（物理化学专业论文）流动注射化学发光在药物分析中的应用研究.pdf

摘要 流动注射一化学发光在药物分析中的 应用研究 物理化学硕士研究生廖伟 指导教师李念兵教授 摘要 化学发光分析( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 是根据化学反应产生的光辐射( 化学发光) 确定物质 含量的一种痕量分析方法，由于不需要任何光源，避免了杂散光的干扰，因此具有极高的灵 敏度。正因为化学发光分析法具有高灵敏度、仪器简单等优点，将其与流动注射( f d 的快速分 析和高精度相结合使之成为一种有效的痕量分析技术，因而流动注射化学发光分析逐渐成为 在药物分析方面非常活跃的研究领域。 本文主要对流动注射化学发光在药物分析中的应用进行了研究，包括以下五个部分： 第一章：综述 介绍了化学发光的基本原理、常用的发光体系、在药物分析中的应用现状及化学发光的 最新进展，最后阐述了本文的研究目的和意义。 第二章：高锰酸钾罗丹明6 g 流动注射化学发光体系测定咖啡酸 基于在酸性条件下，咖啡酸能极大地增强高锰酸钾一罗丹明6 g 体系的化学发光强度，且 增加的发光强度与咖啡酸的浓度在一定范围内呈良好的线性关系，由此建立了测定咖啡酸的 流动注射化学发光新方法。在最佳条件下，咖啡酸浓度在1 0 1 0 由1 0 1 0 4m o l l 范围内 与化学发光相对强度呈线性关系，线性回归方程为m _ - 6 1 6 + 3 7 7 1 0 6c ，检出限为2 4 1 0 m o l l ，对4 0 1 0 击m o l l 的咖啡酸测定1 1 次的相对标准偏差r s d 为3 o ，方法已用于咖啡 酸片中咖啡酸含量的测定。 第三章：硫酸铈罗丹明b 流动注射一化学发光体系测定原儿茶醛 研究发现，在酸性介质中，c e ( i v ) 可以氧化原儿茶醛产生较弱的化学发光，罗丹明b 可 以大大增强此发光，且增加的发光强度与原儿茶醛的浓度在2 0 1 0 4 0 1 0 4m o l l 范围内 呈良好的线性关系，线性回归方程为a i = 1 7 2 + 1 4 9 1 0 6 c ，检出限为3 7 7 1 0 一m o l l ，由 此建立了测定原儿茶醛的流动注射化学发光新方法，对4 0 1 0 。8m o l l 的原儿茶醛连续平行 测定n 次，其相对标准偏差为1 8 7 。该法已用于丹参注射液中原儿茶醛含量的测定，结果 两南大学硕十学位论文 令人满意。 第四章：高锰酸钾罗丹明6 g 流动注射一化学发光体系测定槲皮素 基于在酸性介质中槲皮素对高锰酸钾罗丹明6 g 体系的增强作用建立了槲皮素含量的简 单、灵敏和快速的流动注射化学发光分析方法，并探讨了其反应机理。在优化的实验条件下， 槲皮素浓度在5 0 1 0 一7 0 1 0 巧m o l l 范围内与化学发光相对强度呈线性关系，线性回归方 程为a i = - 2 2 2 + 8 5 1 1 0 6 c ，检出限为3 7 7 1 0 9m o l l 。对1 0 1 0 5m o l l 的槲皮素测定1 1 次的相对标准偏差r s d 为1 0 7 ，该方法已成功用于复方鱼腥草片中的槲皮素含量的测定。 第五章：鲁米诺一铁氰化钾流动注射一化学发光法体系测定咖啡酸 基于碱性介质中咖啡酸对鲁米诺铁氰化钾化学发光体系的抑制作用，建立了咖啡酸含量 的抑制化学发光分析方法。研究了相关冈素对体系化学发光强度的影响，在最佳实验条件下， 咖啡酸浓度在3 0 1 0 一1 0 1 0 一m o l l 范围内与相对化学发光强度呈线性关系，线性同归方 程为a i = 1 9 7 4 4 5 + 2 31 1 0 1 0 c ，检出限为2 5 1 0 1 2m o l l 。对4 1 0 培m o l l 的咖啡酸测定1 1 次的相对标准偏差r s d 为1 9 3 。该方法简便、迅速、重复性好、灵敏度高，用于咖啡酸片 中咖啡酸含量的测定获得满意结果。此外，探讨了该抑制化学发光体系的作用机理。 关键词：化学发光流动注射咖啡酸原儿茶醛槲皮素 i i a b s t r a c t i i a n a l y t i c a la p p l i c a t i o n so ff l o w i n je c t i o n c h e m i l u m i n e s c e n c ei np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s m a s t e ro fp h y s i c a lc h e m i s t r y - w e il i a o s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rn i a n b i n gl i a b s t r a c t c h e m i l u m i n e s c e n c ea n a l y s i si sat r a c ea n a l y s i sm e t h o dw h i c hd e t e r m i n e st h ec o n t e n to f s u b s t a n c ea c c o r d i n gt ot h el i g h te m i s s i o no ft h ec h