（动物学专业论文）鲈鱼头肾cdna文库的构建与免疫相关基因的筛选及中肾ncc基因的研究.pdf

山东师范大学博士学位论文 鲈鱼头肾c d n a 文库的构建与免疫相关基因的筛选 及中肾n c c 基因的研究 中文摘要 本文构建了鲈鱼头肾c d n a 文库，并筛选了免疫相关基因，同时对中肾中起 离子调节作用的n c c 基因进行了基因克隆和免疫组织化学定位等研究。 鲈鱼头肾c d n a 文库的构建。鲈鱼是我国沿海一种重要的养殖鱼类，以其肉 质细腻鲜美而深受欢迎，但是近年来随着鲈鱼养殖规模的不断扩大，病害也日趋 严重。抗生素的使用不但会造成药物在鱼体内的富集、残留，也会危害人类的健 康问题，造成环境污染和破坏生态平衡。因此从鱼体本身的抗病力出发，研究如 何提高机体对疾病的抵抗力，增强免疫力，揭示机体的免疫抵御机制有助于减少 病害的发生和对整体养殖环境的净化，进而提高生产，降低污染和药物残留，实 现可持续健康养殖。 成年鱼类的主要免疫器官是头肾，其中无肾单位结构，而分布有大量的t 、 b 淋巴细胞，吞噬细胞和粒细胞等，是特异性免疫和非特异性免疫赖以实现的物 质基础。本文采用分子生物学方法构建了鲈鱼头肾地a p e x p r e s sc d n a 文库。提 取鲈鱼头肾r n a ，纯化得到了质量较高的n 瓜n a 。在s t r a t a s 嘶p t a s e 作用下将5 p g 删f m a 反转录合成第一链，第二链用p 如p 0 1 y m e r a s e 合成双链的c d n a ，之后连接 & 积i 接头，经砌di 酶切得到具有粘性末端的双链c d n a ，经c h r o m a s p 玳4 0 0 分级分离，将5 0 0 b p 以上的片段连接入地a p e x p r e s s 载体，体外包装成噬 菌体粒子，测定c d n a 文库初级库滴度为1 7 1 0 5 曲l m i ，扩增后的文库滴度达到 5 1 0 9 p 丘l m i ，插入片段主要分布在5 0 0 2 0 0 0 b p ，说明成功构建了鲈鱼头肾c d n a 文库。采用小规模测序和设计特异引物p c r 方法对构建的c d n a 文库进行了筛选 和分析。共得到7 6 个e s t 序列，其中筛选到了8 个免疫相关基因，占已知基因的 1 5 1 ，占筛选到的总基因的1 0 9 。与免疫相关的8 个基因分别是，免疫球蛋白 重连( 垃 阳拶砌口加) ，尬，干扰素诱导的g f ，亚厦，脑。韶和孙肛a ，趋化 因子，巨噬细胞集落刺激因子。对主要免疫相关基因分别进行了同源性比对和序 列进化分析，结果表明，这些基因均与同属鲈形目的鱼类同源性最高，分子进化 山东师范大学博士学位论文 分析表明，这几类基因的进化地位与传统进化分析趋势一致。文库筛选结果表明， 本次构建的鲈鱼头肾c d n a 文库质量较高，并可以广泛用于免疫相关基因的筛选、 表达和调控研究。 鲈鱼中肾n c c 基因的研究。鲈鱼是一种广温、广盐性鱼类，对环境中盐度变 化适应能力很强，能在海水、半咸水和淡水中生活，能迅速适应不同环境中盐度 的变化。钠氯共转运子n c c ( n a c lc o n 觚s p o r t e r ) 是分布于上皮细胞顶端的一类 1 2 次跨膜蛋白，向胞内同向转运等量的钠离子和氯离子，属于电中性离子转运体 家族的成员。 本文根据g e n b a n k 中已有的n c c 同源序列，从鲈鱼中肾中克隆到了n c c 基 因，利用p c r 拼接和3 r a c e 结合的方法，扩增到了3 3 4 6 b p 的n c c 片段，并对其 序列特征进行了分析和同源比对。同时分别对在淡水适应o 、3 、7 和1 4 天的鳃组 织、肠组织和中肾中n c cm r n a 水平的变化进行了r e a l t i m ep c r 检测。结果表 明，这3 种组织均在淡水适应第3 天达到最高值，之后随着时间的增加，n c c 的含 量逐渐降低，在鳃组织和中肾中，在1 4 天时仍高于初始值；肠组织中则随时间增 加逐渐降低，在1 4 天时降到最低水平，且低于初始值，上述结果表明，鳃组织、 肠组织和中肾在鱼类适应淡水过程中起重要的n a + 、c 1 调节作用，而n c c 则表现 为机体对外界环境盐度变化的应激反应和调节，待机体适应淡水环境后，又逐渐 降低，表现为机体对淡水环境的适应。为研究n c c 蛋白在鲈鱼中肾的分布情况， 我们选择了n c c 的羧基端氨基酸序列进行了大肠杆菌原核表达，经1 m m 口t g 诱 导，结果表明表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，选择表达量最高的1 6 小时大 量制备目的蛋白，经切胶免疫新西兰雄兔，得到了抗血清。