（老年医学专业论文）增龄对血小板参数及活化指标的影响及干预研究.pdf

增龄对血小板参数及活化指标的影响及干预研究 研究生：陈梅 专业：老年医学 导师：刘焕星教授 中文摘要 背景与目的 血小板大多数来源于骨髓成熟巨核细胞，在生理上有助于止血和修复 损伤的血管内皮，但在病理状态下，血小板又是血栓形成的始动因素和核心 过程。在此过程中，血小板被激活并暴露膜上的纤维蛋白原结合位点活 化的糖蛋白g pi ib i l la 复合( p a c 1 ) ，导致血小板聚集和进一步的活化，释放 血小板a 一颗粒膜蛋白14 0 ( c d 6 2 p ) ，从而启动了血栓形成的一系列瀑布样反 应。探讨增龄与血小板膜糖蛋白p a c 1 ，c d 6 2 p 与血小板参数之间的关系，以 及高血压病和慢性阻塞性肺疾病血小板参数及血小板膜糖蛋白干预前后的 变化，精确判断血小板的功能状态，以发现更加简便、经济、可靠的检测血 小板活化的方法。 方法 研究健康受检者4 0 0 歹0 ，高血压病，慢性阻塞性肺病患者各3 0 例。据实 用老年医学的分组法将健康受检者分为2 5 4 4 岁( 成年组) ，4 5 5 9 岁( 老年前 期) ，之6 0 岁( 老年组) 。并给予高血压病组，慢性阻塞性肺病组阿司匹林10 0 m g 干预lo 天。应用流式细胞仪全血检测p a c 1 、c d 6 2 p 的阳性百分率；应用全 自动血球分析仪对血小板的参数进行检测。 结果 ( 1 ) 血小板计数( p l t ) 随着年龄的增加而下降，平均血小板体积( m p v ) 随年龄的增加而增大，血小板计数( p l t )与平均血小板体积( m p v ) 白j 存 在明显负相关，血小板压积( p c t ) 值的变化一般与血小板数量的变化一致。 随着年龄的增加，血小板膜糖蛋白的活化水平相应升高，各组间具统计学差异， 但老年c d 6 2 p ，p a c 一1 的比率明显大于成年组( p 0 0 5 ) 。 ( 2 ) 高血压病组；与正常对照组比较，高血压病组患者血小板各参数值 均显著增高( p 0 0 5 ) ；降压治疗，随着血压控制达标后，并给予拜阿司匹林 10 0 m g 天，干预1o 天后，血小板各参数值均有一定程度地下降，其中p l t 与p c t l 的降低差异具有显著性( p 0 0 5 ) 。高血压病组对血小板膜糖蛋白的影响与对 照组比较，血小板表面p a c 一1 和c d 6 2 p 明显升高，两组比较差异有非常显著性 ( p 0 0 1 ) 。 ( 3 ) 慢性阻塞性肺病( c o p d ) 组：急发期( 干预前) 、缓解组( 干预 后) 、对照组三者p l t 、m p v 、血小板宽度( p d w ) 、p c t 均有明显差异( p 均 o 0 1 ) ，对照组、c o p d 缓解组与急发期比较p l t 、m p v 、p c t 有明显差异对 照组与c o p d 缓解组p l t 、m p v 、p c t 无明显差异：对照组、c o p d 缓解组、 c o p d 急性期p d w 均有明显差异，p 0 0 1 。c o p d 组与对照组比较血小板表面 p a c 1 和c d 6 2 p 明显升高，两组比较差异有统计学意义( p 0 0 1 ) 。血小板 p a c 1 和c d 6 2 p 检测结果， c o p d 急性期组c d 6 2 p 阳性表达率高于缓解组及 健康对照组( p 均 0 0 1 ) ，缓解组c d 6 2 p i j - 性表达率亦高于健康对照组( p 0 0 5 ) ； c o p d 急性期组p a c 1 阳性表达率明显高于缓解组及健康对照组( p 均 o 01 ) ， 缓解组的p a c 一1 阳性表达率亦高于健康对照组( p 0 0 5 ) 。 ( 4 ) 血小板参数与血小板膜糖蛋白的相关性 p a c l 与平均血小板体积( m p v ) 有非常显著的正相关关系( r = 0 3 2 0 ， p = 0 0 41 ) 。c d 6 2 p 与平均血小板体积之间亦存在正相关关系( r = 0 2 51 ， p = 0 0 3 1 ) ：而血小板计数( p l t ) 、血小板分布宽度( p d w ) 与膜糖蛋白之间无相 关关系。 结论 ( 1 ) 随着年龄的增加血小板的各参数发生变化，血小板活化蛋白 c d 6 2 p 、p a c 1 表达增加，可能与增龄导致血栓性疾病增加有关。 ( 2 ) 高血压病组血小板的各参数发生变化，血小板活化蛋白c d 6 2 p 、 p a c 一1 表达增加，与高血压病致血管内皮损伤，血小板活化，血栓形成有关。 ( 3 ) 慢性阻塞性肺病组血小板的各参数发生变化，血小板活化蛋白 c d 6 2 p 、p a c 1 表达增加与慢性阻塞性肺病长期缺氧，内皮损伤，血小板活 化，血栓形成有关。 ( 4 ) 干预后变化血小板的各参数发生变化，血小板活化蛋白c d 6 2 p 、 p a c 一1 表达降低，这与阿司匹林抑制还甲氧酶，减少血栓素花生四烯酸( t x a 2 ) 的生成，从而具有抗血小板聚集的作用。 ( 5 ) 检测血小板各参数发生的变化，血小板活化蛋白c d 6 2 p 、p a c 1 表 达，可为血栓性疾病的早期诊断提供新思路，并为这类疾病的防治提供支持。 