e m i c a lr e a c t i o n t h e r ea l em a n ym e r i t so nc l s u c ha ss i m p l ea n dc h e a po p t i c a ls y s t e m , r e q u i r i n gn ol i g h ts o b r c ew h i c ha v o i d st h ee f f e c t so fs t r a y l i g h ta n dt h ei n s t a b i l i t yo fl i g h ts o u r c e ，a n dt h u sp r o v i d i n gl o wb a c k g r o u n dw i t he x c e l l e n ts e n s i t i v i t y , w i d el i n e a rr a n g e ，r a p i d i t y , s i m p l i c i t ya n ds o0 1 1 f l o w - i n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e ( f i c l ) ，w h i c h c o m b i n e sc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) a n df l o w i n j e c t i o n ，h a sh i g he f f i c i e n c ya n da c c u r a c y i tb e c o m e s m o r ea n dm o r ei m p o r t a n ti np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s t h i sp a p e rr e p o r t st h er e s e a r c h e so ff i a c lm e t h o di np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s ，a n dt h em a i n c o n t e n t sa r es h o w na sf o l l o w s ： c h a p t e r1 ：s u m m a r i z a t i o n t h em e c h a n i s ma n dp r i n c i p l e so fc la n a l y s i sa sw e l la si t sh i s t o r ya n ds e v e r a lc o m m o nc l a n a l y t i c a ls y s t e m sa r em e n t i o n e d s o m eo t h e rt e c h n i q u e st h a ta r ec o m b i n e dw i t hc la n a l y s i sh a v e b e e ns u m m a r i z e d t h er e s e a r c h e sa n da p p l i c a t i o n so fc li np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i si nr e c e n ty e a r s h a v eb e e ni n t r o d u c e d t h ep u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c eo ft h i ss t u d yh a sb e e np o i n t e do u t c h a p t e r2 ：d e t e r m i n a t i o no fc a f f e i ca c i db yk m n 0 4 一r h 6 g c a f f e i ca c i df i a - c la n a l y s i ss y s t e m an o v e lf l o w i n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc a f f e i ca c i dh a s b e e np r o p o s e db a s e do nt h es t r o n g l ye n h a n c i n ge f f e c to fc a f f e i ca c i do nt h ec h e m i l u m i n e s c e n c e r e a c t i o nb e t w e e nk m n 0 4a n dr h o d a m i n e6 gi nt h ea c i dm e d i u m t h eo p t i m i z a t i o no ft h e p a r a m e t e r sw h i c ha f f e c t e dt h ec h e m i l u m i n e s c e n c es i g n a