（动物学专业论文）acsdkp对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞生长的影响.pdf

摘要 n 一乙酰基一丝氨酰一天冬氨酰一赖氨酰一脯氨酸( a c s d k p ) 是一种具 有生理调控活性的肽类因子，最初是从胎牛骨髓中发现的。早先的一 系列实验显示，这种四肽因子可通过阻止造血干祖细胞进入s 期， 使其停留在g o 期，而发挥细胞增殖抑制作用。后来的研究表明，a c s d k p 对非造血细胞如淋巴细胞，肾间质成纤维细胞和心肌成纤维细胞等也 有生长抑制作用。本实验室近来的工作发现，a c s d k p 能抑制体外培 养条件下小鼠骨髓间充质干细胞( m s c ) 的增殖，本研究旨在通过分 离、纯化和培养人骨髓m s c ，进一步探究该因子对骨髓m s c 的生长调 控活性和作用机制。 本研究通过分离人骨髓单个核细胞，并在传代培养出纯化m s c 及 鉴定其增殖和分化能力的基础上，采用集落形成实验、甲基偶氮唑盐 ( m t t ) 比色法、细胞分裂指数测定、5 一溴脱氧尿苷( b r d u ) 掺入 和流式细胞术等方法，观察了a c s d k p 对体外培养的人骨髓m s c 增殖速 率的影响，检测了在a c s d k p 作用下m s c 的d n a 合成和细胞周期活动，还 观察了a c s d k p 对这些干细胞作用的可逆性和血清浓度对其作用的影 响，以及该因子对这种骨髓干细胞贴壁能力的影响。结果如下：( 1 ) 在 a c s d k p 浓度为1 0 _ 2 m o l l 1 0 m o l l 的培养体系中，人骨髓m s c 的集落 生成率和大小、活力细胞数和分裂指数均减低，最大效应浓度为 1 0 1 1 m o l l 。( 2 ) 在a c s d k p 浓度为1 0 。1 2 m 0 1 l 1 0 1 0 m o l l 的m s c 培养体系 中，b r d u 标记阳性细胞数显著减少；s + g 。m 期细胞的比率降低，g 0 g 。 期细胞明显增加。( 3 ) 在所加a c s d k p 的终浓度为1 0 1 1 m o l l 的体系中， 将已贴附于培养板的人骨髓单个核细胞培养3 天后，撤除a c s d k p ，m s c 的生长速率恢复，其集落生成数明显多于不撤除a c s d k p 的培养体系。 ( 4 ) 如果将培养体系的血清浓度增至4 0 ，m s c 集落生成的抑制率明显 小于较低血清浓度组。( 5 )将m s c 种入a c s d k p 浓度为 1 0 。1 2 m o l 几1 0 m o l l 的培养体系2 4 h 后，贴壁细胞数与对照组比较明 显减少。 以上实验结果表明，在体外培养条件下，a c s d k p 对人骨髓m s c 的 增殖具有抑制作用，其效应是剂量依赖性的和可逆性的。a c s d k p 可阻 止人骨髓m s c 进入s 期，减慢细胞周期进程。它的这种抑制效应与其可 对抗生长刺激因子和影响骨髓m s c 的贴壁能力有关。本研究为阐明骨 髓m s c 生长调控机制增添了新认识，并将为a c s d k p 在干细胞相关应用 研究中的利用提供有价值的实验证据。 关键词：a c s d k p ；增殖；抑制作用；间充质干细胞；骨髓 i i a b s t r a c t n a c e t y l s e r y l a s p a r t y l l y s y l p r o l i n e( a c s d k p ) i sa p h y s i o l o g i c a lr e g u l a t o r yp e p t i d ef a c t o r i tw a so r i g i n a l l y f o u n di nf e t a lc a l f b o n em a r r o w ab o d yo fe a r l ys t u d i e s d e n l o n s t r a t e dt h a tt h i sa c e t y l a t e dt e t r a p e p t i d ec a ni n h i b i tt h e p r o l i f e r a t i o n o fh e m a t o p o i e t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l sb y p r e v e n ti n gt h ee n t r yo ft h e mi n t ot h esp h a s ea n da r r e s ti n gt h e m i nt h eg op h a s e l a t e rs t u d i e si n d i c a t e dt h a ta c s d k pa l s oh a s i n h i b i t o r ye f f e c t so nt h eg r o w t ho fn o n h e m a t o p o i e t i cc e l l s s u c ha s l y m p h o c y t e s ， r e n a li n t e r s t i t i a lf i b r