关键词增龄；血小板参数；活化指标；干预；高血压病；慢性阻塞性肺病； 阿司匹林 e f f e c t so fp l a t e l e tp a r a m e t e r sa n di n d e xo f a c t i v a t e dp l a t e l e tw i t ha g e i n gp a r a m e t e rl e v e l b l o o dp l a t e l e ta n di n t e r v e n t i o n n t e r v e n t i o ns t u d y p o s t g r a d u a t e ： c h e nm e i s p e c i a l i t y ：g e r a e o l o g y t u t o r ： b a c k g r o u n da n dp ur p o s e l i uh u a n - x i n g a bs t r a c t p l a t e l e tm o s t l yc o m ef r o mm a t u r eg i a n tp l a t e si nb o n em a r r o w p l a t e l e t h a v e p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s u c h a s h a e m o s t a s i s ，r e p a i r i n g b l o o dv e s s e l e n d o t h e l i u m ，b u ti ti st h r o m b o p o i e t i ci n i t i a t i n ga g e n ta n dn u c l e u sp r o c e s s i n t h ep r o c e s s ，p l a t e l e tb e c o m ea c t i v a t e da n de x p o s ef i b r i n o g e n - b i n d i n gs i t e so n t h em e m b r a n e - a c t i v a t e dg l y c o p r o t e i ng pi ib i i i a c o m p l e x i n d u c i n gp l a t e l e t a g g r e g a t i o na n dc o n s o l i d a t ea c t i v a t i o n ；r e l e a s ep l a t e l e to 【- g r a n u l em e m b r a n e p r o t e i n - 14 0e v e n t u a l l yl e a d i n g t ot h r o m b u sf o r m a t i o n t o i n v e s t i g a t e t h e a s s o c i a t i o no fp l a t e l e tm e m b r a n eg l y c o p r o t e i ng pi ib 1 1 1a 、g m p 14 0a n d p a r a m e t e ro fp l a t e l e tw i t ha g e i n g e s t i m a t i n ga c c u r a t e l yt h ef u n c t i o no fp l a t e l e t i no r d e rt of i n dc o n v e n i e n t ，e c o n o m i c ，r e l i a b l ed e t e c t i o no fp l a t e l e ta c t i v a t i o n m e t h o d s i n v e s t i g a t e4 0 0h e a l t he x a m i n a t i o np e o p l e ，3 0h y p e r t e n s i v ed i s e a s ec a s e s a n d3 0c h r o n i co b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i s e a s e ( c o p d ) c a s e s a c c o r d i n gt o p r a c t i c eo fg e r i a t r i c s ，w ed i v i d a t u r4 0 0h e a l t he x a m i n a t i o np e o p l ei n t oa d u l t g r o u p e ，p r e s e n i u mg r o u p e ，o l d e ra g e g r o u p i n 10d a y s ，h y p e r t e n s i v ed i s e a s e c a s e sa n dc o p dc a s e st a k eo r a l l y10 0 m ga s p i r i ne v e r y d a y t od e t