（化学工艺专业论文）牛血清白蛋白在两水相体系中分配特性的研究.pdf

abs t r act a b s t ra c t c h ar 朗 t e ri stics of the a q u e o us 。 刀 0 一 b as eandits e x tr a c l i o np n n c i p lew e re 访 t ro d u c e d . a代 v l e ww a s g l v e n oni n fl u e n c e fa c t o r o f m ol ec ul es ，p a rt i t i 。 氏es pec i ai ly 。 n面me s t i candi n t e ma t l o n a l researc h . b ovine s e n 刀 刀al b 刊 m lnw hi ch l l asw i d e app l ic ati。 氏m a tu 代re se ar c 玩e x c el e n t 址歌s t abili ty胡dac q u l reeasil yw a s s tu d i edasre s e 别 rc hm at e ri a l b y 卿l e w i n gits p arti l i on p r o pe 对 i e sin p e g / d e x t 拢 田sy s t e m， p e g-qh ， o h-(n践h s 0 4c o m b i n e d 。 r g 别 山 c so l v e n t s y s t e mand p e g ide x 一 o l l . a c sy s t e m . t b e p ha 此di a gr 田 ” 叭 七 i c h fo rme d byfo urmol e c u 】 arwei ght ofpegan d dex t 住 口 are s tu d l ed， atthe s a l l l e l 而e ， t b e1n fl u e n c e ofmo1 e c u 1 arwei ght ofp e qp h ase com pes i t i o nsc o n c e n t r at 1 on， n e u t r al刘t s pec l esand c o n ce n t r at i呱 州 val姗， “ g hac sol v e n t ands u ri 勿 c ta ni on the p arti t 1 on p ro pert i es of b s aw a si n v e stig at ed in p e g / d e x t r a n 叫u coust w o 一 p ha 阴sys t e m . it w a 名 s h o 协 叭 t h a t the p arti t i oncoe 伍 ci ent of b s a、 a s t h e 】 e a 就 w h e n th e sys l e misp e g 60009 % . dex t . 口1 0 %袱thph val昭 胡d n acl conce n t r a t i o n we比7. o and o. z mol/l(p h o s p h a l e con c e n t r at i onw a s o. 01m 0 f l ) ， 助d the v a l 朋w a s o. oll6. t 七 i s c o n d i tion was the best o per a t i oncoo d i t in n. t 五 ein fl uenc eof c z h ， o hconc e n t ra t i 叽 mol ec ul arw e i ght of p e q n acl concen tr a t l onand phval昭on t he p artiti on p r o pert l e sof b s a in p e g 一 c z h s o h 一 伽比) z s o4 com b l n e do rg hac so】 v e n t a q u e o ustwo- p h 嫂 sys t e m、 甲 a s i n v e st i g a t e d . li was s h o wn t h a t p artl t i on晰 ffi ci e n tsofb s ab asr e d uc e d obse rv a b 1 y 助dp a rt iti on of b s a wasm 峨 stead yin thissy s t e m com p a re w l t hin p e g / (nh4万 5 氏 s y s t e m . dex 一 o l l 户 a c ， d e x 习l l 一 m e eare 幻 胃 o modi fi edp r 叼u c t i o nsbytwo st ra t e gi es g a n i n g l l a c t i c ac i d o l l g o m e r s ( o l l )tod e x t . 