（作物遗传育种专业论文）玉米诱变系的遗传变异研究.pdf

西南大学硕士学位论文 摘要 玉米诱变系的遗传变异研究 作物遗传育种专业硕士研究生：杨春蓉 指导教师：蔡一林教授 摘要 化学诱变是快速创造新种质的有效手段。化学诱变育种成功的关键在于诱发材料产生遗 传变异、筛选优良变异系。本研究以诱交系及其部分杂交种为材料，从农艺性状、品质性状 和s s r 分子标记三方面分析了诱变系的遗传变异，同时还分析了诱变系各性状间的相关关系 以及诱变系品质性状的杂种优势，结果如下： 1 、经过化学诱变处理，诱变材料在农艺性状、品质性状上产生了厂泛的变异，形成了具 有不同农艺性状、品质性状的诱变系。其中部分材料如材料3 、材料8 、材料1 0 等，在多个 性状上产生了变异，为变异较大的诱变系。结果表明，化学诱变处理能够有效地诱发玉米自 交系产生突变，而形成具有不同农艺性状、品质性状的诱变系。因此，化学诱变是创造玉米 新种质的有效途径。 2 从9 7 对s s r 引物中筛选出5 2 对扩增产物具有稳定多态性的引物。5 2 对引物在供试材 料中共检测到1 7 0 个等位基因变异，每对引物检测出2 6 个等位基因，平均为3 2 7 个，每个 位点的多态性信息量( p i c ) 变化于o 0 3 9 0 7 1 5 之间，平均为o ，3 2 7 。4 9 个材料之间的遗传 相似系数变化范围在0 3 7 7 1 0 0 0 ，平均为0 8 2 3 。u p g m a 聚类分析结果表明，部分诱变系存 在较犬的变异，与农艺性状、品质性状的分析结果基本一致。研究表明s s r 标记可以用于诱 变系的遗传差异分析。 3 以诱变系为父本组配的杂交组合在品质性状上具有不同程度的离中优势，大部分杂交 组合，如以材料i 为父本组配的组合，在粗蛋白质含量上具有显著的超高亲优势，而在粗脂肪 和粗淀粉含量上不具有显著的超高亲优势。因此，在品质育种实践中，以该批诱变系为亲本， 有望组配出高蛋白质玉米，而难以获得高淀粉或高油玉米。 4 诱变系的农艺性状间存在着一定程度的相关关系，其中，穗粗与轴粗之间、株高与穗 西南大学硕士学位论文摘要 位高之问的相关系数达到了极显著水平。诱变系的品质性状间也存在着密切的关系，粗淀粉 含量与粗蛋白质含量的相关系数达到极显著水平，粗淀粉含量与粗脂肪含量的相关系数达到 显著水平。 5 诱变系的农艺性状与品质性状间的相关系数均未达l b 显著水平。结果表明透过化学诱 变处理可以同时改良农艺性状和品质性状，创造出农艺性状和品质性状均符合育种目标的育 种材料。 6 要准确地鉴定化学诱变系的遗传变异，我们应注意以下几个问题：( 1 ) 要选择多态性 高、重复性好的分子标记：( 2 ) 应尽可能多地选择引物，使其能充分覆盖整个基因组；( 3 ) 采取分子标记与形态标记相结合的方法，对诱变系进行综合分析评价。 关键词：玉米诱变系遗传变异 i i 西南大学硕+ 学位论文a b s t r a c t s t u d i e so nt h eg e n e t i c 吻r i a t i o no f m a i z e ( z e am a y s ) m u t a n t s c a n d i d a t e ： y a n gc h u n - r o n g a d v i s o r ：p r o f c a iy i 1 i n ( c o l l e g eo f a g r o n o m ya n db i o t e c h n o l o g y , s o u t h w e s tu n i v e r s i t y , c h o n g q i n g ，c h i n a ) a b s t r a c t c h e m i c a lm u t a t i o nw a sa ne f f e c t i v ew a yo fc r e a t i n gn e wg e r m p l a s mr e s o u r c e s t h ek e yo f c h e m i c a lm u t a t i o nb r e e d i n gw a st oi n d u c et h eg e n e t i cv a r i a t i o na n ds e l e c te l i t em u t a n t s i nt h i s p a p e r , c h e m i c a lm u t a n t sa n dap a r to ft h e i rh y b r i d sw e r es e l e c t e d 踮m a t e r i a l s w ea n a l y z e dt h e g e n e t i cv a r i a t i o na m o n gt h e s em a t e r i a l sb a s e do nt h ea g r o n o m i ca n dq u a l i t yc h a r a c t e r sa n ds s r m a r k e r s ，t h ec o r r e l a t i o na m o n gt h et r a i t so fm u t a n t sa n dt h eh e t e r o s i si