e c tt h e p o s i t i v ep e r c e n t a g eo fa c t i v a t e dg p i ib i i lac o m p l e x 、g m p 一14 0 、w i t hf l o w c y t o m e t r y ( f c m ) i na l le x a m i n a t i o np e o p l e p a r a m e t e ro fp l a t e l e tw e r em e a s u r e d i na l lp a t i e n t su s i n ga u t o m a t i cb l o o da n a l y z e r r e s n i t s ( 1 ) t h ep l a t e l e tc o u n ts h o w e dad o w n w a r dt r e n dw i t ha g i n g ；m e a np l a t e l e t v o l u m es h o w e di n c r e a s i n gw i t h a g i n g ；t h ep l th a dao b v i o u s l yn e g a t i v e c o r r e l a t i o nw i t hm p v t h ev a r i a t i o no fp l a t e l e th e m a t o c r i ts h o w e dc o n f o r m i t y w i t hv a r i a t i o no fp l t c d 6 2 pa n dp a c 一1c o u n ts h o w e dau p w a r dt r e n dw i t h a g i n g 4 ( 2 ) t h ep l a t e l e tp a r a m e t e r sw e r ei n c r e a s e di n h y p e r t e n s i o np a t i e n t s c o m p a r e dw i t hh e a l t h yp e o p l ea n dd e c r e a s e da f t e ra n t i h y p e r t e n s i o nt h e r a p ya n d t a k i n g10 0 m ga s p i r i n10d a y s p l ta n dp c tw e r eo b v i o u s l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 ) c d 6 2 p , p a c - 1w e r eo b v i o u s l yi n c r e a s e di nh y p e r t e n s i o np a t i e n t sc o m p a r e dw i t h h e a l t h yp e o p l e ( p 0 01 ) ( 3 ) p l t 、m p v 、p d w 、p e tw e r eo b v i o u s l yi n c r e a s e di nc h r o n i c o b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i s e a s e sc a s e sc o m p a r e dw i t hh e a l t h yp e o p l e ( p 0 0 1 ) c o m p a r e dw i t hc o p dr e m i s s i o ns t a g eg r o u pa n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，t h e e x p r e s s i o n s o fp l t 、m p v 、p e ti n c r e a s e di n p a t i e n t s w i t hc o p d e x a c e r b a t i o n ( a l lp 0 0 01 ) t h e r ew e r en o to b v i o u s l yd i f f e r e n c eb e t w e e n c o p dr e m i s s i o ns t a g eg r o u pa n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p p d ww e r eo b v i o u s l y d i f f e r e n c ei nt h et h r e eg r o u p c d 6 2 p , p a c - 1w e r eo b v i o u s l yi n c r e a s e di nc h r o n i c o b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i s e a s e sc a s e sc o m p a r e dw i t hh e a l t h yp e o p