口 . d r a 初n g the p h as e d i 叫 梦 aj 盯of p e g 6000心ex一 o l l . a c s y s t e m . itwas s h o wn t ha t 面s p 抽 阴di a gr 别 叮ac cords w lth the rule ofp h ase fo n 刀 at l onofpol y m e r/ 即l y m e r a q u e ous 幻 胃 0 一 p h ase sy st eln nhas 】 。 w e r se p ar a t i o n conce n t r a t i o n c o m p a n n g w i t h p e g /dexsy s t e m . u s ing p eg6 00o /dex一 o l l . a c s y s t e mw h 1 c h has be e n c h o sen top axtb s a . it was s h o 叭 . th atp artit i o n coe ffici e ntofb s abecamesmallerw h e nm ol ec ul arwei ght andcon c e n t r a t e 1 on of abs i ract p e gbe c o m e 1 a r g e r. u n d erth e i n fl uenc e o f p hvalu e s ， p arti t i o n co e ffi c i ent was the l e a s t att heequi p ote爪 ia l p oi nt( p l = 7 0 ) p arii ti on伪e 币ci e n 之 。 f b s ah a s 茂 d uced obv l o u s l yi nthis s y stemc o mp硕ng w i t hp e g /de x i n fl ue皿e foc t 0 l w卜 e ns t u d i e din e 朗h k e y wd r d s : a q u e o us。 刃 0 . p h 韶 e s y s l e m ; b s a ; p a rt iti o n c o e ffic i ent; l a c t i c 解i d o l i gom ers; 邵 a ft m o d i fi c ation 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的 学位论文是本人在导师指导下进行的 研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加 以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其 他 人已 经 发 表 或 撰写 过的 研 究 成 果， 也 不 包 含 为 获 得 南昌大学 或 其 他 教 育 机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同 工作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 一封 诱 、 签 字 日 期 : 、 护 叼 年如 邢 确 学位论文版权使用授权书 本 学 位论 文 作 者 完 全了 解南昌大李有 关 保留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 ， 有权保留并向国家 有关部门 或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和 借阅 。 本 人 授 权南昌大学可以 将 学 位论 文 的 全 部 或 部分 内 容 编 入 有 关 数 据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 签 字 日 期 : 沙 叮 年 郑 确 石 月乃日 导 师 签 名 :物 添 签 字 陇种 年 乙 够 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编 第 1 章 引言 第 1 章 引言 1 . 1前言 液一 液萃取技术是化学工业中 普遍采用的 分离技术之一， 在生物化工中也有 广泛的应用。 然而， 使用传统的 有机溶剂萃取往往使生物活性物质变性，而且 在水一 有机溶剂系统中生物颗粒和大分子几乎是完全分布于水相而无法分离. 