o b l a s t sa n d c a r d i a cf i b r o b l a s t s r e c e n t e x p e r i m e n t s o fo u rl a b o r a t o r y s h o w e df o r t h ef i r s tt i m et h a ta c s d k pi n h i b i t e dt h ei nv i t r o p r o li f e r a t i o no fm u r i n eb o n em a r r o wm e s e n c h y m a l s t e mc e ll s ( m s c s ) t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a st oi n v e s t i g a t e t h e r e g u l a t o r ye f f e c t so fa c s d k po nt h ep r o li f e r a ti o no fh u m a nb o n e m a r r o wm s c si nv i t r oa n di t sm e c h a n i s mo fa c t i o n i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w eh a v ef i r s t l yi s o l a t e da n dp u r i f i e d m s c s f r o mh u m a nb o n em a r r o wm o n o n u c l e a rc e l l s ， a n de x a m i n e d t h e i rs u r f a c em a r k e r sa n d t h ea b i l i t yo fd i f f e r e n t i a t i o n s u b s e q u e n t l y ，b yu s i n gc o l o n yf o r m a t i o nt e s t ，m t tc o l o r i m e t r i c a s s a y ， m i t o t i ci n d e xd e t e r m i n a t i o n ， 5 b r o m o d e o x y u r i d i n e i ( b r d u )i n c o r p o r a ti o na n df l o wc y t o m e t r y ，w eh a v ee x a m i n e dt h e p r 0 1 i f e r a t i v ea c t i v i t y ，d n as y n t h e s i sa n dc e l l c y c l es t a t u so f h u m a nb o n em a r r o wm s c si n c u l t u r e sw i t hdi f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fa c s d k p ，a n de v a l u a t e dt h er e v e r s i b i l i t ya n d s e r u mc o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c eo f i t se f f e c t s w ea l s o h a v e o b s e r v e dt h ei n f l u e n c eo fa c s d k po nt h ea d h e s i v ea b ili t yo f t h e s em s c s t h ef o l l o w i n gr e s l i l t sw e r eo b t a i n e d ( 1 ) t h en u m b e r a n ds i z eo f c o l o n i e s ， t h en u m b e ro fv i a b l ec e l 1 s ， a n d t h e m i t o t i ci n d e xw e r es i g n i f i c a n t l yr e d u c e di nh u m a nb o n em a r r o w m s cc u l t u r e sw i t h1 0 1 2 m o l lt o1 0 m o l la c s d k p t h em a x i m a l i n h i b i t i o nw a so b s e r v e da t1 0 1 1 m o l l ( 2 )t h en u m b e ro fb r d u p o s i t i v ec e l l sw a so b v i o u s l yr e d u c e d i nm s cc u l t u r e sa t 1 0 一1 2 m 0 1 l t o 1 0 1 0 m o l la c s d k p f l o w c y t o m e