nq u a l i t yt r a i t s t h er e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： i w i d e s p r e a dv a r i a t i o no fa g r o n o m i ca n dq u a l i t yt r a i t sw a sd e t e c t e di nc h e m i c a l l y - i n d u c e d p r o g e n y t h e me x i s t e dm u c hv a r i a t i o nf o rm u t a n t sn o 3 ，n o 8a n dn o 1 0i nm a n yc h a r a c t e r s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tc h e m a c a lm u t a t i o nc o u l dc a u s ev a i l a t i o ne f f i c i e n t l yi nt h ei n b r e dl i n e so f m a i z e ( z e am a y s ) a n dc r e a t e dm u t a n t sh a v i n gd i f f e r e n ta g r o n o m i ca n dq u a l i t yt r a i t t h e r e f o r et h e c h e m i c a lm u t a t i o nw a sa ne f f e c t i v ew a yo f c r e a t i n gn e wg e r m p l a s mr e s o u r c e s 2 5 2s s rp r i m e r ss e l e c t e df r o m9 7p r i m e r sg a v es t a b l ep r o f i l e sa m p l i f i e di ns a m p l eo f4 8 m u t a n t s ，a n dp r o d u c e d1 7 0p o l y m o r p h i ea m p l i f i e df r a g m e n t s t h ea v e r a g en u m b e ro fa l l e l ep e r s s rl o c u sw a s3 2 7w i t har a n g ef r o m2t o6 t h ep o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n tf o rt h es s r l o c iv a r i e df r o mo 0 3 9t oo 7 1 5w i t ha na v e r a g eo fo 3 2 7 g e n e t i cs i m i l a r i t i e sa m o n gt h e4 9 m a t e r i a l sr a n g e df r o mo 3 7 7t o1 0 0 0w i t ha na v e r a g eo f o 8 2 3 t h er e s u l to fs s rc l u s t e ra n a l y s i s s h o w e dd i s t i n c tv a r i a t i o na m o n gt h em u t a n t s ，w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ha g r o n o m i ca n dq u a l i t y c h a r a c t e r sa n a l y s i s i ti n d i c a t e dt h a ts s rm a r k e r sc o u l db eu s e df o ra n a l y z i n gg e n e t i cv a r i a t i o no f m u t a n t s 3 t h ec r o s s e sw i t hm u t a n tm a l ep a m n t sh a dh e t e r o s i sf r o mm i d - p a r c n tv a l u e a p a r to f t h e m ， i 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t s u c ha st h o s ew i t hn o ia sm a l ep a r e n t h a ds i g n i f i c a n th e t e r o s i so v e rh i g h e r - p a m n ti nc r u d ep r o t e i n c o n t e n t b u td i d n th a v es i g n i f i c a n th e t e r o s i so v e rh i g h e r - p a