l sh a sb e e ns t u d i e d u n d e rt h eo p t i m u m c o n d f f i o n s ，t h em e t h o da l l o w e dt h ed e t e r m i n a t i o no fc a f f e i ca c i di nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 0 1 0 一1 0x1 0 m o l l t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o ni sa = 6 1 6 + 3 7 7 1 0 6ca n dt h ed e t e c t i o n l i m i t ( 3 0 ) w a s2 4 1 0 - 8m o l l 。t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s3 0 f o r11r e p l i c a t ea n a l y s e s o f4 0 1 0 一m o l lc a f f e i ca c i d i th a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc a f f e i ca c i di nt h ec a f f e i c a c i dt a b l e t s i i i 两南大学硕+ 学位论文 c h a p t e r3 ：d e t e r m i n a t i o no fp r o t o c a t e c h u i ca l d e h y d eb yc e ( i v ) - r h b - p r o t o c a t e c h u i ca l d e h y d e f i a c la n a l y s i s i ns u l p h u r i ca c i dm e d i u m ，c e ( r v ) c a l lo x i d i z ep r o t o c a t e c h u i c a l d e h y d et op r o d u c ew e a k c h e m i l u m i n e s c e n c es i g n a l h o w e v e r , t h ee x i s t e n c eo fr h o d a m i n ebc a ng r e a t l ye n h a n c et h i s c h e m i l u m i n e s c e n c es i g n a la n dt h ee n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n ti n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no fp r o t o c a t e c h u i ca l d e h y d ei nt h er a n g eo f2 0 1 0 一4 0 10 4m o l l a n dt h el i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o ni sa i = 1 7 2 + 1 4 9 1 0 6c b a s e do nt h i sp h e n o m e n o n an e wf i a c lm e t h o d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t o c a t e c h u i ca l d e h y d eh a sb e e ne s t a b l i s h e d t h ed e t e c t i o nl i m i ti s3 7 7 1 0 8m o l la n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o ni s1 8 7 f o r4 0 1 0 8m o l lo fp r o t o c a t e c h u i c a l d e h y d e ( n = 1 1 ) t h ep r o p o s e dm e t h o d w a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t o c a t e c h u i ca l d e h y d ei ns a l v i am i l t i o r r h i z ai n j e c t i o n c h a p t e r4 ：d e t e r m i n a t i o no fq u e r c e t i nb yk m n 0 4 一r h 6 g - q u e r c e t i nf i a c la n a l y s i ss y s t e m as i m p l e ，s e n s i t i v ea n dr a p i df l o w - i