t r i ca n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tc e l l si ng o g 1p h a s e sw e r em a r k e d l yi n c r e a s e d ， w h il ec e ll s i ns + g 2 mp h a s e sw e r eo b v i o u s l yd e c r e a s e di nt h e s a m ec u l t u r e s ( 3 )i fa c s d k pi sw i t h d r a w nf o ll o w i n ga3 一d a y e x p o s u r eo f1 0 1 1m o l la c s d k pt oh u m a nb o n em a r r o wm o n o n u cl e a r c e llc u l t u r e s ，t h eg r o w t ho fm s c sc a nr e s t o r e ，a n d t h em s c c o l o n i e sw e r eo b v i o u s l ym o r et h a nt h o s ei nc u l t u r e sf r o mw h i c h a c s d k pw a sn o tw i t h d r a w n ( 4 )t h ei n h i b i t i o no fm s cc o l o n y f o r m a t i o nb ya c s d k ph a das i g n i f i c a n td e c r e a s ew h e nt h eb o n e m a r r o wm o n o n u c l e a rc e ll sw e r ec u l t u r e di nd m e mc o n t a i n i n g4 0 i v ：f e t a lb o v i n es e rl i m ( 5 ) t h en u m b e ro ft h ec e l l sa d h e r e dt ot h e c u l t u r ep l a t ew a sr e d u c e da f t e ra2 4 一h o u ri n c l i b a t i o n o fm s c s e x p o s e dt o1 0 1 2 m o l l t o1 0 9 m o l la c s d k p t o g e t h e r ， t h e s ed a t ai n d i c a t et h a ta c s d k po v e rar a n g eo f c o n c e n t r a t i o n sh a s i n h i b i t o r ye f f e c t s o nt h ei nv i t r o p r o l i f e r a t i o no fh u m a nb o n em a r r o w 加e s e n c h y 加a ls t e mc e l l s t h i s i n h i b i t o r ye f f e c tisd o s e d e p e n d e n ta n dr e v e r s i b l e i tis d e 珊o n s t r a t e dt h a ta c s d k p e x e r t si t si n f l u e n c eo nt h e p r o l i f e r a t i o no fm s c sb yb l o c k i n go rr e t a r d i n gt h es w i t c ho f q u i e s c e n tm s c si n t oc e llc y cl e a c s d k p m a yi n t e r f e r ew i t h c e r t a i ns t i m u l a t o r so f c e l l p r o l i f e r a t i o n m o r e o v e r ， t h i s t e t r a p e p t i d ea l s oh a sap o s s i b l ei n f l u e n c eo nt h ea d h e s i v e a b ili t yo fm s c s t h e r e f o r e ， o u rw o r kh a sy i e l d e dan e wi n s i g h t i n t ot h em e c h a n i s m so fm s cg r o w t hr e g u l a t i o n ，a n dw i ll p r o v i d e v a l u a b l ei n f o r m a t i o nf o r t h eu s eo fa c s d k pi nt h es t e mc e l l r e s e a r c h k e y w o r d s ： a c s d k p ： p r o l i f e r a t i o n ：i n h i b i t o r ye f f e c t ： m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ： b o n em a r r o w v a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞生长的影响 - - - 1 月i j吾 1 1 干细胞的研究概况 近年来，随着生命科学技术的迅速进步，干细胞研究取得了突破 性的进展。