l e ( p 0 0 1 ) c d 6 2 pa n dp a c - 1w e r eo b v i o u s l yi n c r e a s e di np a t i e n t sw i t hc o p de x a c e r b - a t i o nc o m p a r e dw i t hc o p dr e m i s s i o ns t a g eg r o u pa n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p c d 6 2 pa n dp a c 一1w e r ei n c r e a s e dc o m p a r e dw i t hc o p dr e m i s s i o ns t a g eg r o u p a n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p ( 4 ) p l a t e l e tp a r a m e t e r sh a dac o r r e l a t i o nw i t hp l a t e l e tm e m b r a n eg l u c o p r o t e i n s p a c - 1h a dao b v i o u s l yp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hm p v ( r = 0 3 2 0 ，p = 0 0 4 1 ) ； c d 6 2 ph a dap o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hm p v ( r = 0 2 51 ，p = 0 0 3i ) p l ta n dp d w h a dn o tac o r r e l a t i o nw i t hp l a t e l e tm e m b r a n eg l u c o p r o t e i n s c o n c l u s i o n s ( 1 ) p l a t e l e tp a r a m e t e r sh a dc h a n g ew i t ha g i n g c d 6 2 p 、p a c 一1s h o w e d i n c r e a s i n gw i t ha g i n g i tm a y b eh a dac o r r e l a t i o nw i t ht h a tt h r o m b o d i s e a s e s w e r eo b v i o u s l yi n c r e a s e dw i t ha g i n g ( 2 ) h y p e r t e n s i o nc a s e s p l a t e l e t p a r a m e t e r sh a dc h a n g ei nh y p e r t e n s i o n p a t i e n t sc o m p a r e dw i t hh e a l t h yp e o p l e c d 6 2 pa n dp a c 一1s h o w e di n c r e a s i n gi n h y p e r t e n s i o np a t i e n t s h y p e r t e n s i o n d i s e a s ec a n d a m a g e b l o o dv e s s e l e n d o t h e l i u ma n dm a y b eh a v ec o r r e l a t i o nw i t hp l a t e l e ta c t i v a t i o na n dt h r o m b o g e n e s i s ( 3 ) c o p dc a s e sp l a t e l e tp a r a m e t e r sh a dc h a n g ei nc o p dc a s e s c d 6 2 pa n d p a c - 1s h o w e di n c r e a s i n gi nc o p dc a s e s i th a v ec o r r e l a t i o nw i t hp l a t e l e t a c t i v a t i o na n dt h r o m b o g e n e s i sd a m a g e db l o o dv e s s e le n d o t h e l i u mb e c a u s e c o p dc a s e sb ei no x y g e n - p o o rs ol o n gt i m e ( 4 ) a f t e ri n t e r v e n t i o np l a t e l e tp a r a m e t e r sh a dc h a n g ea n dc d 6 2 p a n dp a c 一1 s h o w e dd e c r e a s i n ga f t e ri n t e r v e n t i o nt a k i