对中肾进行石蜡切片， 进行了中肾组织学和n c c 蛋白的免疫组织化学定位研究。结果表明，鲈鱼中肾肾 单位数量较少，分布有大量的肾小管，其中近端小管占比例较大，而远端小管相 对较少；免疫组织化学定位表明，n c c 蛋白特异分布在鲈鱼中肾的远端小管和集 合管上皮细胞顶端。 关键词：鲈鱼，头肾，免疫相关基因，中肾，n c c 中图分类号：q 7 l i 山东师范大学博士学位论文 c o n s t r u c t i o na n d s c r e e n i n go ft h eh e a d l i d n e yc d n al i b r a r y f r o mj a p a n e s es e ab a s s 口纪d 肠易朋却d 力记h s ) a n dt h er e s e a r c h o nt h e 舰o f t h e m i d l 【i d n e y a b s t r a c t t h i sp 印e rc o n s i s t s伽op a r t s ，o n ei st h ec o i l s t n l c t i o na n d s c r e e i l i n g o f i m m l l l l e - r e l a t e dg e n e so ft l l eh e a d k i d l l e yc d n al i b 砭眄f h d mj a p a n e s es e ab a s s ；t 1 1 e o t h e ri su 1 er e s e a r c ho nt h e c co fm ei m d k i n e y j 印a i l e s es e ab a s s 伍d 纪d 肠6 慨印d 行f c 姗) i sam a r i n e6 s hw i t l l 伊e a tc o m m e r c i a l v a l u ee s p e c i a l l yi na s 诚1 1 1 b r e e d i n gf 如n s ，l l i l f a v o r a b l e c o n d i t i o i l so r p o o r m 锄a g e m e n tp r a c t i c e sm a yp u ts t r e s so nf i s h e s ，w m c hw i l lc a u s er e d u c t i o no fg r o w m r a t e ，i 玎】i 】舢es u p p r e s s i o na n dv a r i o u si 1 1 f e c t i o u sd i s e 2 l s e s t bd k l t e ，g e n e t i ck n o w l e 起e o ns e ab a s si 珈m 吼er e l a t i v eg e n e sr e s p o n s i b l ef o rr e s i s 切n c et op a _ t h o g e i l si sp 0 0 r p r 0 伊e s si i lt h e s er e s e a r c h6 e l d sw i l lh a l v es i 鲥f i c a i l tv a l u ei nt h en e a rf i m l r e t l l eh e a dk i 血e yo ft e l e o s t ss e n ，e sa s 胧曲i l 玎_ 1 1 1 _ u i l eo 略a i la i l dp l a y sa 1 1i m p o n a n t r o l ei 1 1s p e c i f i ca n dn o n s p e c i f i ci i n n n l n ed e f e n c e s ac d n a e x p r e s s i o nl i b r a r y 仔o mh e a d1 ( i d n e yo fj 印a l l e s es e ab a s sw a sc o n s t m c t e d t 1 1 ef i r s t - s 舰n dc d n aw a ss y n t h e s i z e dw 曲m o l o n e ym u 血ek u l ( a e i l l i av 打u s r e v e r s em m s c r i p t a u s ew i 也5 峰m r n