特别是人类多能胚胎干细胞分离、培养和建系的成功，揭 开了干细胞研究的新篇章。1 9 9 9 年s c i e n c e 杂志将“人类干细胞研究” 列为当年世界十大科学成就的榜首后，干细胞研究热潮席卷整个生物 医学领域，方兴未艾【l 】o 干细胞是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一 种高度分化子代细胞的未分化细胞。根据分化潜能的宽窄，可将干细 胞分为三类，一是全能干细胞( t o t i p o t e n ts t e mc e l l ) ，受精卵及其分裂 生成的卵裂球具有发育成一个完整机体的潜能，因而称为全能干细 胞；二是多能干细胞，包括胚胎多能干细胞( p l u r i p o t e n ts t e mc e l l ) 和成体多能干细胞( m u l t i p o t e n ts t e mc e l l ) ，已有的研究表明，前者的 分化潜能宽于后者。三是单能干细胞( u n i p o t e n ts t e mc e l l ) ，它们一 般只沿单谱系分化，生成一种终末成熟细胞2 1 。 干细胞研究不论是对破解机体发生发育之谜，还是对阐释成体细 胞更新和组织修复的机理，都是至关重要的。人们对干细胞研究的热 忱和重视，更在于对利用干细胞治疗多种“不治之症寄予了厚望。 例如，用神经干细胞治疗神经变性疾病【3 1 、用造血干细胞重建造血机 能【4 1 、用胰岛干细胞治疗糖尿病【5 1 、用间充质干细胞修复严重的骨缺 损6 1 。理论上，任何涉及丧失正常细胞的疾病，都有可能通过干细胞 技术来治疗，其主要技术是干细胞移植和基于干细胞的组织工程策 硕士学位论文 略。干细胞也可能是基因治疗的理想载体细胞，因为它们可以自我复 制，治疗基因通过它们带入人体中，能持续发挥作用，而不必担心像 分化的细胞那样，随着细胞更新而丢失。干细胞研究还具有其它多方 面的应用潜力，例如，干细胞可以用作新药和毒物的筛选模型，以及 用于探索先天性缺陷的病因等【1 1 。 干细胞技术是指人们有目的地利用、改造和定向诱导分化干细 胞，发挥干细胞全能或多向分化潜能的综合生物技术。阐明干细胞增 殖和定向分化的调控机制是干细胞技术建立和发展的重要前提。干细 胞增殖和分化的调控是许多因素参与的动态调节过程，这些因素包 括细胞内在和外在因素，各因素之间存在着极其复杂的相互作用。在 内在因素中，一些结构蛋白和其它结构因子可通过各种方式影响干细 胞的有丝分裂的部位、染色体的功能及自分泌。不同类型干细胞的内 在调控机制有很大差别。外在因素主要包括细胞因子、膜蛋白介导的 细胞间相互作用和细胞外基质三类，它们通过细胞内信号转导系统的 介导，尤其是通过上调和下调转录因子，引起靶基因表达的改变，从 而调控干细胞的生物学行为【7 】o 大量研究表明，细胞因子是调控干细胞行为的重要外在因素。根 据它们作用的主要效应，可分为正调控( 生长) 因子和负调控( 抑制) 因子。这些生长因子与抑制因子协同配合，调节着干细胞的增殖与分 化，保证机体内干细胞的动态平衡，满足机体对干细胞的需要。目前 已发现了多种对干细胞具有调控作用的细胞因子，它们大多为蛋白质 和肽类，也有小分子物质8 ，9 1 。以造血干细胞为例，目前研究较深入 a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞生长的影响 的造血刺激因子主要有促红细胞生成素( e p 0 ) 、粒细胞集落刺激因 子( g c s f ) 、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子( g m c s f ) 、白细胞 介素( i l 3 ) 、血小板生成素( t p o ) 、干细胞因子( s c f ) 和f l 等。 造血抑制因子主要有转化生长因子b ( t g f b ) 、巨噬细胞炎性蛋 白1q ( m i p 1q ) 、肿瘤坏死因子q ( n 师一q ) 、干扰素丫( i f n 吖) 、 n - 乙酰基丝氨酰一天冬氨酰赖氨酰脯氨酸( a c s d k p ) 、造血抑制五 肽( p e e d c k ) 、血小板因子4 ( p f 4 ) 、胸腺素b4 ( t b4 ) 等10 1 。 负调控对干细胞增殖和分化的正常进行，尤其对干细胞“干性” ( s t e n l n e s s ) 的保持和稳态的维持，可能起着重要的作用。有研究表 明，a c s d k p 、p e e d c k 等造血负调控因子能减轻化疗剂和电离辐射 对干细胞的损伤，有作为干细胞保护剂的临床应用前景。因此，干细 胞负调控因子越来越受到研究者的重视7 1 。 