n ga s p i r i n i tm a y b eh a v ec o r r e l a t i o n w i t ht h a ta s p i r i nd i m i n i s h e dt h ep r o d u c t i o no ft x a 2t h a tc a np r e v e n tp l a t e l e t a g g r e g a t i o n ( 5 ) t od e t e c tt h ec h a n g e so fp l a t e l e tp a r a m e t e r s ，c d 6 2 pa n dp a c l ，w ec a n e a r l yd i a g n o s i st h et h r o m b o d i s e a s e sa n dp r e v e n tt h e m k e yw o r d sa g e i n g ，p a r a m e t e rl e v e l b l o o dp l a t e l e t ；i n d e xo fa c t i v a t e d ； i n t e r v e n t i o n ；h y p e r t e l l s i o n ；c h r o n i c o b s t r u c t i v e p u l m o n a r y d i s e a s e ；a s p i r i n 英文简称英文全称 p l t p c t m p v p d w c d 6 2 p t x a 2 p t s f c m r g d s g pi ib i i ia g m p 一1 4 0 p e r c p c o p d p f a p a r s f i b r c a p m c a b c a m p p s g l 1 p d e r a a s 符号说明 b l o o dp l a t e l e tc o u n t p l a t e l e th e m a t o c r i t m e a np l a t e l e tv o l u m e p l a t e l e td i s t r i b u t i o nw i d t h p s e l e c t i n t h r o m b o x a n ea 2 p r e t h r o m b o t i cs t a t e 中文对照 血小板计数 血小板压积 平均血小板体积 血小板宽度 p 一选择素 血栓素a 2 血栓前状态 = l j 月i j舌 人口老化是本世纪人类面临的一个主要难题，为了有效地延缓衰老，许 多研究在分子水平了解衰老的机制【2 】。随着年龄的增长血栓性疾病发病率及 死亡率迅速上升，血栓性疾病无论在我国还是西方国家都己成为人类疾病的 主要死亡原因之一，存活者中5 0 7 0 病人生存质量严重下降。血小板参与 血栓的形成、栓塞的发生、血管的痉挛和缺血后组织的迟发性损害等各个环 节。研究显示高血凝状念与血小板的变化有关。 血小板大多数来源于骨髓成熟巨核细胞。血小板的数量及体积一方面反 映骨髓中巨核细胞的增生、代谢及血小板生成情况；另一方面显示循环中血 小板的年龄。一般认为，由于机体的免疫作用，衰老、体积小的血小板破 坏增多，血小板总数减少，年青的大的血小板相对增多，致使m p v 值变大； 骨髓损伤造成m p v 正常或减低。血小板活化功能包括早期活化标志 g pi ib i i ia 复合物纤维蛋白原受体( p a c 1 ) 和晚期活化标志p 选择素( c d 6 2 p ， g m p l4 0 ) ，其中c d 6 2 p ，是活化血小板最特异和灵敏的标志物1 3 】。活化的血 小板通过释放血管活性物质，促进血小板的粘附、聚集以及损伤血管内皮细 胞，形成血栓使血管腔狭窄或阻塞，导致血栓栓塞性疾病的发生。 血栓形成涉及到血管内皮细胞、血小板、凝血抗凝、纤溶抗纤溶等环 节。在诸多环节中，血小板的活化、粘附和聚集无论在早期生理止血还是病 理的血栓形成过程中均起着重要作用。血小板是血液中最小的颗粒成分。活 化血小板是血栓的组成成份之一，可循环于血液中，即循环活化血小板 ( c a p ) 。活化血小板与静止血小板相比，其表面膜糖蛋白( g p ) 分子的种类、 数量、分布和构型等有显著不同1 4j 。血小板膜糖蛋白g pi ib i i i a ( p l a t e l e t m e m b r a n eg l y c o p r o t e i ni ib - i i lac o m p l e x ) ，p 一选择素( p a c - 1 ) 在上述过程中扮 演了非常重要的角色。g p1 ib i l la 属整合素家族黏附受体，是血小板上含量 最丰富的膜糖蛋白，是粘附蛋白纤维蛋白原( f b g ) 的受体。g pi ib i l la 在血小 板活化过程中由o c s 和0 【颗粒膜释放转向膜外15 l ，同时血小板空间构型发生 改变，暴露出纤维蛋白原受体，使纤维蛋白原与其交联成网，导致血小板聚 集，形成血小板血栓，从而诱发随之而来的血栓形成的瀑布式链反应。