aa n dt h ed o u b l e s t r ；m d e dc d n aw a sd i g e s t e db y 勋die n z y i n e s i z e 仔a c t i o n a t i o nw a sp e 而m e do nc h r o m 【as p i n _ 4 0 0c o l u l n i l j s c d n a 丘a g m e n t sl o n g e rt 1 1 a i l5 0 0b pw e r el i g a t e di n t ot h e 地a p e x p r e s sv e c t o r t h e r e c o r n b i 彻md n aw a sp a c k a g e d 切1 ，f 肋w i mg i g 印a c ki i ig o l dp a c k a 百n ge x t r a c t t h et i t e r so fm ep r i m a r ya 1 1 d 锄p l i f i e d1 i b r a 巧w e r e1 7 1 0 5p la r l d5 0 1 0 9 p 削i n i 。r e s p e c t i v e l y t oc h a r a c t 耐z et 1 1 ec o n s t m c t e dc d n al i b 哪! 5p h a g ep l a q u e s w e r es e l e c t e dr a n d o m l yt 0t e s tt h ei n s e r t e d 丘a g m e n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i i l s e r t sw e r ei n o s t l y1 0 n g e r 5 0 0b p s m m l s c a l es e q u e n c ea i l dp c rw i ms p e c i f i cp r i m e r sf o ri m m u n e r e l a t e dg e n e s w e r ec o n d u c t e df o r l es c r e e i l i n go ft l l ec d n a1 i b 聊y7 6e s ts e q u e n c e sw a s 0 b t a i n e d 舶mm es c r e e n i n g 8i m m u i l e r e l a t e dg e n e s ( 蹭办叩砂砌口纫，死尺，胸仍8 8 ， l i i 山东师范大学博士学位论文 抚g 座卫a i l d 刀、7 f 仉c c 幽册z d 七切e 锄dc 跖i 一2 ) w e r eo b t a i n e da i l ds h o w e d1 5 1 o f1 【i l o w n e dg e n e s ，l0 9 o fa l lt h e0 b t a i n e de s ts e q u e n c e s t h eh o m o l o g ya n d p h y l o g e n e t i ca l l a 】y s i so nt l l em a i ng e n e ss h o w e dt h a lt h e ya l lh a d t 1 1 e1 l i 曲e s ti d e n t i t y t 0m es p e c i e so f 尸愆扣，聊劣，w 1 1 i c hw a sc o n s i s t e n tw i m m es y s t e m a t i cc l a s s i f i c a t i o n t h er e s u l t sm d i c a t e dt h a tt 1 1 ec d n al i b r a 巧w a sc o n s t m c t e ds u c c e s s 亿l l y ，a i l dc o u l db e u s e df o rt l l es c r e e l l i n go ft h ei m m u n e - r e l a t e dg e n e s j 印a i l e s es e a b 嬲si sae u r y h a l i n ef i s h ，i sa _ b l et ol i v ei nw a t e r sw i t haw i d e 姗g eo f s a l i 血够a 1 1 dm a i n t a i nn