r e n ti nc r u d ef a tc o n t e n to ri nc r u d e s t a r c hc o n t e n t c o n s e q u e n t l y , i nq u a l i t yb r e e d i n gp r o g r a m w ec o l l l dg a i nq u a l i t yp r o t e i nm a i z e f r o mt h e s em u t a n t s b u ti tw a sh a r dt og a i nh i g ho i lo rs t a r c hm a i z ef r o mt h e s em u t a n t s 4 ，t h e r ee x i s t e ds o m ec o r r e l a t i o na m o n ga g r o n o m i cc h a r a c t e r s t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s b e t w e e ne a rd i a m e t e ra n da x i sd i a m e t e r , b e t w e e np l a n th e i g h ta n de a rh e i g h tw e r ed g n i f i c a n ta tt h e o 0 ll e v e l t h e r ee x i s t e ds o m ec o r r e l a t i o na m o n gq u a l i t yt r a i t so fm u t a n t s t h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tb e t w e e nc r u d es t a r c hc o n t e n ta n dc r u d ep r o t e i nc o n t e n tw a ss i g n i f i c a n ta tt h e0 o ll e v e l a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e nc r u d es t a r c hc o n t e n ta n dc r u d ef a tc o n t e n tw a ss i g n i f i c a n ta t t h e0 0 5l e v e l 5 t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e m sb e t w e e na g r o n o m i cc h a r a c t e r sa n dq u a l i t yt r a i t so fm u t a n t sw e r e n o ts i g n i f i c a n t t h er e s u l ti n d i c t e dt h a tc h e r m c a l m u t a t i o nc o u l ds y n c h r o n o u s l yi m p r o v et h e a g r o n o m i cc h a r a c t e r sa n dq u a l i t yt r a i t sa n dc r e a t eb r e e d i n gm a t e r i a l sw h i c hm e e tt h eb r e e d i n g o b j e c t i v eo na g r o n o m i cc h a r a c t e r sa n dq u a l i t yt r a i t s 6 w es h o u l dp a ya r e n f i o nt os o m eq u e s t i o n si ni d e n t i f m gt h eg e n e t i cv a r i a t i o no f m u t a n t s ：( 1 ) s e l e c t i n gt h em o l e c u l a rm a r k e r st h a th a v eg o o dp o l y m o r p h i s r na n ds t a b l er e p e t i t i o n ( 2 ) s e l e c t i n g m o r ep r i m e r st oc o v e ra l lt h eg e n o m e ( 3 ) c o m b i n i n gt h em o l e c u l a rm a r k e rw i t hs h a p em a r k e ri n e s t i m a t i n gt h eg e n e t i cv a r i a t i o no f m u t a n t s k e y w o r d s ：m a i z e ( z e am a y s ) ；m u t a n t ；g e n e t i cv a r i a t i o n 独创性声明 y 9 3 7 6 7 3 学位论文题目：垂苤透銮丕煎遂堡变昱班究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：物眷碧 签字日期：加。