此 外， 传统水一 有机溶剂系统的液一 液界面有较大的界面张力，易使脆弱的生物物 质的活性结构遭到破坏. 近年 来出 现的 两 水 相 萃 取 技术 ( a q u e o ustwo 一ase e x tia c tion ， 简 称户 j p s )， 又 称为 水溶 液两相分 配技 术(p artlt l onoftwo aq ueoussy stem ) 是 基于 液 一 液萃取理 论并考虑保持生物活性而开发的一种新型液一 液萃取分离技术，该技术在生物化 工分离领域有极好的应用前景。与传统的有机溶剂萃取相比，两水相萃取技术 具有分离条件温和、易操作、可调节因素多以及可借助传统溶剂萃取的成功经 验等优点，被认为是生物下游工程中一种具有广阔应用前景的分离技术。在蛋 白 质、核酸、氨基酸、多肤、细胞器等产品的分离和纯化中已表现出其特有的 魅力 1-31。 1 . 2两水相体系介绍 两水相体系是指某些聚合物之间或聚合物与无机盐之间，在水中以适当的 浓度溶解后，所形成的互不相溶的两相或多相的水相体系.根据溶液理论，当 两种或多种聚合物和水溶液相互混合时，分相过程主要由混合时嫡变以及分子 间的 相互作用力所决定。 两种物质混合时嫡的增加与所涉及的分子数有关，因 此如以摩尔计算，小分子间与大分子间的混合， 墒的增加是相同的。 分子间的 作用力应为分子中各基团间 相互作用之和， 分子越大， 作用力也 越大。 这种解 释基于过去所研究的只是聚合物/ 聚合物两水相体系而言，存在着一定的合理 性， 但是对于近几年开发 研究的 聚合物/ 盐，普通有机物/ 盐， 表面活性剂/ 表面 活性剂等两水相体系现象的 解释就显得无能为力封 . 。 常见的聚合物/ 聚合物两水相体系如表1 . 1 所示。 第1 章 引言 表1 . 1几类常见的聚合物/ 聚合物两水相体系 聚合物一 聚合物 一 水 高分子电解质一 聚合物一 水 高分子聚合物- 高分子电解质 聚丙烯乙二醇- 甲 氧基聚乙二醇 聚乙二醇- 聚乙烯醇 聚乙二醇一 葡聚糖 硫酸葡聚糖钠盐- 聚丙烯 硫酸葡聚糖钠盐- 乙二醇 梭甲基葡聚糖钠盐- 甲基纤维素 硫酸葡聚糖钠盐- 梭甲 基纤维素钠盐 硫酸葡聚糖钠盐- 梭甲基葡聚糖钠盐 聚合物一 低分子量聚合一 水 聚丙烯乙二醇- 磷酸钾 甲 氧基聚乙 二醇- 磷酸钾 聚乙二醇一 磷酸钾 聚丙烯乙二醇- 葡萄糖 由聚合物和无机盐所构成两水相体系，目前研究最多的是p e g / 硫酸盐或 p e g / 磷酸盐体系。常见的聚合物/ 盐两水相体系见表1 . 2 。该类体系的成相机理 还不十分清楚，一般认为是盐析作用的结果。 表12几类常见的聚合物/ 盐两水相体系 聚合物 聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇 聚丙二醇 葡聚糖或经丙基葡聚糖 甲基纤维素或聚乙烯醇 硫酸钱、 硫酸镁、硫酸钠 磷酸钾、磷酸二氢钾 甲酸钠 酒石酸钾钠 对于普通有机物/ 盐两水相体系， 被认为是盐溶液与有机溶剂争夺水分子形 成缔合水合物的结果。 对于表面活性剂/ 表面活性剂两水相体系， 以 bla nkstein 等为代表的学者认为 是由于表面活性剂混合溶液中不同结构和组成的胶束平衡共存的结果。 1 . 3两水相技术的特点 两水相萃取技术成为新兴生物技术产业研究的热点主要是该技术对于生 第 1 章 引言 物物质的 分离 和 纯化表 现出 特有的 优点 和独有的 技术 优势队幻 : 易于放大。 albe rtss on侧证明 分配系数仅与分离体积有关， 这是其它过程 无法比拟的，这一点对于工业应用尤为有利; 相间传质和平衡过程速度快，过程能耗较小，回收效率高; 易于连续化操作，设备简单，并且可直接与后续提纯工序相连接，无需 进行特殊处理。例如可以 采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作; 相间张力低， 相分离条件温和，因而会保持绝大部分生物分子的活性， 使生物分子如酶等不易受到破坏; 分配过程因素较多，可以 采取多 种手段来提高分配选择性或过程收率; 操作条件温和， 一般在常温常压下进行: 不使用有机溶剂，高 聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体无 害，对环境无污染。 1 . 4两水相萃取原理 1 . 4 . 1分配系数 两水相萃取与水一 有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性 分配，不同之处是萃取体系的性质差异。当生物物质进入两水相体系后，由于 表面性质、电荷作用和各种力( 如僧水键、氢键和离子键等) 的存在和环境的影 响，使其在上、下相中的浓度不同。分配系数k 即为两相中生物物质的浓度比， 两水相萃取技术就是通过被分配物质在相间分配系数的差异来进行萃取的。生 物物质在两水相体系中的选择性分配， 服从n e m s t 分配定律。