e 盯l yc o n s t a i l ti o nc o n c e n 仃a t i o n so f b o d yf l u i d si 玎e s p e c t i v eo f m ee x t e m a ls a l i l l i 吼i i lp a t i c u l a r ，d i s p l a y i i l gar e m a r k l b l ep l a s t i c i 够w h e ni tc o m e st 0 a 由u s t i n gi o n 衄l s p o r ti nr e s p o n s et 0c h a i l g e si i le n v i r 0 啪e n ts a l i i l i 哆n c c ( n a c l c o 纽a n s p o r t e r ) i sap r o t e mw i t l l12 仃a n s m e m b r a n e s p a n n i n gs e g m e m s ，a n da p i c a l l y l o c a t e di nt 1 1 e 印i m e l i a lc e l l s ，a n di so n eo ft h em e n l b e r so fm ee l e c 仃d n e u t r a l ， c a t i o n - c 1 1 l o r i d ec o t r a n s p o f t e r sf 撕ly ，w 1 1 i c hp l a yai m p o r t a n tr o l eo fi o nr e g u l a t i o n t h en c cw 硒c l o n e d 劬mt 1 1 er 1 1 i d - l 【i d n e yo ft l l ej a p a n e s es e ab a s sa c c o r d m gt 0 m es p e c i f i cp r i m e r sd e s i g n e db ym ek n o w ns p e c i e s b a s e do nt h ep c rc o r n b i n a t i o n a i l dt l l e3 - r a c ep c r ，ac d n a ，3 3 4 6 b p1 0 n g ，w a s0 b t a i n e d 舶mt h ei i l i d k i d i l e y t h eh o m o l o g ya n dp h y l o g e n e t i 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l er e u l t ss h o w e d l a t 也en c co fj 印a 1 1 e s e s e ab a s sw 嬲l o c a t e di 1 1t h ed i s t a ld u c t i n gc e l l sa 1 1 dc 0 1 l e c t i n gc e l l s k e y w o r d s ：j a p 锄e s es e ab a s s ，h e a d - k i d l l e y ，i i l l i l l u i l e - r e l a t c dg e n e s ，r n j d - k i d l l e y ，n c c v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 魏研占撬 新婷 学位论文版权使用授权书 ，一1 聊刊 l 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权i 盟可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 槲虢研占涛 翩替劳谓 签字日期：2 0 0 9 年牛月f 日签字日期：2 0 0 9 年斗月f 日 山东师范大学博士学位论文 一鱼类免疫学研究进展 第一章综述 近3 0 年来，鱼类免疫学已经成为一门新兴的学科，随着高等动物免疫学研究 的迅猛发展以及新技术的产生，许多新技术和思路也应用到了鱼类免疫学研究 中，因此得到了十足的发展【l ，2 】。对鱼类免疫学的研究不仅可以从系统发育研究 脊椎动物免疫系统的进化规律，也为研制鱼用疫苗来提高鱼体免疫力、防治养殖 病害并促进渔业发展提供了理论依据【3 】。