g 年j 月药日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保 密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：杨香蓉导师签名：臻一林 签字日期：加6 年工月巧日签字日期：知“年3 - 月工，目 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话：(! 邮编： 西南大学硕士学位论文 文献综述 第1 章文献综述 玉米种质资源是玉米育种工作的物质基础，任何一名成功的育种家都十分重视对丰富的 种质资源的掌握、挖掘和利用。由于广泛利用杂种优势，在推广玉米杂交种的地区，许多地 方品种都被杂交种取代了。目前，我国玉米种质资源已经变得比过去简单，部分地区存在种 质资源贫乏、遗传基础狭窄、缺乏有突破性的后备品种的现象“。另一方面，随着人民生活 水平的提高，育种目标的发展变化，对杂交种的产量、品质和抗性的要求在不断提高。因此， 玉米种质资源在育种中的作用就显得更加重要。 1 1 我国玉米种质资源现状 我国具有丰富的玉米种质资源。据统计，目前世界上已收集到的品种资源约有8 万多份， 其中美国和墨西哥国际玉米小麦改良中, i 二* ( c i m m y t ) 各保存有2 万多份，我国有1 5 9 9 0 份”“。 但自2 0 世纪6 0 年代以来，随着单交种的普及和育种目标的不断提高，育种家把更多的注意 力集中在极少数优秀的温带种质上。吴景锋( 1 9 8 3 ) 曾指出：我国玉米杂交种的亲本种类较 少，骨干系集中，种质遗传基础较为狭窄，籽粒产量的育种水平进展缓慢“1 。曾三省( 1 9 9 0 ) 对1 9 7 8 1 9 8 7 年中国主要玉米杂交种生产和1 9 8 4 1 9 8 8 年全国大区区域试验资料的分析表 明：我国玉米杂交种生产已完全进入单交种时代，国内系x 国外系的杂交种面积增加较多， 玉米杂交种的亲本系的利用更趋集中”1 。根据玉米育种家对玉米种质杂种优势群的划分，发 现1 9 7 8 1 9 9 8 年种植面积6 6 7 万h m 2 以上玉米杂交种组成的自交系类群有很大的变化：1 9 7 8 年，外选杂优群( 2 6 1 8 ) 和综合种弧群( 2 8 8 2 ) 组配的杂交种在生产面积上占绝对优势， 而改良r e i d 群组配的杂交种所占生产面积仅1 6 3 。到1 9 9 0 年，生产上应用的玉米自交系类 群发生了显著变化，外选杂优亚群和综合种亚群组配的杂交种分别降至1 0 1 8 和6 5 6 ；塘 四平头群和旅大红骨群组配的杂交种所占面积上升至2 4 6 0 和1 4 3 7 。应特别指出的是， l a n c a s t e r 群中的m 0 1 7 亚群组配的杂交种所占面积增至3 0 “，居首位。1 9 9 8 年，改良r e i d 群从1 9 9 0 年所占面积的1 0 3 0 增至2 7 2 6 ，l a n c a s t e r 群为2 4 1 9 ，塘四平头群为1 6 1 6 。 旅大红骨群为1 2 9 1 ，外选杂优亚群、综合种亚群和自3 3 0 亚群所占面积比例f 降。新选育 的s u w a n 弧群和其他亚群有5 个系所配组合初显端倪。总的来说，玉米种质基础明显集中在 改良r e i d 群、l a n c a s t e r 群、塘四平头群和旅大红骨群这四大类群，其面积占总面积的8 0 5 2 。 到2 l 世纪初，主要的杂种优势群则为r e i d 、自3 3 0 、塘四平头、l a n c a s t e r 和温热i 。其中温 热i 是一个含热带玉米种质的新类群，它包括国外p 7 8 5 9 9 等种质，它的出现大大拓宽了我国 玉米杂种优势的利用模式。2 0 0 1 年，r e i d x 温热i 和自3 3 0 x 温热i 已分别成为全国第一和第 四大主要的杂种优势模式”1 。由此可见，一方面，我国具有丰富的玉米种质资源；另一方面， 我国玉米杂交种的亲本的利用趋于集中，生产用种种质单一，遗传基础狭窄，新的突破性自 西南大学硕士学位论文文献综述 交系少，容易造成品种在适应性、抗性上的脆弱，成为制约我国生产和杂交育种的“瓶颈“”1 。 要突破这个制约我国玉米生产和杂交育种的“瓶颈”，关键是调整玉米育种的攻关方向， 创新和改良玉米种质，丰富遗传类型，拓宽遗传基础。目前主要有以下儿种途径： ( 1 ) 挖掘利用地方种质资源。地方品种中有许多可被利用的优良基因，如抗病、抗旱、 适应性强、配合力高等。系统地整理、筛选和改良地方种质资源，是拓宽玉米种质资源，克 服种质遗传基础狭窄的重要途径。例如，我国著名的自交系黄早四、丹3 4 0 、e 2 8 等就是从地 方品种中选育出来的”3 。 ( 2 ) 引进新的外来种质资源并对其进行改良利用，主要指热带、亚热带和近缘属种质在 温带的改良利用。外来种质具有地方玉米种质不同的遗传基础和适应性，它的导入和利用， 可以丰富地方玉米种质，扩大遗传基础，改良玉米农艺性状，增强抗病性和拓宽适应性。