血小 板q 一颗粒膜蛋白14 0 ( g r a n u l em e m b r a n ep r o t e i n 一14 0g m p 14 0 ：c d 6 2 p ) 是一种 相对分子量14 0 k d 的膜糖蛋白，通常储存于血小板0 【颗粒膜和血管内皮细胞 w e i b e l p a l a d e d , 体内，血小板活化时q 一颗粒膜与质膜融合，p 选择素暴露于 血小板质膜表面，成为血小板活化的重要标志。循环活化血小板中的p a c 1 是血小板活化早期的标志物，即活化的g pi lb i i i a 复合物，而c d 6 2 p 是血小 板活化后期的标志物 6 1 ，即g m p 1 4 0 。 近年来血小板的正常生理功能越来越受到重视，研究显示血小板活化是 许多疾病的发病机制之一，包括：动脉硬化症、冠状动脉疾病、脑血管疾病及 糖尿病等，吸烟、口服避孕药等都可诱发血小板活化。而年龄对血小板参数及 活化蛋白的研究较少。近年来随着流式细胞技术的不断发展，利用血小板膜 表面糖蛋白分子p a c 1 、c d 6 2 p 的特点，可对血小板的功能状态进行检测i 7 1 。 本研究检测了不同年龄组血小板四参数，膜糖蛋白变化，以及高血压病组和 慢性阻塞性肺疾病组干预前后的变化，为指导临床预防、诊治和估计血栓性 疾病提供方便、可行的依据。同时也为抗血小板药物的应用提供了理论依据 从而减少血栓性疾病的发生。 材料与方法 l 、研究对象 与本院查体中心合作，根据2 0 0 8 年干部查体信息找出既往无明显心、脑、 肺、肝。肾疾病和高血压、糖尿病、肿瘤、风湿性疾病、慢性感染等疾病史， 再行血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂、血糖、心电图、x 线胸片等 辅助检查正常的体检者4 0 0 例，用于分析血小板参数。筛选同期健康体检者 9 0 例用于血小板活化蛋白的分析，同时选出年龄相当的3 0 例作为高血压组， c o p d 组的健康对照。 搜集老年病二病区2 0 0 9 年3 月2 0 lo 年2 月期间患高血压病，慢性阻塞性肺 病患者各3 0 例。 1 1 入选病例标准 ( 1 ) 健康增龄组根据2 0 0 8 年干部查体信息找出既往无明显心、脑、 肺、肝。肾疾病和高血压、糖尿病、肿瘤、风湿性疾病、慢性感染等疾病史， 且血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂、血糖、心电图、x 线胸片等辅 助检查在正常范围内的受检者4 0 0 例，用于血小板参数的分析：另在查体中 心筛选9 0 例健康体检者，用于血小板活化蛋白的检测，同时选出年龄相当的 3 0 例作为高血压病组和c o p d 组的健康对照。 ( 2 ) 高血压病组根据2 0 0 5 版中国高血压防治指南高血压组入选 标准：高血压的诊断标准：非同日3 次血压测量，收缩压2 1 4 0m m h g 或( 和) 舒张压2 9m mh g 者诊断为高血压。收缩压兰l4 0 m m h g 但舒张- 压, 9 0 m m h g 列为单纯收缩期高血压。 剔除标准：继发性高血压患者；有肾功能不全尿毒症期患者；合 并糖尿病患者；合并血液系统疾病患者；肝功能改变患者；心功能不 全；近期内应用过抗血小板药物。 ( 3 ) 慢性阻塞性肺病组根据慢性阻塞性肺疾病诊治指南( 2 0 0 7 年 修订版) 筛选病人。即慢性阻塞性肺疾病( c o p d ) 是一种具有气流受限特 征的可以预防和治疗的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部 对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。存在不完全可逆性 气流受限是诊断c o p d 的必备条件。肺功能检查是诊断c o p d 的金标准。在吸 入支气管舒张剂后，第一秒用力呼气容积( f e v1 ) 用力肺活量( f v c ) 6 0 岁( 老年组) 。一般临床资料：成年组15 6 例( 男 8 6 例，女7 0 例，) ，老年前期组14 4 例( 男8 8 例，女5 6 例) ，老年组l0 0 例( 男 6 4 例，女3 6 例) ，用于血小板参数的分析；另在查体中心筛选9 0 例健康体检 者，每组3 0 例用于血小板活化蛋白的检测，同时选出年龄相当的3 0 例作为高 血压病组和c o p d 组的健康对照。 高血压病组3 0 例( 男2 0 例，女1 0 例，平均年龄5 8 9 士5 0 岁) 。 慢性阻塞性肺病组3 0 例( 男16 例，女14 例，平均年龄6 0 9 + 5 7 岁) 。 1 3 干预方法高血压病、慢性阻塞性肺病患者，入院后化验血常规，检 测血小板，血小板活化蛋白p a c 1 、c d 6 2 p , 高血压病组有效控制血压 ( 牛14 0 9 0 m m h g ) 给予阿司匹林肠溶片10 0 m g 干预治疗，慢性阻塞性肺病组 入院后即给予阿司匹林肠溶片10 0 m g 干预治疗。10 天后检测血小板参数，血 小板活化蛋白的改变。 