免疫是指机体识别和排除抗原性异物的 功能，免疫系统是指具备这种功能的防卫系统，是免疫反应产生的物质基础，它 的功能主要包括免疫防御、免疫自稳和免疫监视3 个方面【4 1 。鱼类的免疫系统是 指鱼体对外来异物能产生免疫应答的，并与鱼体器官及细胞之间的些协调系统 的结构和成份，是鱼体执行免疫功能的机构和产生免疫应答的物质基础，由免疫 器官和组织、免疫细胞和体液免疫因子组成【5 】。鱼类的免疫同哺乳动物一样分为 固有免疫和适应性免疫两种，执行固有免疫功能的有吞噬细胞、自然杀伤细胞及 血液和体液中存在抗菌分子，在鱼类天然免疫中发挥着重要的作用【1 】。鱼类的适 应性免疫应答又包括细胞免疫和体液免疫两种类型。鱼类在进行自身免疫保护 时，通过特异性免疫和非特异性免疫共同调节机体对外来异物的反应。 1 鱼类免疫组织和器官 免疫组织是免疫细胞发生、分化、成熟、定居、增殖以及产生免疫应答的场 所。硬骨鱼类免疫系统的组织和器官主要包括：胸腺、肾脏、脾脏、粘膜相关淋 巴组织( n m c o 跏嬲s o c i a t e dl y n l p h o i dt i s s u e ，m a l t ) ，与哺乳动物免疫组织和器 官相比，鱼类免疫系统中没有骨髓和淋巴结。 1 1 胸腺 鱼类的胸腺由胚胎时期的咽囊发育而成，一般认为是鱼类的中枢免疫器官 【6 】。鱼类的胸腺是在免疫组织发生过程中最先获得成熟淋巴细胞的器官。鱼类胸 腺在发育过程中逐渐与头肾靠拢，伴随有明显的细胞迁移发生，是鱼类淋巴细胞 增殖分化的主要场所，并向血液和外周淋巴器官输送淋巴细胞【7 】。鱼类胸腺可分 为内区、中区和外区三部分，内区和中区在组织结构上类似于高等动物胸腺的髓 山东师范大学博士学位论文 质和皮质。目前基本上认为胸腺是t 细胞的发源地，主要承担细胞免疫的功能【8 1 。 另一方面，鱼类胸腺随着性成熟和年龄的增长或在外环境的胁迫下会发生退化， 卢全章9 1 的研究表明：草鱼从鱼苗到i 龄或i i 龄，胸腺内淋巴细胞增殖较快，是 草鱼免疫系统发育成熟的重要时期，i i 龄以上的草鱼开始出现年龄性胸腺退化现 象。a 1 v a l r e a 【1 0 1 的研究认为在一年内各月胸腺细胞的数量、胸腺大小以及各区间 的比例也呈现出规律性的变化。 1 2 肾脏 随着成鱼胸腺组织的退化，肾脏是成鱼最重要的淋巴组织。鱼类的肾脏是继 胸腺之后第二个发育的免疫器官，可分为头肾( p r o n 印h r o s ) 、中肾( m e s o n e p h r o s ) 和后肾( m e t a i l 印l o s ) 【1 。随着鱼体的生长，头肾逐渐失去排泄功能，保留了造血 和内分泌的功能【1 2 】，而成为造血器官和免疫器官。后肾作为排泄器官，其管间 区在造血和免疫方面也具有一定作用，鱼类头肾不依赖抗原刺激可以产生红细胞 和b 淋巴细胞等，相当于哺乳动物的骨髓；另一方面，受抗原刺激，头肾和中肾 细胞会出现增生，利用溶血空斑和免疫酶技术已经证实头肾和中肾都存在抗体产 生细胞，表明肾脏又是硬骨鱼类重要的抗体产生器官，相当子哺乳动物中的淋巴 结，因此硬骨鱼类的肾脏有相当于哺乳动物中枢免疫器官及外周免疫器官的双 重功能【1 3 】。鲈鱼头肾中含有大量的淋巴细胞、红细胞和巨噬细胞等14 1 。卢全章 对草鱼头肾研究发现：头肾器官的重量基本上是随体重和鱼的年龄与体重增长 的。 1 3 脾脏 脾脏是鱼类中唯一的淋巴样器官，器官发育上晚于肾脏【15 1 。脾脏是鱼类红 细胞、中性粒细胞产生、贮存和成熟的主要场所，具有造血和免疫功能1 6 】。它 由红髓和白髓组成，包括椭圆形的淋巴小泡，内有大量的淋巴细胞、巨噬细胞和 黑色素吞噬细胞。与肾脏相比，脾脏在体液免疫反应中处于相对次要的地位，而 受抗原刺激后其增殖反应以弥散的方式发生在整个器官上【1 7 1 8 】。 1 4 粘膜相关淋巴组织 粘膜相关淋巴组织是除上述的免疫器官外重要的免疫组织。具有分散的淋巴 2 山东师范大学博士学位论文 细胞生发中心，不具备完整的淋巴结构，主要包括皮肤、鳃和肠道【1 9 1 ，这些组 织及由这些组织中分布的各种粘液细胞分泌的粘液构成了鱼体抵抗病原入侵的 第一道屏障【2 0 1 。这些分散的淋巴组织在免疫原的摄取方面有着重要的作用，在 鱼类的免疫保护方面有着重要的作用，具有独立完成局部免疫应答的功斛2 1 2 2 1 。 2 免疫细胞 凡是参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞均称为免疫细胞。鱼类的免疫细 胞主要存在于免疫组织和器官以及血液和淋巴液中。免疫细胞主要分为两大类： 一类为淋巴细胞，主要参与特异性免疫反应；另一类是吞噬细胞，在鱼类免疫中 也发挥着重要作用。