实验，发现a n a m m o x 细菌是自养性细菌，在有有机底物时会受到抑制。 这三种细菌在厌氧条件下对n o 2 ，n 2 h 4 ，n h 2 0 h 和氨的转化速率比较 见表2 - 2 。可见，能进行高速厌氧氮氧化的细菌不是n i t r o s o m a n a s e u r o p a e a 和n i l r o s o m o n a se u t r o p h a ，而是a n a m m o x 细菌。 a n a m m o x 细菌的优势菌种是革兰氏阴性光损性球状菌，是专性厌氧 的细菌。在p h 为7 4 的2 0 m m o l l 的k 2 h p 0 4 缓冲剂和2 5 的戊二醛混 合时。在电子显微镜下表现出不规则微生物的特性。这些细菌与浮霉状 菌( p l a n c t o m y c e t a l s ) 序列的成员有3 处相似的特性：内部细胞的区域 化；细胞壁上存在漏斗状结构；膜上有不同寻常的脂质6 1 。醚样脂质说 图2 - 2 批序实验中不同培养体对n h + 4 ，n 2 h 4 和n h 2 0 h 的 厌氧氧化速率 n h 2 0 h n h h n o 2 的 培养体组分测试 n 2 h 4 的转化产物 转化速率 速率 北京交通大学硕士毕业论文 n e u r o p o e an h 2 0 h + n o 2 2 n 2 0 n e u r o p o e a n h + 4 + n 0 2 2n ，o n e u r o p p h a h 2 + n o 2 7无应用过 n 2 0 ，n 2 n e u r o p p h a n h + 4 + n o 。2 ( 1 1n ，o n e u r o p p h an h + 4 + n o 2 0 91 1 n o n 2 0 a n a m m o x 混培物 n h + 4 + n o 。2 1 29 n 2 a n a m m o x 混培物 n h ，o h 无 1 2 n 2 a n a m m o x 混培物 n 2 h 4 + n o 。2 1 31 l n h + 4 n 2 a n a m m o x 混培物n h + 4 + n o 。2 6 85 8n ， 明这些细菌属于最古老的古生物菌( a r c h e a ) 或分支很深的细菌栖热孢 菌属( t h e r m o t o g a ) 和产液菌属i i l 】( a q u i f e x ) 。1 6 sr r n a 的分析说明 b r o c a d i aa n a m m o x i d a n 最有可能是a n a m m o x 工艺的代表微生物确认 了厌氧氮氧化菌是p l a n c t o m y c e t a l s 序列中自养菌的一个新成员6 1 。 2 3 2 细胞色素镜检 从n e u r o p o e a 提纯的羟胺氧化还原酶( h a o ) 能把n 2 h 4 催化转化 为氮气 2 8 1 ，而a n a m m o x 培养体的细胞提取物也有很高的h a o 活性， 说明a n a m m o x 工艺中可能存在类似的酶。最近利用阴离子交换和凝胶 过滤层析法从a n a m m o x 群体中提纯了这种新型h a o 。a n a m m o x 酶的 分子团比n i t r o s o m o n a s 酶的分子团小，其污泥颜色为深红。j e r e n 1 2 】等 对在a n a m m o x 细胞和富集液的提取物作分光光度检验时发现c 型细胞 色素有显著增加的信号，这个酶能催化n 2 h 4 和n h 2 0 h 的氧化。在生物 第二章厌氧氮氧化机理 团a n a m m o x 活性提高期间，4 6 8 n m 处的信号逐步增加并达到吸收高峰， 用c o 处理后就消失。而好氧氨氧化菌在4 6 3 n m 处也有类似现象1 2 9 , 3 0 1 。 这是因为羟胺氧化还原酶有一个亚铁红素的缘故。虽然n h 2 0 h 是 a n a m m o x 过程的优先底物，但细胞提取物中蛋白质的n 2 出氧化速率( 以 单位蛋白质计) 为15 0n m o l ( m i n m g ) 仍足够高到能保持细菌o 0 0 3 h 1 的增长速率。 2 3 3a n a m m o x 细菌的生理特性 2 3 3 1 可用底物 含有n h + 4 ( 5 3 0 m m o l l ) 、n o 。2 ( 5 3 5 m m o l l ) 、c 0 2 ( 1 0m m o l l ) 、 金属及微量元素的母液可以培养a n a m m o x 细菌。介质中的p 0 3 4 的浓 度低于o 5m m o l l ，氧气浓度低于检测值( 1um o l l ) 以避免可能产 生的抑制。在j e t t e n 1 2 1 等的实验中，有一部份n o 。2 转化为n o 3 ，且 每m o lc 0 2 转化微生物团时，就有2 4 m o l 的氨被转化。可以假设从n 0 1 2 转化为n o 3 的这个功能是c 0 2 减少的必要还原等价过程。根据化学剂 量，得出化学反应计量式为： l n h 4 4 - + 1 3 2 n o i + 0 0 6 6 h c o ；+ o 1 3 h + = ( 2 1 ) 1 0 2 n 2 + o 2 6 n o ；+ 0 0 6 6 c h2 0 05 + 2 0 3 h 2 0 厌氧氨氧化菌和甲烷氧化菌能以不同的速率催化氨与甲烷的氧化 3 1 1 。加入甲烷不会抑制氨与n o b 的转化，表明负责厌氧氨转化的酶与 好氧a m 0 或甲烷单氧化酶是不同的，但甲烷本身不为a n a m m o x 生物 团所转化。 h 2 加入a n a m m o x 反应前后，在短时间内表现出了明显的类似 a n a m m o x 的现象【1 2 】。但这些实验中的h 2 不能代替氨作为电子供体。短 1 7 北京交通大学硕士毕业论文 期实验中投加的不同有机底物( 丙酮酸盐、甲醇、乙醇、丙氨酸、葡萄 糖、钙氨酸) 会严重抑制a n a m m o x 的活性。 2 3 3 2 抑制物 高浓度的氨和亚硝酸会对a n a m m o x 细菌产生抑制。氨的抑制常数为 3 8 0 9 8 5 m m o l l t 8 1 ，亚硝酸根的抑制常数为5 4 1 2 0 m m o l l 。j e t t e n l 3 2 】 等认为n o 一2 大于2 0m m o l l 时，a n m 3 3 m o x 会受到抑制，超过1 2 h 时， a n a m m o x 活性完全消失。 氨厌氧氧化过程中存在0 2 时，a n a m m o x 活性完全受抑【2 9 】，0 2 的浓度 必须小于2um o l l ，0 2 对a n a m m o x 的抑制是可逆的。 y 射线照射或1 2 1 下消毒污泥，或在繁殖期内排泥会抑制 a n a r n m o x 在繁殖期投加不同的抑制剂( 2 ，4 双硝基酚，h g c i 等) 时， 会完全扣l l f i i l j a n a m m o x 过程。 2 3 3 3 基质转化转化速率和基质亲和力 s t r o u s 等人用分批培养的方式测得【7 1 在氨浓度和亚硝酸盐浓度分别 低至0 1 5 m g l 和0 0 5 m g l ( 已达检测下限) 之前，浓度变化与时间之 间呈直线关系。基质浓度更低时，由于接近亲和力常数或手传质阻力的 作用，结果偏离零级反应。测得厌氧氨氧化菌富集培养物对氨和亚硝酸 盐的亲和力常数小于l m g n , 。好氧