2 试剂与仪器 2 1 血小板 2 1 1 仪器 2 1 1 1f a 2 1 1 2 s y 式会社 2 1 1 3 海 2 1 1 4f a 2 1 1 5p h 2 1 1 6 微 产品 2 1 1 7 含 份有限公司 2 1 1 8 一次性12 木7 5 m m f a l c o m 聚苯乙烯试管，美国b d 公司提供 2 1 2 主要试剂 2 1 2 1c d 6 1p e r c p ：多甲藻叶绿素蛋白( p e r i d i n i nc h l o r o p h y l l p r o t e i n ，p e r c p ) 标记的抗c d 6 1 单克隆抗体，特异的泛血小板表面标记，既 与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。c d 6 1 与c d 4 1 联合，即为血小 板表面g pi ib i l la 复合物。在本试验中，用f l 3 设阈值，设定血小板门。批号： 3 4 0 5 0 6 美国b d 公司 2 1 2 2c d 6 2 pp e ：藻红蛋白( p e ) 标记的抗c d 6 2 p 单克隆抗体，血小 板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内a 颗粒 含有c d 6 2 p ，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达 c d 6 2 p 。批号：2 0 0 9 1 0 0 8 天滓协科生物技术有限公司 2 1 2 3p a c 一1f i t c ：异硫氢酸荧光素( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，f i t c ) 标记的抗血小板活化g pi ib i l la 即纤维蛋白原受体( f i b r ) 的单克隆抗体， 早期血小板活化的标志物，即抗体与活化后血小板膜表面的g pi ib i i i a 复合 物纤维蛋白原结合位点相结合。抗体为i g m 型，建议使用p a c 1 结合阻断剂 r g d s 做阴性对照；批号：3 4 0 5 0 7 美国b d 公司 2 1 2 4m o u s e l g gp e ：藻红蛋白( p e ) 标记的鼠l g g ，用作c d 6 2 p p e 的同 型对照，排除血小板自发荧光、f c 受体介导的抗体和非特异性抗体结合等影 响结果的因素。批号：2 0 0 9 10 0 8 天津协科生物技术有限公司 2 1 2 5 人工合成的精氨酸甘氨酸一门冬氨酸丝氨酰多肽 ( a r g g l y a s p s e r ，r g d s ) ：r g d s 多肽可与纤维蛋白原受体特异性结合，从而 完全阻断p a c 1 与维蛋白原受体结合，用做p a c 1f i t c 的阴性对照。使用时 以p b s 配制浓度为10 m g m l ，小量分装，一2 0 以下低温保存，临用时解冻。批 号：a 9 0 4l m g ，美国s i g m a 公司。 2 1 2 6 1 多聚甲醛( p a r a f o r m a l d e h y d e ，p f a ) ：以p b s 酉p , 制浓度为4 ，放 置2 8 冰箱保存，使用前以p b s 稀释成1 ，用于血小板的固定，北京益利 精细化学品有限公司。 2 1 2 7 p b s 缓冲液博士德生物有限公司，盐酸调整p h 值为7 2 + 0 2 ， 使用前预先经0 2 u r n 滤纸过滤。 2 1 2 8 流式细胞仪三色标准微球c a l i b r i t et m 3 k i t ：b d 公司产品，用于 仪器的调试与光路校准。 2 1 2 9 阿司匹林肠溶片10 0 r a g 片德国拜耳公司 2 2 血小板参数的检测 抗凝式管2 乙二胺四乙酸二钾( e d t a z k ) 抗凝管，用于血小板参 数的测定，批号：0 9 0 6 15 5 ，沧州医药股份有限公司 s y s m e xx t - 18 0 0 i 多项目血球分析仪，日本s y s m e x ( 希森美康) 株式会 社 3 研究方法 3 1 标本采集 受试者二周内未服用阿司匹林、潘生丁、肝素等影响血小板功能的药物 并常规禁食12 4 , 时后，于清晨6 1 3 - j 至7 时采取肘静脉血，抽出的前2 m l 血检测 血生化项目，再抽取5 m l 血液，置入含有2 乙二胺四乙酸二钾( e d t a 2 k ) 抗凝剂的塑料试管中，用于检测血小板的参数，最后取血2m l 放入3 2 枸橼 酸钠抗凝真空采血管混匀后立即进行实验，标本采集后2 小时内完成p a c 1 、 c d 6 2 p 检测。 3 2 血小板参数的检测 3 2 1 患者晨起空腹时，在肘静脉抽取5 m l 血液，置入含有2 乙二胺四乙 酸二钾( e d t a 2 k ) 抗凝剂的塑料试管中，血液与抗凝剂的比例为lo ：1 。 3 2 2 采血后2 小时内由检验科利用自动血细胞分析仪进行血常规检查。 3 3 血小板膜糖蛋白的检测 3 3 1 晨起空腹时经肘前静脉取血2 m l 放入3 2 枸橼酸钠抗凝真空采血 管，血液与抗凝剂的比例为9 ：1 ，于l0 分钟之内完成染色步骤。抽血过程中 要避免由于血管壁损伤而释放活化信号激活血小板。抗凝不用2 乙二胺四乙 酸二钾( e d t a 2 k ) 抗凝剂，因其在3 7 。c 中孵育5 分钟便会引起血小板的某 些蛋白与抗体的结合率下降，如g p1 1b 1 1 1a 复合体；避免使用肝素抗凝，因 为肝素会引起某些敏感人群的血小板活化。 