鱼类的细胞免疫包括迟发型变态反应、淋巴细胞直接参加的 细胞毒性、移植物排斥反应、巨噬细胞游走抑制和混合淋巴细胞反应等【5 】。 2 1 淋巴细胞 鱼类外周血淋巴细胞的分离研究始于8 0 年代末口3 洲，最早分离的有虹鳟、金 鱼、鲤鱼和鲑鱼的的外周血淋巴细胞，为研究鱼类淋巴细胞提供了基础理论依据。 鱼类淋巴细胞的异质性问题，早在7 0 年代就引起了研究者的重视【2 5 ，2 6 1 ，但当时的 免疫学研究重点放在抗体及其产生抗体的b 淋巴细胞上，对t 淋巴细胞的大量研 究则直到9 0 年代才开始2 7 1 。哺乳动物中，t 淋巴细胞是用特异表面标记特征来确 认的，由于鱼类的淋巴细胞缺乏易于鉴别的表面标志，因而其分类至今尚不清楚 f 2 8 1 。利用半抗原载体效应和单克隆抗体等技术，已经证实鱼类的淋巴细胞也包 括t 细胞和b 细胞两个亚群阻3 0 ，3 1 ，3 2 ，3 3 1 。t 淋巴细胞有直接杀伤细胞的作用，还具 有通过分泌细胞因子调节免疫的作用，主要参与非特异性免疫反应。b 淋巴细胞 分泌抗体且在细胞表面有抗体存在，参与特异性的免疫反应。鲤鱼在孵化后几周 内，t 细胞在胸腺中可达到7 0 ，同时在头肾中也出现分布【3 4 1 。 2 2 吞噬细胞 非特异性防御系统在鱼类抵抗外来异物的入侵起着重要的作用。鱼类吞噬细 胞除使得细胞具有特异性免疫功能外，也是非特异性防御系统的重要组成部分， 在外来病原入侵的各个阶段都发挥着重要的作用。吞噬细胞受病原或宿主产生的 趋化因子作用而直接接近抗原。鱼类的吞噬细胞主要有单核细胞、巨噬细胞和各 山东师范大学博士学位论文 种粒细胞，受到微生物侵扰时，机体炎症反应的核心细胞是巨噬细胞和粒细胞， 它们能够被微生物的有害物质激活，并产生更多更有效的抗菌因子【。 2 3 单核细胞 单核细胞存在于所有硬骨鱼类血液中，鱼类的单核细胞有较多的胞质突起， 细胞内含有较多的液泡和吞噬物，可进行活跃的变性运动，据有较强的粘附和吞 噬能力，在血液中能够对异物的衰老的细胞进行吞噬消化单核细胞是在造血组织 中产生并进入各组织并在适宜的条件下发育成不同的巨噬细胞【3 5 1 。 2 4 粒细胞 哺乳类粒细胞分为3 类：嗜中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞。鱼类中，嗜中性 粒细胞是最常见的一种，但鱼类中是否存在其余两种细胞，目前尚不清楚3 7 1 。 嗜中性粒细胞具有活跃的吞噬和杀伤功能，但吞噬能力一般弱于单核细胞。 2 5 巨噬细胞 巨噬细胞在不同组织中有多种类型，在同一组织中也有不同亚型【3 引。鱼类 的巨噬细胞具有杀伤细菌及寄生虫幼虫的作用，可释放与哺乳动物的i 型、i i 型白 细胞介素和转移因子类似的免疫活性物质3 9 1 ，如细胞因子和二十四四烯酸等。 巨噬细胞接触病原微生物后，会引起呼吸爆发，还能生成肿瘤坏死因子【4 0 】。 3 鱼类的免疫应答及调节 鱼类虽然是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性。与哺乳动物一样，其 体内也存在2 种免疫应答类型：固有性免疫应答和获得性免疫应答【4 1 】。 3 1 固有性免疫应答 固有免疫应答又称非特异性免疫或天然免疫，是生物体在长期种系进化过程 中形成的天然防御功能。固有免疫是机体的第一道免疫防线，也是特异免疫的基 础【4 2 1 。在鱼体内执行固有性免疫应答功能的主要有吞噬细胞，自然杀伤细胞及 血液和体液中存在的抗茵分子，在鱼类抗感染中扮演重要角色。鱼类的非特异性 防御分为4 道防线：存在于粘膜分泌物中的蛋白酶、溶菌酶、凝集素、不提、转 移因子等非特异性分子是第一道防线；粘液细胞是第二道防线；血细胞尤其是粒 4 山东师范大学博士学位论文 细胞和单核细胞为第三道防线；最后是存在与器官和组织中的具有吞噬作用的细 胞，如内皮细胞、巨噬细胞和粒细胞等。这四道防线对外源微生物、病原和抗原 没有特异性，但能有效地清楚、降解病原微生物和其它有害物质。 3 1 1 补体系统 试验证明，抗体可特异性与细菌抗原结合，但不能杀死细菌，然而加入补体 可溶解、清除与抗体特异结合的病原体，补体因此而得名【4 3 1 。补体系统是最早 进化出来的免疫应答系统，存在于血清中，主要起到调理抗原以辅助抗原吞噬、 细胞裂解，以及趋化作用。补体系统不仅在天然免疫中有重要作用，它们也通过 调理作用辅助抗原的吞噬从而调节特异性免疫应答的水平。近年来研究表明鱼类 同时存在三种补体激活途径，分别是经凝集素依赖的途径( m b l 途径) 、替代 途径和经典途径( 抗体依赖的途径) ，在产生免疫反应过程中，这三个途径被顺 序活化，然后通过共同的末端通路，最终形成具有溶细胞作用的膜攻击复合物， 导致靶细胞溶解。