1 2 间充质干细胞的研究进展 间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ，m s c ) 是来源于中胚层的 一种成体干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中 含量最为丰富。1 8 6 7 年德国病理学家c o h l l h e i m 首次提出在骨髓中 存在非造血性干细胞的观剧12 1 。直至2 0 世纪7 0 年代中期，f r i e d e n s t e i n 等1 3 】的先驱性研究才揭示了骨髓中存在非造血性干细胞这一事实。这 种干细胞后来被称为骨髓m s c ，它们在体外培养条件下具有贴壁生 长的特性，易于分离和纯化，可以多次传代并保持分化能力。在体外 一定的诱导条件下，m s c 可以分化为其它多种细胞，适用于多种组 织的重建，具有广泛的应用前景1 1 】。 硕士学位论文 从骨髓中分离m s c 的方法主要有：根据骨髓m s c 的底物粘附 特性来实现分离的贴壁筛选法；根据m s c 与其他细胞的密度不同来 分离的密度梯度离心法；根据细胞大小不同或者根据细胞表面的一些 特殊标志来分离的流式细胞仪分选法 1 1 】。目前使用较多的是先用密度 梯度离心法收集单个核细胞，再进行贴壁培养筛选的方法。但不论上 述哪种分离方法均不能直接得到纯的m s c ，其中总混有一定的单核 巨噬系细胞、内皮细胞等，因此不少学者试图获得m s c 的特征性表 面抗原标记来筛选和鉴定m s c 。可迄今为止，尚未发现间充质干细 胞独特的表面标记，其表面标记往往具有间质细胞、内皮细胞和上皮 细胞的特点，而且许多作者的报道也不尽相同。其中大部分研究者认 为，m s c 表面表达s h 2 ，s h 3 、c d 2 9 、c d 4 4 ，c d 7 1 、c d 9 0 、c d l 0 6 、 c d l 2 0 a 和c d l 2 4 等，而不表达c d 4 5 、c d 3 4 和c d l 4 等典型的造 血细胞抗原【1 1 1 4 】。因此在实验中一般选择具有代表性的抗原进行检 测。目前尚无直接方法鉴定m s c ，其鉴定的最常用的鉴定方法是通 过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为m s c 。 在正常生理条件下，机体内大多数m s c 并不增殖。然而，在体外 补充适宜血清的培养液中，它们能贴附于塑料培养器皿上生长，迅速 增殖，并在多次传代中保持未分化状态。体外培养骨髓m s c 的生长受 多种因素的影响，不同的培养液、培养的环境条件、血清批次和浓度、 细胞因子、细胞接种密度、动物种系、个体年龄和身体状况、骨髓取 样部位以及分离细胞的技术等因素，均能影响m s c 的生长情况。近来 有研究显示，二维培养法和低氧张力培养法能增强m s c 碱性磷酸酶 a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞生长的影响 ( a l p ) 的表达，提高细胞的增殖速度，更有利于其生物学特性的维 持【1 5 ，16 1 。 在这些因素中，探索细胞因子对骨髓m s c 增殖影响的研究较多， 并取得了一定的进展。y o o ns y 等在血清剥夺的情况下，同时在培 养体系中加入从骨髓细胞培养获得的无血清条件培养液，人或小鼠骨 髓基质成纤维细胞集落( 舶r o b l a s tc o l o n y - f o m l i n gu n i t ，c f u f ) 都能 够形成。但在这样的培养体系中，抗血小板衍生生长因子( 抗p d g f ) 、 抗转化生长因子b ( 抗t g f b ) 、抗碱性成纤维细胞生长因子( 抗 b f g f ) 和抗表皮生长因子( 抗e g f ) 等抗体的中和作用能抑制其集 落的形成，提示骨髓基质成纤维细胞前体细胞( m s c ) 增殖起始的激 活至少需要p d g f 、b f g f ( f g f 2 ) 、t g f b 和e g f 四种因子参与。 b a d d o o 等发现成纤维生长因子2 ( f g f 2 ) 能促进小鼠m s c 的增殖， 抑制其分化。l e m o n 等观察到p d g f 和b f g f 对大鼠m s c 有较强的促 增殖作用，但e g f 和酸性成纤维细胞因子( a f g f ) 对m s c 的生长没 有明显作用。l o c l ( 1 i n 等例报道，在不含血清的培养体系中，t g f b 剂量依赖性地促进人骨髓m s c 生长；而在含胎牛血清的体系中，高浓 度的t g f b 抑制人骨髓m s c 生长。w b r s t e r 等 2 1 1 发现，一定剂量t g f b 对马骨髓m s c 的增殖也有促进作用。f r o m i g u e 等2 2 1 观察到骨形态发 生蛋白2 ( 舳2 ) 对骨髓基质细胞的增殖具有促进作用。g u o 等【2 3 】 的实验表明，m s c 对多种细胞因子的增殖反应不同，肿瘤坏死因子a ( t n f a ，4 0 n g m l ) 、重组人干扰素- y ( i f n y ，1 0 0 n g n 也) 、干细胞 因子( s c f ，5 0 n g m l ) 和胰岛素样生长因子一i ( i g f - i ，1 0 0 n m l ) 硕士学位论文 可明显促进m s c 的增殖；而1 0 n m l 的血管内皮细胞生长因子 ( v e g f ) 和1 n 酿n l 的成纤维细胞生长因子( b f g f ) 则没有促进m s c 增殖的作用。