n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o dh a db e e nd e v e l o p e d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fq u e r c e t i nb a s e do nt h es t r o n g l ye n h a n c i n ge f f e c to fq u e r c e t i no nt h e c h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o nb e t w e e nk m n 0 4a n dr h o d a m i n e6 gi na na c i dm e d i u m t h e o p t i m i z a t i o no ft h ep a r a m e t e r sw h i c ha f f e c t e dt h ec h e m i l u m i n e s c e n c es i g n a l sh a sb e e ns t u d i e da n d t h er e a c t i o nm e c h a n i s mh a sb e e nd i s c u s s e d u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e r e l a t i v e c h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw a sp o s i t i v e l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fq u e r c e t i ni nt h e r a n g eo f 5 0 1 0 8 7 0 1 0 1m o l la n dt h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o ni sa i = 2 2 2 + 8 5 1 1 0 6 c w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i t ( 3 0 ) o f3 7 7 1 0 一m o l l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s1 0 7 f o r11 r e p l i c a t ea n a l y s e so f1 0 10 om o l lq u e r c e t i n t h i sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fq u e r c e t i ni nt h ef u f a n gy u x i n g c a ot a b l e t s c h a p t e r5 ：d e t e r m i n a t i o no fc a f f e i ca c i db yl u m i n o l - k 3 f e ( c n ) 6 - c a f f e i ca c i df i a c la n a l y s i ss y s t e m b a s e do nt h ep h e n o m e n o nt h a ti na na l k a l i n es o l u t i o n ，t h ec l i n t e n s i t yo ft h er e a c t i o nb e t w e e n p o t a s s i u mh e x a c y a n o f e r r a t e ( 1 1 1 ) a n dl u m i n o lc o u l db es t r o n g l yi n h i b i t e db yc a f f e i ca c i d ，an e w f i a c la n a l y t i c a lm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc a f f e i ca c i dw a sp r o p o s e d t h ei n f l u e n c eo fs o m e f a c t o r so nt h ec h e m i l u m i n e s c e n c es i g n a l sh a sb e e ns t u d i e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e r e l a t i v ec h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h es y s t e mw a sl i n e a rw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fc a f f e i ca c i d i nt h er a n g ef r o m3 0 1 0 - 8t