c 3 是补体系统的主要成份，七鳃鳗的c 3 仅通过旁路激活【l 】，而 且其补体系统的主要作用不是导致靶细胞溶解，而是促进吞噬细胞的吞噬作用。 随着鱼类的进化，出现了补体的经典激活途径，利用补体参与靶细胞溶解和调理 作用，但鱼类的补体对热敏感，受外界温度的影响比较大，因此，春季的补体系 统秋季的杀菌活性高【5 】。在不同种类的鱼中，补体基因的数量各不相同。鲤鱼有 5 个c 3 和3 个b 因子基因，乌颊海鲷有5 个c 3 基因，而斑马鱼中有3 个c 3 和2 个b 因 子基因【“，4 5 ，矧。c 3 蛋白对不同微生物的细胞壁有不同的亲和力。在鲤鱼中，c 3 催化部位含有一个组氨酸残基，h i s 残基是c 3 和生物表面共价结合不可或缺的成 分，然而5 种c 3 中有3 种c 3 蛋白的组氨酸残基被丝氨酸或谷氨酰胺代替。丝氨酸 替代形式的c 3 溶血活性增加了3 倍。c 3 依赖的吞噬作用己在多种鱼中发现【4 7 1 ，然 而吞噬细胞表面的c 3 受体在分子水平未有研究。 3 1 2 干扰素 干扰素是脊椎动物体内的能诱导细胞产生抗病毒蛋白的一种可溶性蛋白，主 要由巨噬细胞分泌，生成速度受温度影响 4 8 1 ，是鱼类以及所有脊椎动物抵御病 毒的核心系统【4 9 1 。当生物体受到侵袭后，干扰素可作用于相应的细胞，使其分 泌出一系列具有抗病毒特性的蛋白质，因此在病毒防御中起着重要作用。1 9 6 5 山东师范大学博士学位论文 年首次发现鱼类干扰素来【5 0 】，其研究进展缓慢，直到2 0 0 3 年，从斑马鱼中克隆 到t ) ，p e ii f n ，鱼类的干扰素研究才得到了迅速发展【5 l 】。目前已在多种鱼种克隆 到了干扰素基斟5 2 ，5 3 ，5 4 1 ，通过系统进化分析，表明该基因在进化上是保守的。干 扰素诱导的基因包括侬f 7 、施j 、尬2 、唧仃拥、册j 5 2 和上昭5 5 5 ，5 6 1 等。目前 鱼类干扰素研究多集中在基因的克隆和分析，对其复杂的调控机制并没有深入研 究，而且对干扰素的功能也多局限在抗病毒方面，对抗菌感染的研究尚未见报道。 3 1 3 凝集素 细菌一旦与鱼体接触，就会通过粘附素粘附在粘膜和表皮细胞上，它们之间 的相互作用需要结合糖分子【5 7 1 。凝集素是一类与碳水化合物和糖蛋白结合，从 而使异源细胞或微生物发生凝集的一类蛋白质【5 8 】。在理化、生物学和抗原特性 方面均不同于免疫球蛋白。v o s s ( 1 9 7 9 ) 发现大马哈鱼卵中含有母源性凝集素， 对其进行纯化和活性研究后，发现具有抑制鱼类病原菌生长的活性。凝集素可以 有效的识别和凝集异己成份，有利于异物的清除，被认为是机体自然防御机制中 原始的识别分子和免疫监督分子。 3 1 4 溶菌酶和c 反应蛋白 溶菌酶是1 9 9 1 年首次从踟c d 咖朋幽螂觚“f c 乃卵中分离纯化到的【5 9 】，存在与鱼 类的粘液、血清、吞噬细胞和单核细胞的胞浆内。通过裂解病原体细胞壁的粘多 糖将其杀死，溶菌酶的水平和活性直接关系到鱼类的免疫能力和健康。溶菌酶的 活性受季节影响，夏季的活性比冬季增加2 3 倍。 c 反应蛋白存在于血清中，能使多种真菌、寄生虫及细菌含有的糖基以及磷 脂分子产生沉淀，从而有助于降低病原体的毒力，使吞噬细胞对之易于攻击，同 时还能促进吞噬、激活补体、抑制血小板的功能【l 】。 3 2 鱼类的适应性免疫应答 当微生物突破作为第一道防线的固有免疫进入机体后，适应性免疫应答就开 始启动，作为有机体的第二道防线发挥作用。适应性免疫主要由t 、b 淋巴细胞 介导。目前已经证实鱼类的淋巴细胞也包括t 细胞和b 细胞两个亚群，分为细胞 免疫和体液免疫，其中t 淋巴细胞介导细胞免疫，b 淋巴细胞介导体液免疫。在 6 山东师范大学博士学位论文 硬骨鱼类中对淋巴细胞的分类是这样定义的：b 淋巴细胞能表达膜表面免疫球蛋 白，而不能产生免疫球蛋白的淋巴细胞即为t 淋巴细胞。研究结果表明，硬骨鱼 胸腺与t 淋巴细胞有关，头肾与b 淋巴细胞有关，脾脏中有t 和b 两种类型的淋巴 细胞【。 3 2 1 细胞免疫 由t 淋巴细胞介导的免疫称为细胞免疫，t 淋巴细胞具有直接杀伤细胞以及 通过分泌细胞因子调节免疫反应的作用。利用单克隆技术可以区分细胞表面抗体 阳性或阴性的淋巴细胞，及其生物活性，但是目前还没有能区分t 淋巴细胞的单 克隆抗体。m i l e r 等研究出的单抗虽然可与一种鲫鱼的t 细胞发生反应，但它同时 又与中性粒细胞和凝血细胞发生交叉反应。鱼类中的t 淋巴细胞与哺乳动物的t 淋巴细胞有所不同，哺乳动物的t 淋巴细胞是通过特异表面标记特征来确认的， 而鱼类中至今未见报道，所以对t 细胞一直都以其功能来加以确认。