还有作者报道，g m c s f 、i l 一3 及巨噬细胞集落刺激因 子( m c s f ) 均能够刺激刺激小鼠骨髓基质细胞前体细胞的增殖【2 4 1 。 体外培养的骨髓m s c 在适合的诱导条件下，可分化为成骨细胞、 成软骨细胞、脂肪细胞，还有一些作者报道，m s c 可分化成心肌细 胞和神经元样细胞等非造血组织细胞。p i t t e n g e r 等发现联合使用异 丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛可诱导脂肪细胞发生； 而联合使用地塞米松( 小鼠m s c 除外) 、d 。磷酸甘油和抗坏血酸可 诱导成骨分化；联合使用地塞米松和t g f b 可诱导m s c 微团 ( m i c r o m a s s ) 形成软骨细胞块。w 6 0 d b u u 等【2 5 1 以b f g f 、d m s 0 和 b h a 等为诱导剂可将成年大鼠和人的骨髓基质细胞在体外定向诱导 为神经细胞。t o m i t a 等的实验结果表明提取大鼠的m s c ，在体外 经过5 氮胞苷( 5 a z a ) 处理后，能被诱导分化成心肌样细胞。 m s c 在细胞移植，组织工程和基因治疗等方面的应用基础研究 也取得了可喜的进展。例如，k o c 等5 1 观察到在治疗接受大剂量化疗 的乳癌病人时，协同输入体外大量扩增的m s c 和外周血造血干细胞， 可加快造血功能的恢复。b m d e r 等【2 7 1 从正常人骨髓中分离出m s c ， 培养扩增后与h 刖t c p 陶瓷柱复合，植入裸鼠骨缺损区，8 周后观察 有新骨形成。l i e b e m a n 等口8 峙艮道将标记r h b 2 的基因导入动物的 m s c 内，将m s c 移植回动物大腿的骨缺损部位，也观察到了骨实质 的修复。 a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞生长的影响 1 3a c s d k p 的研究进展 a c s d k p 是一种生理性细胞生长调控因子。f r i n d e l 等例于1 9 7 7 年 首次发现胎牛骨髓提取物具有造血干细胞生长抑制活性，l e n f a n t 等【3 0 】 于1 9 8 9 年从中纯化出这种抑制活性的因子，确定了它的分子结构，即 a c s d k p 。现在主要通过化学合成获得该四肽因子，人工合成的 a c s d i o 与天然的a c s d k p 生物活性完全一致【3 1 ，3 2 1 。不少实验室对 a c s d k p 进行了深入研究，发现它广泛存在于动物和人体内，人外周 血单核细胞、血浆和尿液内能检测到该因子【3 3 3 6 1 。体外培养的人及小 鼠骨髓基质细胞能分泌a c s d k p 【3 7 3 9 】。胸腺素p 4 可能是a c s d k p 的前 体物质，其n 端含有完整的a c s d k p 序列( a c s d k p d 一) ，第4 位脯氨 酸残基与第5 位天冬氨酸残基之间肽键的蛋白酶切能产生a c s d k p 。 血管紧张素i 转化酶( a n g i o t e n s i ni c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 能切断其 天冬氨酸残基与赖氨酸残基之间的肽键，这可能是a c s d k p 降解的第 一步反应 4 0 ，4 1 1 。a c e 的特异抑制剂( 如卡托普利) 可阻止a c s d k p 的 降解【4 2 】。a c s d k p 也能由肾小球滤过，从尿中排出。 a c s d k p 具有广泛的造血干祖细胞生长抑制活性。体外培养研 究表明，a c s d k p 抑制长期培养启动细胞( 1 0 n g t e mc u l t u r e - i n i t i a t i n g c e l l s ，l t c - i c ) 、高增殖潜能集落形成细胞( h i g hp r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a l c o l o n y f o m i n gc e u ， 碑p c f c ) 、粒巨噬系集落形成单位 ( c 0 1 0 n y - f o m i n gu n i t sg r a n u l o c ”e ，m a c r o p h a g e ，c f u - g m ) 、红系爆 式集落形成细胞( e r y t i l r o i db u r s t f o m i n gc e l l s ，b f u e ) 和红系集落 形成细胞( e 例h o i df o m i n gc e l l s ，c f u e ) 等人及动物早期和晚期造 硕士学位论文 血干祖细胞的增殖 4 4 ，4 5 1 。细胞周期分析证实，该短肽阻止这些细胞进 入s 期，使它们停滞在g o g l 期。