o1 0 1 0 7 m o l la n dt h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o ni sa i = 1 9 7 4 4 5 + 2 31 1 0 1 0 c ；t h ed e t e c t i o nl i m i t ( 3 0 ) f o rc a f f e i ca c i dw a s2 5 1 0 2m o l l t h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o nw a s1 9 3 f o r11 r e p l i c a t ea n a l y s e so f4 0 10 一m o l lc a f f e i ca c i d t h ep r o p o s e d m e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc a f f e i ca c i di nc a f f e i ca c i dt a b l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 。 a b s t r a c t m o r e o v e r , t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo ft h ec h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mh a sb e e np r i m a r i l yd i s c u s s e d k e y w o r d s ：c h e m i l u m i n e s c e n c e ，f l o w - i n j e c t i o n ， c a f f e i c a c i d ，q u e r c e t i n ， p r o t o c a t e c h u i ca l d e h y d e v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对奉研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 t ：在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：虏锋 签字日期： 叼年奶咖 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解两南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向困家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许沦文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的个部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扣描等复制于段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：虏伟导师签名：玲阻 f 签字日期： 渺? 年歹月诊日 签字日期： 抛7 年r 月哆日 f 、 第一章综述 第一章综述 1 1 化学发光及其基本原理 1 1 1 概述 最早发现的化学发光现象发生在生物体内，如萤火虫，现在称之为生物发光 ( b i o l u m i n e s c e n c e ) ，是由生物体发出的可见光而得名。早在公元前3 8 4 3 2 2 年，亚里士多德就 在d ea n i m a ) ) 一书中描述了真菌类和死鱼的发光现象。1 9 世纪末期，人们发现简单的非生 物有机化合物也能产生化学发光现象。1 8 7 7 年，r a d z i s z e w s k i 发现洛粉碱( 2 ，4 ，5 三苯基咪唑) 在碱性介质中被过氧化氢等试剂氧化发出绿色的光【1 1 。此后，人们开始合成一系列化学发光化 合物。1 9 0 2 年，s c h m i t z 合成了鲁米诺( 1 u m i n o l ，3 氨基苯二甲酰肼) ；1 9 2 8 年，a l b r e c h t 发现了 鲁米诺在碱性介质中的化学发光现象f 2 1 ，这是化学发光史上一个重要的里程碑。1 9 3 5 年，g l e u 和p e t s c h 3 1 第一个报道了光泽精( n ，n 二甲基二吖啶硝酸盐) 与过氧化氢反应产生化学发光。 但是由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，并由于监测器灵敏度的限制，到了上世纪 六十年代，化学发光分析方面的研究才被用于分析化学并得以迅速发展。 1 1 2 化学发光的基本原理 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 是指在一些特殊的化学反应中发出可见光的现象。其发 光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的 能量而由基态跃迁至激发态，然后再从激发态返同基态，同时将能量以光辐射的形式释放出 来，产生化学发光【4 】。 