即:分配系数k ( 1 . 1 ) 其中， c t 、 c b 分别代表上、下相中 溶质的浓度. 当 相系统固定时， k 为常数， 与溶质浓度无关， 只取决于生物物质本身的 性 质和特定的两水相体系的性质。例如各类细胞粒子、噬菌体等的分配系数都大 于10 0 或小于0. 01，酶、蛋白 质等生物物质的分配系数大约在0 .0 1 10之间，而 小分子盐的分配系数在1 .0 左右。所以 两水相体系对生物物质的分配有着很大的 选择性叫。 第1 章 引言 1 . 4 . 2相图 两水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1 . 1 是典型的两水相体系的 直角坐标相图，两种成相物以 适当比例溶于水就会分别形成不同组成和密度的 两相， 上相组成用t 点表示， 下相组成用b 点表示。 c 点为临界点， m点为加料点。 曲 线t c b 称为结线，直线t m b 称为系线。结线上方是两相区，下方为一相区。 所以 组成在系线上的点分为两相后，其上、下相组成分别为t 和b ，由 式 (l. 1) 可知， 均具有共同的分配系数。上、下相质量的关系则符合杠杆定律。即: ( 1 . 2 ) ( 1 . 3 ) 其中， mt、 m b 一上、下相的 质量; v t 、 v b 一上、下相的体积; 五 石 j 五 ; 一b 点与 m 点、 m 点与 t 点 之间的 距离; r 一 湘 比。 因 两 相 的 密 度 与 水 相 近( 常 在l 0 00 k g zm 3 一 1 10 o k g/ m 3 之 间 ) ， 故 两 相的 体 积 基本符合杠杆定律。系线的长度可以衡量两相的相对差别。系线越长，两相组 成的差别越大;反之则越小。当系线长度趋于零，即位于临界点c 时，两相差别 消失，体系为均一相。 (界山娜孚涟 成相物a( %) 图1 . 1两水相体系的相图 第 1 章 引言 1 . 4 . 3两水相中的分配平衡 从两水相萃取过程设计的角度出发，确定影响溶质分配系数的主要因素非 常重要。研究表明，分配系数取决于溶质与两水相体系间的相互作用，其中主 要的有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作 用 的 和 ls 。 l nk = 乙 ” 犬 + l n k 扁 + l nk:( 1 . 4 ) 其中， 凡， 凡和ki分别为静电 作用， 疏水作用和亲和作用对溶质分配系数 的贡献。 (l ) 静电 作用 非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡热力学理论 可推导下述分配系数表达式: l n k 二一 ( 1 . 5 ) r = 耘 一 耘 其中，k 一非电解质型溶质的分配系数; m ee溶质的相对分子量; r 一 气体常数， j i 伽0 1 k); 手 一 绝对温度，k : 丫 一 溶质在上、 下两相表面自由 能的 差， j 加0 1 ; 耘一聚 合 物 与 上 相 间 的 表 面 张 力 ; r * 一 聚 合 物 与 下 相 间 的 表 面 张 力 。 因此，在温度变化不太大，溶质在上、下两相表面自由能的差一定时，溶 质的分配系数的对数与相对分子量之间呈线性关系。在同一个两水相体系中， 若幻0，不同 溶质的分配系数随相对分子量的增大而减小。因为 勿随两水相的 构成系统不同而不同，同一溶质的分配系数随两水相体系的不同 而改变。 实际应用过程中，两水相体系中 通常含有缓冲液和无机盐等电 解质，其阴、 阳离子在两相间 存在不对称分配，从而在两相间 产生电 位差，通称为道南电 位 ( don n aj l pot e ni i al ) 。 中= 一响 丝 二 一ln竺( 1 . 6 ) (z十 一 2 一 )f 5 k+ 第 1 章 引言 此时， 荷电溶质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推 导溶质的分配系数表达式为: 不 艺 ln 人 =乙 月 入。 十， ， 二乙公 r了 ， ( 1 . 7 ) 上述两式中， k + 、 k . 一电 解质的阳离子、阴离子的分配系数; 2+、 2 .一电 解质的阳 离子、阴离子的电 荷数; 甲 一相间电 位: k o 一溶 质净电 荷为 零 ( p h = 等电 点) 时的 分配系数: f 一法拉第常数; 2 一溶质的净电荷数。 显然，式 (l. 5) 是式 (l. 7) 的一种特殊情况 ( 吞0)。 因此，荷电溶质分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比。由于同一两水 相体系中所添加的盐不同，产生的相间电位也不同。故荷电溶质分配系数与静 电荷数的关系因无机盐而异。 (2 ) 疏水作用 某些疏水性物质 ( 如蛋白 质) 在其表面均存在疏水区，疏水区占总面积的 比 例越大， 疏 水性就 越强。