目 前利用该途径选育出的遗传稳定、配合力高的自交系已达5 0 0 多份”1 。 ( 3 ) 采用生物技术、诱变技术等创造新的种质资源。苇q 用转基因技术将外源d n a 导入 玉米中已培育出一批抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐、优质的玉米新品种或优良种质。在1 9 9 9 年，转基因玉米的种植面积就已经达到1 2 0 0 万h m 2 ，占世界玉米总面积的9 左右“。诱变 技术在刨造玉米新种质方面也发挥着重要作用，以y 射线为主的物理诱变，育成了原武0 2 、 原辐1 7 、鲁原1 3 3 、丹3 4 0 、丹3 6 0 等自交系，组配了鲁原单4 号、鲁玉5 号、掖单1 3 、鲁 单5 0 等杂交种，对玉米生产的发展起了较大的作用“1 i 。近1 0 年来，石蜡油e m s 花粉诱变育 种、离子注入育种、空间育种等诱变新技术，已开始应用于植物品种改良，并显示出良好的 发展前景1 。 1 2 化学诱变在玉米育种中的应用 化学诱变育种是用化学药剂处理作物的植株、种子、花粉、花药、合子或单细胞培养物 等，以引起碱基置换、染色体断裂、基因重组或基因突变等生物学效应，使作物后代产生变 异，并对突变体进行研究筛选和鉴定的一门现代生物学技术“3 i 。它具有诱发突变、促进遗传 基因重新组合、提高突变频率以及扩大突变谱的特点，能够在较短时间内创造有利用价值的 突变体，育成优良品种进行直接利用，或作为种质资源间接利用，以及解决远缘杂交等一系 列问题1 。 1 2 1 化学诱变育种的简要发展历程 化学诱变研究始于2 0 世纪初。m o r g a n ( 1 9 1 0 ) 、m c - d o n g a l ( 1 9 1 1 ) 、b a u e r ( 1 9 1 6 ) 和 s a e h a r o v ( 1 9 3 6 ) 等人相继发现了化学物质能提高果蝇及某些微生物的突变率。1 9 4 6 年，德国 遗传学家a u e r b a e h 和前苏联遗传学家拉波波尔特等在这方面进行了比较系统的研究，明确提 出某些化学物质对果蝇具有诱发突变的作用“。 在高等植物的化学诱变方面，c e h l e r e ( 1 9 4 3 ) 利用乙基尿烷和三氯化铝等化台物处理月 2 西南大学硕士学位论文文献综述 见草、百合及桃叶风铃草等植株，在小孢子母细胞减数分裂中，首先观察到这些化台物能够 诱发染色体畸变。之后，化学药剂的诱变作用引起了育种家的兴趣。c a u e r b a c h 等( 1 9 4 6 ) 发现芥子气对生物体有诱变效果。g u s t a f s s o n 等( 1 9 4 8 ) 用芥子气处理大麦，获得了突变体。 s c h e i b e ( 1 9 5 7 ) 用乙基屎烷育成了缺少苦味素的野木樨品种。n i l a n ( 1 9 6 7 ) 用硫酸二乙酯( d e s ) 处理大麦种子，育成了产量高、茎秆矮、抗倒伏的晶种“l u t h e r ”。此后，农作物的化学 诱变育种工作才逐渐发展起来。前苏联化学遗传研究所在r a p o p o r t 博士领导下，自1 9 6 0 年起 在世界上率先开展化学诱变育种研究。这种育种方法以后在世界各国得到推广。特别是近三 十多年来。俄、法、意、美、日及印度，先后用这种方法育成了不少农作物新品种，并且品 种数目在逐年增加。1 9 7 0 年以前用化学诱变方法育成的作物品种只有1 个，到1 9 8 1 年为2 1 个，到1 9 8 6 年达到4 9 个，到1 9 9 0 年则为1 0 6 个，处理作物类型涉及禾谷类、豆类、园艺类 等3 8 种作物，其中大麦1 5 个，水稻1 2 个，小麦9 个，玉米7 个“”，到1 9 9 5 年达到1 7 3 7 个，而到2 0 0 0 年则增至2 2 5 2 个”。 这些早期的研究成果和进展为诱变机理的研究及诱变在育种上的应用奠定了坚实的基 础。到1 9 6 4 年国际上成立了联台国粮农组织国际原子能机构联合处( f a o i a e a ) ，形成了 世界性的协作研究体系和学术交流网络，使诱变育种得到了迅猛的发展，并在较短时间内取 得了显著的成果。 我国开展化学诱变研究工作较晚，应用的作物有水稻、小麦、大豆、花生等并取得了 一定的成绩。江西省赣卅i 地区农科所用化学诱变方法育成了一个花生品种，并大面积推广过。 中国科学院遗传研究所近几年来在这方面做了不少工作，他们提出的用化学诱变剂处理尚未 分裂的合子细胞的方法以及用博莱霉素( 争光霉素) 后处理抑制修复的效应，对于提高突变 率和扩大突变谱有一定的理论和实际意义”1 。 随着现代科学技术的发展，诱变技术正与生物技术、加倍单倍体技术、杂种优势育种技 术、常规育种方法等相互交叉、渗透和结台，形成一门综合性的育种技术”“。实践证明诱变 育种既能诱发遗传基因突变又能促进遗传基因重新组合，提高基因重组率，对单基因控制的 遗传性状的改良尤为重要，可在较短的时间内获得优良突变体以育成新品种直接利用或作为 种质资源间接利用。因此，采用化学诱变产生突变体是快速创造新品种的有效途径之一，化 学诱变育种是杂交育种的一个有力补充”。 1 2 2 玉米化学诱变育种的发展历史 在2 0 世纪6 0 一7 0 年代，各国的研究者应用不同的诱变剂和不同的处理方法，对玉米诱变育 种进行了比较系统的研究，使玉米诱变育种技术得到了突飞猛进的发展。