化学发光，是当放能反应的电子振动激发态产物驰豫至基态并释放出光子时观察到的现 象，可以简单定义为化学反应所产生的光辐射现射5 1 。理论上，化学发光所产生的辐射可以在 紫外、可见光区或者是红外光区，但研究人员最为关心的是其可见光辐射。一个化学反应要 产生化学发光现象，必须满足以下三个条件：第一，反应中可提供足够的激发能，并由某一 步骤单独提供，因为前一反应释放的能量将冈振动驰豫消失在溶液中而不能发光；第二，有 利的反应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态；第三，激发态分 子具有一定的化学发光量子效率释放出光子，或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入 激发态并释放出光子。基于此，并不是任何化学反应都能产生化学发光反应。因此，如果测 量条件选择适当，化学发光分析会有足够的选择性。 化学发光分析测定的物质可以分为三类：第一类物质是化学发光反应中的反应物；第二 类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂；第三类物质是偶合反应中的反应物、 催化剂、增敏剂等。这三类物质还可以通过标记方式用来测定其他物质。 1 1 3 化学发光类型 两南大学硕十学位论文 1 1 3 1 直接化学发光和间接化学发光 化学发光反应从发光的能量转化机制可分为两类：直接化学发光和间接化学发光。 ( 1 ) 直接化学发光 当化学反应能量传递的结果是生成某种激发态产物时，这种激发态产物分子直接同到基 态，辐射光子，这种过程称为直接发光，可表示如下： a + b _ c + d 激活步骤 c 枣- c + h u 发光步骤 式中，a 或b 是被测物，c 牛为产物c 的激发态。 ( 2 ) 间接化学发光 若激发态分子本身不发光或者发光微弱，但可以将其能量转移给另一发光体，使之变为 激发态，在返同基态的过程中以光的形势释放能量，这种发光称为间接发光，也可称为活化 化学发光或能量转移化学发光。表示如下： a + b _ c 木+ d激活步骤 c 奉+ f f 宰+ c 能量转移过程 p - f + h u 发光步骤 式中，c 宰为能量给予体，f 为能量接受体，在化学发光分析中，许多荧光物质被用作能量 接受体，接受激发态产物的能量而发光，以提高化学发光分析的灵敏度。 1 1 3 2 气相化学发光和液相化学发光 化学发光反应按反应体系状态不同，可分为气相化学发光和液相化学发光两类，表1 1 中 列出了一些重要的化学发光反应体系6 】： 1 1 。3 。2 1 气相化学发光 气相化学发光反应主要有0 3 ，n o 和s 的化学发光反应，可以用于监测空气中的0 3 、n o 、 n 0 2 、s 0 2 和c o 等。 ( 1 ) 臭氧的化学发光反应 臭氧可与4 0 余种有机化合物产生化学发光反应，如臭氧与乙烯的化学发光反应，其反应 机理是臭氧氧化乙烯生成羧基化合物和同时产生化学发光，发光物质是激发态的甲醛。 ( 2 ) 氮氧化合物的化学发光反应 最重要的是一氧化氮与臭氧的化学发光反应，其化学发光效率较高，其机理是： n o + 0 3 _ n 0 2 奉+ 0 2 n 0 2 木n 0 2 + h u ( 3 ) 利用氧原子的化学发光反应 空气中的氧为氧分子，而不是氧原子，一般让臭氧在1 0 0 0 。c 的石英管中分解为0 2 和o ， 提供反应所需要的氧原子。如氧原子与s o ：的化学发光反应为： s 0 2 + o + o + s 0 2 + 0 2 2 第一章综述 s 0 2 木_ s 0 2 + l m 此反应的最大发射波长为2 0 0n l n ，测定灵敏度可达1r i g m es 0 2 。 1 1 3 2 2 液相化学发光 许多化学试剂和生物试样都可以通过在水溶液中进行化学发光反应来进行分析，因此液 相化学发光在痕量分析中十分重要。 ( 1 ) 生成过氧化物中间体的化学发光反应，此中间体的? o o 。键很弱，和四元环存在的张 力相近，因而分解时放出大量的热能满足化学发光反应的需要，例如鲁米诺类、洛酚碱、光 泽精等盐类化合物及其衍生物的化学发光。 ( 2 ) 生成单重态氧的化学发光，多轻基化合物例如没食子酸等，在碱性介质中被h ：o ：或 者0 2 氧化时发光。这是由于生成了单重态氧，放出能量，反应发出红色( 6 4 3n m ) 和蓝色( 4 7 5 5 0 5n m ) 的光。 ( 3 ) 电子转移化学发光，由于从游离阴离子上移走电子( 或者在阳离子上加入电子) 发生电 子供体和电子受体单电子氧化还原反应，释放出能量生成激发态产物而发光。 ( 4 ) 酶转化的化学发光，被测物在酶催化下直接进行化学发光或者通过酶的转化生成化学 发光反应物，然后再进行化学发光反应。前者例如萤火虫的发光是体内荧光素在光素酶的催 化下的氧化发光一生物发光。后者例如葡萄糖在特定酶的催化下发生氧化反应产生，再利用进 行化学发光反应测定，从而间接对葡萄糖进行定量分析。 