a c s d k p 的这种抑制作用是可逆的， 在培养体系中停止加入或撤除该因子后，这些干祖细胞的生长恢复 良好4 6 ，4 7 1 。动物实验提示它能抑制脾集落形成单位( c 0 1 0 n yf o m i n g u n i t s s p l e e n ，c f u s ) 的增殖，促使这种多能髓系干细胞保持在细胞 周期静止状态f 4 8 】。令人深感兴趣的是，a c s d k p 对多种白血病细胞以 及其他癌细胞( 例如皿一6 0 ) 的增殖无明显抑制作用h 9 ，5 0 1 。研究者们 希望将a c s d k p 用作抗癌治疗的干细胞保护剂。体外和体内实验结 果都证明，这种四肽能减轻化疗和放疗等抗癌疗法对正常造血干祖 细胞的损伤，特别是能保护长期造血重建细胞( 1 0 n g t e m l r e c o n s t i t u t i n gc e n ，l t r c ) ，也能保护c f u s 、h p p c f c 和c f u 一( 砷订 等，有利于治疗后造血功能的恢复5 1 5 7 】。 随后的研究发现，a c s d i o 的增殖抑制作用不仅限于造血系统， 它对非造血细胞也有抑制作用。例如，它抑制淋巴细胞、肝细胞、近 曲肾小管上皮细胞系( l l c p k l ) 和肾间质成纤维细胞系( 4 9 f ) 的生长5 8 “o 】；在体外培养的心肌成纤维细胞中，一定剂量的a c s d k p 能通过抑制s m a d 2 和s m a d 3 的磷酸化，而抑制心肌细胞胶原的合成 【6 1 】；在体内也被证实能抑制高血压和心肌梗塞等疾病中的心肌细胞中 胶原的沉积，对心肌纤维化有逆转作用【6 2 6 3 1 。a c s d k p 还能抑制骨髓 基质细胞系( m s 1 t ) 的增殖，以及调节基质细胞的功能，促进造 血细胞与基质细胞的粘附【6 4 ，6 5 1 。近来有作者报道，a c s d k p 能通过抑 制人肾小球膜细胞s m a d 信号途径，而抑制t g f b 诱导的细胞外基 a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞生长的影响 质蛋白的表达。在糖尿病小鼠，a c s d k p 的长期给药能够通过抑制 t g f b s m a d 信号途径改善肾功能不足和肾小球硬化【6 6 】。 a c s d k p 还是血管生成的诱导因子，能通过刺激m c p 一1 相关信 号途径的活性来刺激缺血后新血管的形成6 7 1 。有作者报道，在体外培 养条件下，a c s d k p 能刺激内皮祖细胞的迁移和分化成毛细血管样结 构，以及促进内皮细胞分泌基质金属蛋白酶；在体内能促进角膜血管 的形成，也能增加心肌毛细血管的数量。这些结果提示a c s d k p 对 高血压和心肌梗塞等心血管疾病的治疗有一定的作用嘲。该因子对血 管平滑肌细胞的增殖还有明显的刺激效应【6 9 】。我室近来的实验发现， 该四肽因子能抑制小鼠骨髓间充质干细胞的增殖。目前，尚未见有文 献报道a c s d k p 对人骨髓m s c 生长的影响。 1 4 本研究的目的和意义 本研究的目的是通过分离、纯化和培养人骨髓m s c ，观察 a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓m s c 生长的影响，并初步探索了其 可能的作用机理。本研究结果将为骨髓m s c 生长调控理论增添新的内 容，并为a c s d k p 的医学应用研究提供有用的实验资料。 硕士学位论文 2 材料和方法 2 1 成人骨髓 从胸外科择期手术切口中摘除的肋骨段取得骨髓。肋骨段由中南 大学湘雅医院手术室提供，手术病人无血液系统疾患且无肋骨病变。 2 2 主要试剂 2 2 1d m e m 培养液( d u l b e c c o sm o d i 6 e de a 9 1 e sm e d i u m ) ： d m 粉( 低糖，s i g m a 公司产) 用三蒸水溶解，每1 l 培养基加入 n a h c 0 33 7 克，调p h 至7 2 ，过滤除菌，4 保存，使用期两个月以内。 2 2 2 胎牛血清( f a t a lb o v i n es e m m ) ：天津t b d 生物工程公司产， 5 6 灭活3 0 m i n ，分装后一2 0 贮存。 2 2 3 a c s d k p ：s i g m a 公司产，用d m 培养液配成浓度 1 1 0 8 m 0 1 l 的溶液，4 贮存。 2 2 4 四甲基偶氮唑盐( 3 一( 4 ，5 - m e 让i y l t h i o z 0 1 ) 一2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ，m t t ) ：s i g m a 公司产，用磷酸盐缓冲液( p b s ， o 0 1 m o l l ，p h7 4 ) 配成5 m g m l 的m t t 溶液，过滤除菌，分装，4 保存备用。 2 2 5 卡托普利：s i g m a 公司产，用d m 培养液配成1 0 5 u g l 的 储存液，过滤除菌，4 保存。 2 2 6 磷酸盐生理盐水缓冲液( p b s ) ：n a c l8 o o g ，k c lo 2 0 9 ， n a 2 肿0 4 h 2 01 5 6 9 ，乇p 0 4o 2 0 9 ，用三蒸水溶解，定容至1 l ，高 压灭菌，4 保存备用。 