但目前已确 认鱼类至少有功能性的t 细胞存在。 3 2 2 体液免疫 高等动物在接触抗原之后，首先由巨噬细胞对抗原进行处理，将抗原信息呈 递出来，传递给t 淋巴细胞和b 淋巴细胞，使b 细胞活化，增殖分化为浆细胞，然 后产生抗体。鱼类中，也观察到了类似的高等动物体液免疫的两个阶段。抗体是 机体在对抗原刺激的免疫应答中，由淋巴细胞产生的一类能与相应抗原特异性结 合的具有免疫功能的球蛋白删。鱼类的免疫球蛋白主要有血清免疫球蛋白和粘 液免疫球蛋白。 3 2 2 1 血清免疫球蛋白 鱼类血清中主要的免疫球蛋白类似于哺乳动物的i g m ，在血液中的相对水平 较哺乳动物的高。目前普遍认为鱼类中只存在一种免疫球蛋白i g m 。它由2 条轻 链( l 链) 和2 条重链( h 链) 所组成的单体通过连接链叩将4 个单体连接成一个 四聚体。在沟鲇、大鲮鲆、鲤和羊头鲷血清中皆发现血清i g 是四聚体，分子量 7 0 0 8 0 0k d ( 1 k d = lo o od a l t o n ) ，h 链的分子量约为7 0k d ，也存在7 8k d ( 大菱鲆) 和4 5k d ( 羊头鲷) 2 种异型；l 链的分子量约为1 9k d ，但也存在2 5k d ( 鲤) 、2 7 山东师范大学博士学位论文 k d ( 大鲮鲆) 和2 2k d 、2 4k d 、2 6k d5 种异型( 羊头鲷) 。但也有人认为真骨鱼类 血清中存在着2 种以上的i g ，t r u r n p 等人发现鲫血清中存在着抗原性和电泳图谱 各不相同的2 种i g 。 w i l s o n 等在1 9 9 7 年报道了在斑点叉尾鲴中报道了一种类似哺乳动物i g d 重链 的嵌合基因【6 2 1 ，随后在多种鱼类中也发现了这类重链基因【6 3 “6 5 ，鲫。而d a i l i l a v a 等在斑马鱼中发现了一种新型的免疫球蛋白重链基因，命名为i 醇( 链) 【6 7 】，由 此推测，鱼类中可能存在多种形式的免疫球蛋白种类。 鱼类的抗体形成期较长，抗体滴度增加缓慢，但初次免疫后的免疫期较长，鱼类 的免疫记忆只是一种简单的抗原灶扩散，二次免疫后抗体滴度增高较少，而且免 疫记忆还受到温度的影响。 3 2 2 2 鱼类粘液性i g 鱼类的i g m 不仅存在于血清中，还存在于皮肤、肠粘液和胆汁中。硬骨鱼 的皮肤表面和消化道表面都覆盖着一层丰富的粘液层。粘液中含有特异性i g ，因 其分布在器官表面，直接与外界接触，因此对鱼类就具有更为重要的意义。 4c d n a 文库的构建及应用研究进展 4 1c d n a 文库的概念 以某个特定组织或细胞中m r n a 为模板，在反转录酶的作用下，合成c d n a ， 再经大肠杆菌聚合酶作用合成双链的c d n a ，经酶切和连接接头后，连入载体， 最后转化的宿主细胞或包装成噬菌体粒子，这样形成的n 1 【a 克隆群，即为 c d n a 文库【6 8 】。一个c d n a 文库中包括组织或细胞中全部的r a 信息，而这 种信息是有时效性的，这一克隆群反映了组织或细胞在某一特定时期基因的表达 情况，某种意义上讲，它可以表现基因组的功能信息【6 9 1 。c d n a 便于克隆和大量 扩增，不像基因组d n a 含有内含子而难于表达，可以从c d n a 文库中筛选到所 需的目的基因，并直接用于该基因的表达研究，所以在工程研究中，真核细胞的 c d n a 文库比基因组文库应用更为广泛。构建c d n a 文库已经成为研究基因功能 组学的基本手段之一。 4 2c d n a 文库的分类 首个c d n a 文库由h o f s t e t t e r 在1 9 7 6 年构建。c d n a 文库的构建也在逐步完 8 山东师范大学博士学位论文 善。根据文库的表达类型可以分为：表达型和非表达型文库。表达型文库是选择 表达载体进行连接，插入的c d n a 片段可以产生融合蛋白，具有抗原性和生物 活性。表达型文库适于用于氨基酸序列尚不清楚，不能采用核酸探针筛选的目的 基因，可以利用能与表达的产物发生特异反应的抗体或者化合物进行筛选。非表 达型c d n a 文库适于那些可以用核酸探针来进行筛选的基因。核酸探针可以是 从蛋白质序列中推导的人工合成的寡核苷酸序列，也可以是同种或异种的已知序 列的保守部分。 根据连接载体的不同，c d n a 文库又可以分为质粒c d n a 文库和噬菌体 c d n a 文库。前者以细菌质粒为连接载体，包含的c d n a 克隆数目较少，插入片 段相对较小，适合于表达丰度较高的r i 畎n a ；后者以噬菌体d n a 为