表1 1 一些重要的化学发光反应体系 t a b 1 - 1af e wi m p o r t a n tc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o ns y s t e m s 状态待测物化学发光试剂 气相 0 3 乙烯 气相烃类化合物 0 3 气相n o 0 3 气相亚硝胺，总氮转换为氮氧化合物后与o ，反应 气相硫化合物氢焰 气相硫化合物 0 3 氧化后氢焰 液相荧光性有机化合物过氧化草酸酯 液相过氧化氢鲁米诺 液相过渡金属离子，过氧化物酶鲁米诺 液相可被氧化的有机化合物 k m n 0 4 、c e ( s 0 4 ) 2 等强氧化剂 液相仅一氨基酸，胺等 r u ( b p y ) 3 3 + 液相化学发光试剂标记物 吖啶酯、二氧杂环丁烷、鲁米诺衍生物、r u ( b p y ) 3 2 + 固相高聚物氧气及加热 3 两南大学硕+ 学何论文 1 2 化学发光分析法介绍 化学发光分析法( c h e m i l u m i n e s c e n c ea n a l y s i s ) 是一种分子发射光谱分析方法，它依据某一 时刻化学发光强度或化学发光总量确定反应中相应组分含量。与荧光和磷光发射光谱分析方 法相比较，化学发光分析法不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了 噪声，大大提高了信噪比，因而化学发光分析具有很高的灵敏度。其高灵敏度、线性范同宽、 设备简单、操作方便、易于实现自动化和分析快速的特点，使得化学发光易于实现在线分析 和批量分析。因此，化学发光分析己成为当前痕量分析领域的一个十分重要的研究方法【7 - 8 】， 主要表现在：首先，化学发光分析法本身不断的发展、完善，新发光试剂、新体系、新方法 不断出现，及其在药物、临床、生命科学、环境和材料科学等领域的应用；其次，化学发光 分析法与流动注射、电化学、微流控系统、高效液相色谱和毛细管电泳等方法相结合以及基 于化学发光反应的传感器的研究；最后，有关化学发光反应机理的研究进一步深入，从最初 的以化学反应方程式进行推测，发展到借助荧光光谱、吸收光谱、反应中间体的捕捉等实验 方法进一步证实，人们开始在实验的基础上，运用分子轨道理论、动力学模型和热力学基本 原理从理论上解释一些发光机理。 1 2 。1 化学发光分析的仪器及装置 根据体系不同的配置和采样模式，化学发光分析仪器主要分为分立取样式化学发光仪和 流动注射化学发光仪。 在七十年代早期，人们主要使用经过改装的荧光光度计来进行化学发光分析，但是这种 装置只能对某一个波长范围进行测量，因此灵敏度较差。随着光电倍增管的普及，后来出现 了无需单色器的简单分立取样式化学发光仪，并得到了广泛应用( 如图1 1 所示) 。该类仪器适 用于选择性的、具有较高量子产率、反应时间较长的生物发光反应和化学发光免疫分析以及 化学发光动力学的研究。但是这种发光仪采用间歇式进样，不能进行连续测定，且样品与试 剂混合重现性不好，使得测量的精密度受到很大的影响。 r e a c t i o n 图1 1 分立取样式化学发光仪的基本构造 f i g 1 1b a s i cs t r u c t u r eo fd i s c r e t es a m p i n gc h e m i l u m i n e s c e n c ea p p a r a t u s 七十年代中期，化学发光测定中引入了流动注射分析技术( f 1 0 wi n j e c t i o na n a l y s i s ， f t a ) ( 女n 1 - 2 所示) ，很好地弥补了前者的不足。流动注射分析技术是一种在非平衡状态下的 4 第一章综述 溶液自动处理及分析技术，和化学发光法相结合，能使样品与试剂以高度重现的方式混合。 同时，与传统的化学分析操作相比，既不需要均匀混合，也不需要达到化学平衡，这不仅大 幅度提高了分析速度，而且有效地提高了分析方法的选择性和灵敏度，为实现连续自动化分 析奠定了基础。国内开始出现流动注射化学发光分析方面的报道始于八十年代中期【9 】。随着化 学发光分析仪器的不断改进和发展，其自动化程度、精密度都不断提高；同时，价格便宜的 小型化仪器也相继出现，从而为化学发光分析在科研、冶金、地质、环保、临床等领域的推 广应用提供了保障。 s a m p l e c a r d e f r e a g e n t p u m p 图1 - 2 流动注射化学发光仪的基本构造 f i g 1 - 2b a s i cs t r u c t u r eo fc h e m i l u m i n e s c e n c ea p p a r a t u s 1 2 2 常见的化学发光体系 1 2 2 1 酰肼类化学发光体系 酰肼类化学发光体系主要包括：鲁米诺( 3 氨基邻苯二甲酰肼) 和异鲁米诺( 4 一氨基一邻苯二 甲酰肼) 等具有发光性能的有机化合物。其中，鲁米诺作为使用最早应用最广泛的化学发光试 剂之一【3 1 ，性质稳定，结构简单，易于合成，有较好的水溶性以及高的发光效率等特点，已得 到较深入的研究和广泛的应用。它在碱性溶液( p h = 1 0 1 1 ) 中可以被许多氧化剂( 或一些还原剂) 氧化( 或还原) ，从而处于激发态，激发态再回到基态，同时发射4 2 5n l t l 左右的蓝光。 