c o m u 等用甲基磺酸 乙酯( e t h y l m e t h a n es u l f o n a t e ，简称e m s ) 水溶液处理感染小斑病的法国玉米自交系种子，将 m ，代正在发芽的种子放在小斑病菌液上生长或用小斑病菌液喷洒幼苗，从两个处理中都筛选 出了抗性个体1 。但是由于成熟玉米籽粒的胚中具有分开的已定型的雄花和穗原基细胞，并 西南大学硕士学位论文 文献综述 i i i i 且在突变发生过程中容易产生细胞间竞争，使突变细胞受到抑制或消亡，被排除在生殖过程 之外”“。后来，人们注意到玉米花粉最大、授粉容易，并且处理配子可显著提高诱变效果“， 就开始尝试用化学诱变剂直接处理花粉。美国密苏里大学( u n i v e r s i t yo fm i s s o u r i ) 的n e u f f e r 等人从1 9 6 3 年就开始致力于这方面的研究。起初采用浸泡雄穗的方法，结果不仅t 作劳累， 而且成功率低”。而直接用药剂处理花粉，齐i 量太大，花粉难以成活；以水溶液处理花粉， 花粉吸水胀破死亡。直到1 9 6 6 年，c o e 发现玉米花粉可以在石蜡油中悬浮几个小时，仍保持生 命力，把它们涂到花丝上，仍能正常授精结实1 。后来n e u f f e r 等人将此发现加以引伸，进一 步把化学诱变剂悬浮于石蜡油中，然后与玉米花粉混合进行诱变，获得成功，突破了化学药 剂不能直接诱变花粉的瓶颈。经过不断改进和完善，目前这项技术已经成为玉米化学诱变 的主要手段。 1 9 8 6 年，高士德种子公司( g a r s ts e e dc o m p a n y ) 用e m s 处理优良玉米自交系的花粉，然后 涂抹在花丝上进行自交，获得了9 株抗除草剂突变体，可忍受l o 倍除草剂的致死剂量。经r f l p 鉴定，此抗性基因为单一核苷酸改变，对除草剂的有效成分i m i d a z o l i n o n e 不具反应，所以提高 了抗性。1 9 8 8 年，此项成果申请了国际专利”“。1 9 8 6 年，j o h na g r e a v e s 等人( 英国i c l 种子 公司) 用e m s 石蜡油溶液处理优良玉米自交系的成熟花粉4 0 分钟，在m 2 代用除草剂进行筛选， 获得9 株抗除草剂普杀特( p u r s u i t ) 突变体，其抗除草剂的显性基因i t ( 1 m a z e t h a p y r t o l e r a n t ) ， 已申请专利保护。i c l 种子公司于1 9 9 1 年首次推出含抗除草剂基因i t 的玉米杂交种，市场反应 良好”“。1 9 8 7 年，j o h n a g - r e a v e s 等人( 英国i c l 种子公司) 又用此方法获得3 个糯质突变体， 3 个甜质突变体，突变率均为0 2 ”。1 9 9 1 年张铭堂博士利用e m s 处理1 2 个优良自交系玉米花 粉，发现糯质基因( w x ) 的诱变频率为0 2 左右。1 9 9 2 年a l l e nw r i g h t 博士( 依阿华大学) 用e m s 处理b 7 3 自交系的花粉，从m ，后代中选出l o 个高赖氨酸、8 个高蛋白、7 t - 高油、4 个高皿油酸、 3 个高油酸和9 个低棕榈酸突变体。v i c t o rr o b o y 博士( 蒙坦拿大学) 从e m s 处理后代中选出两个 高油突变体。”。n e u f f e r 等( 美国密苏里大学) 采用e m s 花粉处理方法，获得大量突变体，仅 经过仔细研究并进行基因定位的就达7 6 0 个之多。7 “”。薛守旺等( 1 9 9 6 ) 进行t e m s ，石 蜡油诱变玉米成熟花粉的研究。结果得到中自0 1 浅黄粒突变体、母株发芽突变体、多黄2 2 显 性核不育突变体和近等基因系s t l l s u l 型甜玉米1 。赵永亮等( 1 9 9 9 ) 用含有e m s 和n g 的石蜡 油处理玉米自交系黄早四 h 7 9 2 2 的花粉，结合m 2 代突变基因的等位性检测，快速创造特用玉 米自交系。发现不同基因在突变率上存在显著差异。其中甜玉米基因s o 。和糯玉米基因w x 的化 学突变率至少是自然突变率的1 0 0 。1 0 0 0 倍“。 1 2 3 玉米化学诱变育种的方法 1 2 3 1 诱变材料的选择 诱变材料的遗传背景( 基因型) 对诱变效果有重要影响，基因型差异可影响突变率和突 变谱。在实际应用中可根据不同的实验目的，选取不同的材料。选用杂合材料有利于增加重 4 西南大学硕士学位论文 文献综述 组率，提高诱变效率，创造新种质。选用优良品种或自交系，通过诱变改变某一基因位点， 可迅速培育出有应用价值的特用品种或自交系”“。 1 2 32 化学诱变剂及其类型 化学诱变剂的种类很多，按其诱变机制的不同，可将其分为三类：( 1 ) 碱基类似物诱变 剂，如5 溴尿啼啶( 5 - b u ) 、2 - 氨基嘌呤( a p ) 等；( 2 ) 直接诱变d n a 结构的诱变剂，如烷 化剂、距硝酸等：( 3 ) 诱发移码突变的诱变剂，如抗生素等。