2 2 74 台盼兰母液：台盼兰4 o g ，加少量水研磨，定容至l o o m l ， 1 0 a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓问充质干细胞生长的影响 滤纸过滤，室温保存。 2 2 8p i ( 溴化丙啶) 染液： p i1 0 0 u g ，r n a s e a o 2 m g ，以1 的n p 4 0 和1 的柠檬酸三钠配制成2 m l ，4 避光保存备用。 2 2 95 溴脱氧尿嘧啶核苷( b r d u ) ：s i g m a 公司产，用生理盐水 配成3 0 0 u m o l l 溶液，过滤除菌，4 避光保存。使用期1 个月以内。 2 2 1 0 秋水仙素：s i g m a 公司产，用生理盐水配成1 0 u g m l 溶液， 4 保存。 2 2 1 1 油红o 染液：将油红0o 5 9 和异丙醇1 0 0 m 帷0 入三角烧瓶 内，于水浴中稍加热溶解，待冷却后过滤，用小口塞瓶密封保存备用。 2 2 1 2 成骨诱导液：用含1 f b s 的d m 培养液配制，含 1 0 m o l l 的地塞米松( 储存液1 m m 0 1 l ，无水乙醇配制) 、5 0 m g l 的 抗坏血酸和1 0 m 0 1 l 的b 磷酸甘油。 2 2 1 3 成脂诱导液：用含5 f b s 的d m 培养液配制，含1 0 u g l 的胰岛素( 储存液1 0 0 u g l ，生理盐水配制) 、1 u m o l l 的地塞米松( 储 存液1 m m 0 1 l ，1 0 0 乙醇配制) 、o 5 m m o l l 的1 甲基一3 一异丁基黄嘌呤 ( 储存液5 0 0 m m o l l ，d m s o 配制) 和1 0 0 u m o l l 的吲哚美辛( 储存液 1 0 0 m m o l l ，d m s 0 配制) 。 2 2 1 4 茜素红s 染色液：o 2 9 茜素红s 溶于1 0 毫升蒸馏水中，室温 闭光保存。 2 2 1 5 胰蛋白酶溶液：取o 2 5 9 胰蛋白酶溶于1 0 0 m 1 p b s 缓冲液 ( p h 8 o 左右) 中，充分溶解，过滤除菌。 2 2 1 6 瑞氏- 姬姆萨( w r i g h t e g i e m s a ) 染色液：5 份瑞氏染液( o 1 9 硕士学位论文 瑞氏粉溶于6 0 m 1 纯甲醇) 和1 份姬姆萨染液( o 8 9 姬姆萨粉溶于5 0 m 1 甘油和5 0 m 1 甲醇) 混合配制，临用前加等量p b s 稀释。 2 2 1 7 荧光色素标记的小鼠抗人抗体：c d 2 9 一p e 、c d 3 4 一p e 、 c d 4 5 f i t c 、c d 71 f i t c 、c d 9 0 f i t c 产于b d 公司。 2 2 1 8 免疫组化试剂：小鼠抗b r d u 单克隆抗体购于u s b i o 公司； 即用型s a b c 免疫组化试剂盒、d a b 显色试剂盒购于武汉博士德生物 公司。 2 3 主要仪器及耗材 c 0 2 培养箱( f o m a ，3 1 1 0 ) ，倒置生物显微镜( x d s 一1 b ，重庆 光电仪器有限公司) ，酶标仪( e l x 8 0 0 ，b 1 0 t e k ) ，离心机( l d 5 2 a ， 北京医用离心机厂) ，超净工作台( 苏净集团安泰公司产品) ，b d f a c s c a l i b u r 流式细胞仪( 美国b d 公司) 。塑料培养瓶、培养皿、培 养板为c o s t a r 公司产品。 2 4 人骨髓单个核细胞的分离 在无菌条件下将上述肋骨段剪成约3 c m 小段，用d m m 培养液 冲出骨髓，依次用带7 号、6 号、4 号针头的注射器将骨髓悬液吸打 各3 次，制成单细胞悬液。将单细胞悬液加于淋巴细胞分离液上，4 ， 5 0 0 9 离心1 0 分钟，收集中间层单个核细胞，用d m 重悬所收细 胞，洗2 次，计数备用。 2 5m s c 原代和传代培养 取骨髓单个核细胞混于2 0 ( 体积分数，下同) f b s 的d m 液中，每m l 悬液含细胞5 1 0 6 个，种入塑料培养瓶，于3 5 、5 c 0 2 、 a c s d k p 对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞生长的影响 饱和湿度的环境条件下培养。3 d 后更换一次培养液，相同环境条件 下继续培养，待细胞增殖至铺满瓶底，用胰蛋白酶消化法收集贴于瓶 底的细胞，于同样培养体系和条件下传代培养，以扩增和纯化人骨髓 m s c 。 2 6 流式细胞技术 2 6 1m s c 表面抗原的检测 胰蛋白酶消化法收集上述扩增培养的第3 代细胞，用p b s 洗涤3 次，并制成细胞浓度为1 1 0 5 个m 1 的单细胞悬液。分别取上述细胞 悬液l o o u l ，加入c d 2 9 p e 和c d 3 4 p e 、c d 2 9 p e 和c d 4 5 f i t c 单 克隆抗体进行双染；加入c d 71 f i t c 、c d 9 0 f i t c 单克隆抗体进行 单染，室温下孵育3 0 m i n 。然