鲁米诺及其衍生物由于性能稳定，价格低廉，无毒性等优点使其作为化学发光物质在液 相化学发光分析中得到广泛应用，已被广泛运用到有机物、金属离子、自由基抗氧化性等方 面的分析中，并取得良好效果 1 0 - t 3 1 。 在药物分析领域中，鲁米诺化学发光体系的应用研究更是活跃，许多药物的化学发光分 析都是采用鲁米诺发光体系。利用药物对鲁米诺化学发光反应体系的直接或间接的增强或抑 制作用从而达到测定药物的目的。 鲁米诺可以被许多氧化剂( 如h 2 0 2 、n a c l 0 、k 3 f c ( c n ) 6 、k 1 0 4 、k m n 0 4 、活性氧等) 氧化 而发光，但是反应速度比较慢或发光强度较弱，需要催化剂催化或增敏剂增敏而使发光强度 增强，且增强程度与所加催化荆或增敏剂在一定浓度范围内成线性关系。一些药物可以直接 作为催化剂或增敏剂或通过化学反应产生这些催化剂或增敏剂，使发光强度增强，从而实现 对一些药物的直接或间接测定【1 牝9 1 。 5 两南大学硕十学位论文 1 2 2 2 酸性高锰酸钾化学发光体系 近年来，高锰酸钾与药物的化学发光分析法取得了较大进展，己基本形成了一个重要的 化学发光新体系。由于高锰酸钾成本低、适应性强，应用范围将会得到进一步扩大。 在酸性介质中，由于高锰酸钾的强氧化性，大部分有机化合物及无机物可以与其发生氧 化还原反应，其能量的转移过程往往伴随着化学发光现象，而且高锰酸钾化学发光体系所需 试剂比较不同，发光强度稳定，所以受到人们的重视，在环境分析、药物检验等许多方面得 到广一泛应用 3 0 - 3 8 】。 由于高锰酸钾化学发光反应体系的灵敏度一般较低，常常需要在体系中加入增敏剂，常 用的有： ( 1 ) 还原性物质，如：甲醛、乙二醛、戊二醛、m n ( i i ) 、h 2 0 2 、甲酸： ( 2 ) 荧光类物质，如罗丹明b 、核黄素、喹啉及一些表面活性剂等。 如儿茶酚胺类药物在硫酸介质中被高锰酸钾氧化，以甲醛做增敏剂，可使发光强度提高 l o 倍【3 9 】，高锰酸钾氧化还原药物如核黄烈删、维生素b 6 t 4 1 1 等产生化学发光信号较弱，连二 亚硫酸钠的存在可使发光强度大大提高，其检出限可以大大降低。 由于很多的有机物能够被高锰酸钾氧化。所以高锰酸钾化学发光反应在化学发光检测将 发挥越来越广泛的应用。 1 2 2 3c e ( i v ) 化学发光体系 和高锰酸钾一样，四价铈在酸性介质中也具有很强的氧化性，可以与很多还原性无机物 或有机物发生氧化还原反应，使其成为化学发光试剂之一，目前己应用于很多药物的化学发 光分析等4 2 4 8 1 。 c e ( i v ) 的氧化能力受介质酸度等影响较人，我们可以通过调节酸度以达到最佳实验效果， 同时还可以通过加入增敏剂来提高方法的灵敏度，从而达到测定这些药物的目的，最常用的 增敏剂有罗丹明6 g 、罗丹明b ，利用这种方法实现了对安乃近【4 9 】、盐酸氯丙嗪5 0 1 、半胱氨酸 【5 1 】、阿莫西林【5 2 1 等药物的测定；在酸性条件下，利用十二烷基硫酸钠( s d s ) 对c e ( 1 v ) 一诺氟沙 星有较强的增敏作用测定诺氟沙星【5 3 】；利用c e ( r v 3 一奎宁一硫普罗宁体系测定了硫普罗宁5 4 】； c e ( w ) 也可以与硫酸反应产生微弱的化学发光，一些药物对此发光体系有一定的增敏( 抑制) 作用，基于此可利用此体系对药物进行直接测定氯丙咪啼酬、尼莫地平5 6 1 ；其中一些镧系元 素对此体系有增敏作用，如：t b ”，e u 3 + 等，利用此体系测定芦氟沙星f 5 7 】、环丙沙星嗍等；基 于某些药物对c e ( r v ) 一r u ( p h e n ) 3 2 + 化学发光体系的发光增强作用，可测定e l i ：, 妥酸5 9 1 等。 1 2 2 4 过氧化草酸酯化学发光体系 1 9 6 3 年，c h a n d r o s s 在实验中首次发现并报道了过氧化草酸酯的化学发光现象。 草酸酯类化学发光体系的组分主要包括二芳基草酸酯和氧化剂，通常的氧化剂为过氧化 氢，过氧化草酸酯化学发光反应是在合适和荧光物质( 增敏剂) 的存在下，过氧化氢诱导氧化芳 香基草酸酯而发光的过程，发光的强弱与增敏剂特性有关而与化学发光试剂种类和性质无关， 6 第一章综述 发生反应时，荧光物质的分子结构通常保持不变，只是起转移能量和发射荧光的作用。 过氧化草酸酯体系主要用于直接测定过氧化氢，通过过氧化氢间接测定其他样品，或用 于荧光物质的分析【6 1 4 5 1 。但由于反应物的水溶性较差，且不稳定，限制了其在化学分析中的 应用。 1 2 2 5 吖啶类化学发光体系 1 9 3 5 年，g l u e 与p e t s c h 首次发现了光泽精的化学发光特性【3 1 。 光泽精( n n 二甲基二吖啶硝酸盐) ，是一种荧光物质，其化学式为c 2 。h 2 2 n 4 0 6 ，与鲁米诺 一样，在碱性条件下可被氧化而发出4 7 0 n m 的光，加入过氧化氢等氧化剂后发光强度大大增 强，具有较高的发光效率。后来又发现很多吖啶类化合物具有这样的特性，研究最多的是吖 啶酯类化合物。这类化合物只要在过氧化氢和碱存在下就能迅速产生化学发光，且具有很高 的发光效率，据此用光泽精对一些环境物质进行了测定 6 6 - 6 8 】。 与鲁米诺相比，光泽精发光更具有独特的优点：光泽精的发光体n 甲基吖啶酮比鲁米诺 的发光体3 氨基邻苯二甲酸发光更强，发光效率更高；