在玉米育种中应用较多的只有 甲基磺酸乙酯( e m s ) 、叠氮化钠( n a n 3 ) 和平阳霉素( p y m ) 1 s l i s 现将这几个诱变剂的 诱变特点介绍如下： ( 1 ) 甲基磺酸乙酯( e m s ) e m s 是一种良好的化学诱变剂。实践表明，目前已成为玉米育种中应用最广泛、使用效 果最好的化学诱变剂“。e m s 的烷化作用主要发生在鸟嘌呤g 的n 7 位上，烷基取代 氢离子后，使之成为一个带正电荷的季铵基团，从而产生两个遗传效应：一是促使第一位氨 基上的氢的解离，使鸟嘌呤g 不再与胞嘧啶c 配对而与胸腺嘧啶t 配对，而发生g ：c a ：t 转换的突变；二是由于鸟嘌呤g 的n - 7 烷基活化，减弱了n 9 位上的n 糖苷键，产生了去瞟 呤作用。在进一步复制时，原来的鸟嘌呤g 的位置就成了个空位，其互补位置上的碱基就 不受严格的配对限制，四种碱基都有机会进入，从而造成转换、颠换现象。此外，还可与核 苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核营酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失“”“”。 e m s 诱变其有频率高、范围广、效率高的特点。b i r d ( 1 9 8 3 ) 报道用e m s 处理玉米花粉， 突变频率可高达7 8 ，并且e m s 诱变产生的显性突变体相对较多。易于进行突变体筛选”。 e m s 可以产生范围较广的突变体类型，同时染色体畸变相对较少，生理损伤小。因而可被用 来对玉米的某一特殊性状进行改良，并且容易出现高产、优质的突变体1 。 ( 2 ) 叠氮化钠( n a n 3 ) n a n ，是一种点突变剂，它的作用方式是碱基替换，当p h = 3 0 时，n a n 3 溶液中主要产生 h n 3 分子，它呈中性，易透过细胞膜进入细胞内，以碱基替换方式影响d n a 的正常合成，从 而导致点突变的产生。1 。n a n ，只作用于复制中的d n a ，所以应当把种子预浸到种胚中d n a 第一次合成开始时，立即用n a n 3 溶液处理。 n a n ，具有高效、无毒、价格便宜、使用安全等优点。 ( 3 ) 平阳霉素( e v m ) 平阳霉素( p y m ) 是一种抗生素，是博莱霉素的a 5 组分。它具有高度选择性，能抑制细胞 的生长，对维持生命有重要意义的结构的特殊部位起作用5 “。 p y m 在许多实验中均被证明为具有安全、高效、诱变频率高、范围火等特点”。“1 。它与 e m s 相比，它们的诱变特点相近，但它在某些方面优于e m s ，具有很好的开发和应用前景。 12 3 3 处理方法 5 西南大学硕士学位论文 文献综述 ( 1 ) 种子处理 直接把干燥种子放入诱变剂中浸泡一段时间，是目前育种中常用的方法，但处理玉米种 子的诱变效率很低”4 “。其原因在于：一方面，成熟的玉米籽粒胚中具有分开的、已定型的 雄花和雌穗原基细胞，在突变发生过程中容易产生细胞间的竞争，使突变细胞受到抑制和消 亡，被排除在生殖过程之外；另一方面，处理种子产生的显性突变到m 2 代、隐性突变到m ， 代才能观察到，得到稳定突变体所需的时间长，并且容易出现嵌合体“。 ( 2 ) 花粉处理 玉米是雌雄异花植物，雄穗较大，花粉量多。对玉米花粉进行一次较小规模的处理，即 可获得大量的处理个体。其中e m s 石蜡油花粉处理方法是：把e m s 与轻质石蜡油混合，配 制成一定浓度的悬浮液，并收集新鲜的玉米花粉，然后把花粉与悬浮液在一个有盖的瓶中混 合，一定时间后，用柔软的毛刷将花粉涂于新鲜的花丝上进行授粉“”。实践证明，用含有化 学药剂的石蜡油处理玉米花粉是目前已知的最有效的方法“2 ”。“”。 ( 3 ) 其它器官或组织处理 我们还可以通过幼苗根伤口和植株叶片接触吸收诱变剂，对植株茎或雄穗分枝注射诱变 剂，用棉纱包住即将抽雄的雄穗在诱变剂中浸泡等方法来进行化学诱变。 1 2 3 4 突变体的筛选和鉴定 在目前诱变育种实际工作中，如何以简单有效的手段筛选出优良的突变体，是提高诱变 育种效率的关键。形态鉴定是最常用的方法，也是育种实际工作中最直观、最简便易行和最 具说服力的鉴定方法。在形态鉴定的基础上，可进行遗传学鉴定，以确定突变体的遗传特性 及其在育种上的利用价值。生化标记鉴定是指通过分析蛋白质和同工酶来鉴定突变体，在大 豆”1 。、高粱“、玉米“”上都有应用过氧化物酶和酯酶同工酶进行突变体检测的报道，而利用 蛋向质电泳技术鉴别突变体的研究还未见报道。近年发展起来的d n a 分子标记鉴定技术，不 但能鉴定出肉眼无法鉴别的突变，而且使对突变性状的遗传研究和定位更加方便、有效。现 已开始应用于水稻”、大麦”1 、绿豆等作物突变体的筛选鉴定中。但是由于分析费用昂贵 和对一些重要农艺性状的分子遗传学知识掌握较少，该方法目前在实际育种工作中还未被广 泛采用。 1 3 分子标记在玉米育种中的应用 广义的分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 是指可遗传的并可检测的d n a 序列或蛋白质，包括 d n a 分子标记和蛋白质标记。因此，蛋白质标记中所包括的种子贮藏蛋白、同t 酶及等位酶 标记也属于分子标记。但是狭义的分子标记只是指d n a 分子标记，本文中也将分子标记限定 在d n a 分子标记范畴。 