另外，要减少血小板的聚集，流式细胞仪不能检测聚集血小板中的每个 血小板所表达的抗原数量。这是因为流式细胞仪只能检测每个颗粒的表达荧 光而无法区分这个颗粒是由单个血小板还是由一定数量血小板聚集而成。在 准备全血标本时，可依据以下标本处理方法使血小板聚集现象减到最低。在 抽血前准备好所有在标本处理过程中所需试剂，以免延误时间；抽血时，针 管不要细于2 1 号；平稳放松的抽出血液；弃用i j i f 2 m l 血液；使用聚乙烯试管 或针筒；立即与抗凝剂混均；不要进行洗涤、离心、过滤、晃动等剧烈的处 理步骤；加入缓冲液稀释血小板浓度；加入试剂后轻轻混均，并静置孵育。 3 3 2 采用流式细胞术测定p a c 1 、c d 6 2 p 的表达 检测原理【9 】：血小板特异性膜蛋白检测本实验先对全血中的血小板膜 蛋白进行免疫荧光标记，将血小板与其他细胞分丌。根掘血小板特异性膜蛋 白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板，本实验应用c d 61 p e r c p 特异的泛血小板表面标记。活化血小板的标志物检测活化血小板与 静息血小板相比，其膜蛋白常发生显著变化，其变成为活化血小板的检测标 志物，p a c 一1 早期血小板活化的标记物，c d 6 2 p 晚期血小板活化的标记物。 将待测标本制备成单细胞悬液，经特异性荧光染色后加入样品管中，由气压 装置送入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排列成单列并 被鞘液包绕形成细胞液柱，逐个通过喷嘴，与水平方向的激光光束垂直相交， 进入激光聚焦区。产生散射光和荧光信号，接收后经a d 转换成数字信号送 计算机处理，再在计算机上直观的统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分 率。 3 3 2 1f a l e o n 管编号； 3 3 2 2 在对照管中加入p a c 一1 、i g glp e ( c d 6 2 pp e 同型对照) 、 c d 6 1 p e r c p 荧光抗体各2 0 9 l ，r o d s ( p a c l 阻断剂) 1 0p 1 ； 3 3 2 3 在实验管加入p a c 一1f i t c 、c d 6 2 pp e 、c d 6 1p e r c p 荧光抗体 各2 0 9 l ，( 见表1 ) ： 3 3 2 4 在对照管和试验管中各加入血标本5 u 1 ，混匀孵育15 2 0 分钟； 3 3 2 5 在对照管和试验管中各加入1m l 冷的l 多聚甲醛固定液，混匀避 光放置3 0 分钟； 3 3 2 6 采用流式细胞仪检测，2 4 d , 时内上机； 3 3 2 7 用c e l l q u e s t 软件获取并分析样本，打开c e l l q u e s t 软件，设激发 光波长为4 8 8 n m ，发射光波长为5 2 5 n m ，以标准荧光微球调整c v 值至成2 ； 3 3 2 8 调前向角光散射( f s c ) ，侧向角光散射( s s c ) 和荧光信号均为对 数放大，阈值设在c d 6 1 p e r c p 上；在s s c 币dc d 6 1p e r c p 点图上圈定所有的血小 板群，包括与白细胞粘附的血小板； 3 3 2 9 以c d 6 lp e r c p 矛i 侧向角光散射双参数设血小板门、以同型对照 管设定阴性群体，活化血小板染色的标本调节补偿，c d 6 1p e r c p p a c 1f i t c 同型对照p e 调节f i t c 对p e 的干扰；c d 6 1 p e c p 同型对照f i t c c d 6 2 p p e 调节 p e 对f i t c 的干扰。测定10 0 0 0 个血小板，计算p a c 1 、c d 6 2 p 阳性表达百分 率。 3 3 2 10 结果分析： 在c d 6 1v s s s c 点图中设门找血小板群( 如图j ) 。c d 6 1v s s s c 点图显示有三 群，c d 61 阳性低s s c 一群主要由单个血小板组成，c d 6l 阳性高s s c 一群主 要由黏附血小板的血细胞组成，c d 6 i 阳性散射光更低的一群主要由血小板 来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、 颗粒度会有交叉，因此，不建议使用f s c s s c 图设门( 如图2 ) 。在c d 6 1v s s s c 点图中找出c d 6 1 阳性的血小板群( 单个血小板和黏附在w b c 上的血小板) ，设 定血小板门。 3 3 2 1 1 质控标本 阴性对照：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性 和纯度，应与试管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时 使用，以避免补偿造成的误差。( 如图3 ) 注意事项【9 】： 采血时请用大号针管，抽出的前2 m l 血应弃去不用。 尽量避免标本受到物理振动。 取血后1o 分钟内完成染色操作。 在f a l c o n 管中加血标本5 u l ，管壁上不能