d n a 分子标记是2 0 世纪8 0 年代随着分子牛物学的发展而开发的一类以d n a 多态性为 6 基础的遗传标记。与传统的形态学标记、细胞学标记和同工酶标记相比较，d n a 分子标记具 有许多独特的优点：( 1 ) 直接以d n a 的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均 可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；( 2 ) 数量极多，遍布整个基因组， 可检测座位几乎无限； ( 3 ) 多态性高，自然界存在许多等位变异，不需要人为创造特殊的遗 传材料； ( 4 ) 表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；( 5 ) 许 多标记在遗传状态上表现为共显性和共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完 整的遗传信息“。 1 3 1 玉米育种中利用的分子标记的类型及特点 目前，在玉米育种中应用较多的分子标记主要有以下几种： ( 1 ) 限制性片段长度多态性标记( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称r f l p 标记) r f l p 标记技术由g r o d z i c k e r 等于1 9 7 4 年创立。其基本原理是：利用特定的限制性内切 酶识别并切割不同生物个体的基因组d n a ，得到许多大小不等的d n a 片段，所产生的d n a 数目和各个片段的长度反映了d n a 分子上不同酶切位点的分布情况。这种差异主要是由丁 d n a 分子中限制性内切酶酶切位点或位点间单个碱基的替换，d n a 片段的插入、缺失、易位、 倒位等引起的。将限制性片段用琼脂糖凝胶电泳分离，把凝胶中的d n a 转移到硝酸纤维素滤 膜或尼龙膜上再经放射性同位素或非放射性物质标记的探针进行杂交，通过放射白显影后即 可在x 光胶片上观察到反映个体特异性的遗传谱带。该分子标记具有如下特点：一、r f l p 普 遍存在，数量几乎是无限的；二、无表型效应，绝大多数r f l p 为中性遗传标记，不受发育阶 段及器官特异性限制：三、表现为共显性，可区分纯合子和杂合子；四、结果稳定、可靠； 五、d n a 需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。 ( 2 ) 随机扩增多态性d n a 标记( r a n d o ma m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s md n a ，简称r a p d 标记) r a p d 标记是由w i l l i a m s 和w e l s h ( 1 9 9 0 ) 首先提出的一种以p c r 为基础的多态性检测 方法。r a p d 标记技术就是用一个( 有时用两个) 随机引物( 一般8 1 0 个碱基) 非定点地扩 增基因组d n a ，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组d n a 如果在特定引物结 合区域发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的 变化，导致p c r 产物增加、缺少或发生分子量变化。若p c r 产物增加或缺少，则产生r a p d 标记。该标记与r f l p 标记相比，其优点是不依赖于种属特异性和基因组的结构、不需要使用 同位素、d n a 用量小、实验过程和实验设备要求较简单。但它也存在一些不足之处，如容易 受反应条件影响，重复性较差，而且每个标记提供的信息量较小。 ( 3 ) 扩增片段长度多态性标记( a m p l i f i e df r a g m e n t g l l lp o l y m o r p h i s m 。简称a f l p 标 记) 7 西南大学硕士学位论文文献综述 a f l p 标记是1 9 9 3 年由荷兰科学家z a b e a n 和v o s 发展起来的。它选择性扩增基因组d n a 酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性， 只不过这种多态性是以扩增片段的跃度不同而被检测出来。该标记结合了r f l p 的稳定性和 p c r 技术的简便高效性，同时又能克服r f l p 带型少、信息量少以及r a p d 技术不稳定的缺 点。a f l p 标记的主耍特点有：一、由于a f l p 分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种 类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目无限多；二、典型的a f l p 分析，每次反应产物 的谱带在5 0 1 0 0 条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；三、表现 为共显性，呈典型孟德尔式遗传；四、分辨率高，结果可靠；五、目前该技术受专利保护， 用于分析的试剂盒昂