当 体系 p h 控制为 蛋白 质等电 点时， 蛋白 质的 分配 过 程主要取决于其表面与两相溶液的疏水作用过程。 上、下相间的 疏水性差一般用疏水性因子hf ( hydrop hpb icfe c t o r ) 表示. hf可通过测定疏水性己 知的氨 基酸在其等电 点处的分配系数kaa测算 l 月 k 翻 = 月 尸 ( 左 万+ b )( 1 . 8 ) 其中， rh为 氨基酸的 相 对疏水 性 ( re lativehyd ro p hobi c ity) ， 是 通过测定 氮 基酸在水和乙醇中 溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的 甘氨酸的 r h 二 0 侧。 所以，上式中的b 为: b=( 1 . 9 ) 其中 所以 肠卜 为 甘 氨 酸 的 分 配 系 数。 p h =p1 时 氨基 酸 在两 水 相体 系中 的 分 配系 数与 其 rh值 呈 线性 关系， 直线的斜率就是该两水相体系的h f 值。 第 1 章 引言 两水相体系的疏水性差iif与成相聚合物的种类、相对分子量、浓度，添加 盐的 种类、 浓度以 及 ph值有关， 一般随聚 合 物的 相对分子质量、 浓度以 及盐析 盐 浓度的 增大 而 增大. 有 研究表明， peg /d e x tr a n 和p e g/磷酸 钾 ( k p i ) 系 统的 h f 值与上、下相中p e g 的浓度差成正比。p e g / d e x t . 口 系统的hf约为0. 0 05 0. 02mo仍 j ， 而p e g /kp i 系统约为 0 . 1 0. 4 m o 】/k j . 利用式 (l. 8 ) 可 确定 不同 两水相体系的 hf值， 如果 在 ph为 等电 点的 两水 相中蛋白 质的 分配系数 ( ko)与 h f 值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该 蛋白 质的 表 面 疏 水 性， 用 hfs( hy drop h o b ic factorofso l utes)表示 旧 : 尤 ” 尤 云 = 月 f x l 资 石 万( 1 . 1 0 ) 由 研究结果可知， 蛋白 质的表面疏水性iifs 随所添加的 n a c i 浓度的增大而增 大。 将盐对蛋白 质疏水性的影响引入式1 . 10，则 l n k =月 子 ，( 月 召 夕 + 配护 万 ) ( 1 . 1 1 ) 其中，八 h f s 为盐浓度增加引起的h f s 值增量。 因此式1 . 7 可表示为下述的一般形式: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 、 矛 2 l n 入=月 户( 月户 各+八 月 户 百 ) + 二 : 二 。 尹 尤 1( 1 . 1 2 ) 式 (l. 1 2 )较全面地描述了两水相体系的疏水性和相间电位、蛋白质的疏 水性和净电荷对分配系数的影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和 相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用. 1 . 5影响物质分配的因素 影响物质在两水相体系中分配的因素很多，主要包括: (l) 聚合物分子量对分 配的影响 同 一聚合物的 疏水性随 分子量的增加而增加门 。当 聚合物的 分子量降 低时， 生物大分子溶质易分配于富含该聚合物的相。如p e g z d e x t ra n 系统的上相富含 p e g ， 下相富含dex t r a n ， p e g 的分子量减小或d e x t r a n 的分子量增大都会使分配系 数变大， 相反p e g 的分子量增大或dex l r a n 的分子量减小会使分配系数变小。 这一 规律适用于任何成相聚合物系统和生物大分子溶质，具 有普遍意义tl8)。 (2 ) 聚合物的浓度一界面张力对分配的影响 在两水相系统中，界面张力较低，且随系线长度呈指数规律的增加。当系 第 1 章 引言 统组成处于临界点时( 系线长度为 0)，界面张力为0 ，分配系数等于1 。当系线长 度增加时，两相性质差异增大，两相间的界面张力也增大，溶质分子趋于单 侧 分配。当系线长度增加时，系统的表面张力增大，通常会导致溶质在界面上的 吸附。 (3 ) 添加剂对分配的影响 添加中 性盐 对分配的影响 盐的种类和浓度对溶质分配系数的影响主要表现在对相间电 位和疏水性的 影响上.两水相体系中，无机离子具有各自 的分配系数。不同电解质的正负离 子的分配系数不同。当两水相体系中含有这些电解质时，为保持两相的电中性， 从而产生不同的相间电 位 式 (l. 6) 1 。因此，盐的种类 ( 离子组成)将影响分 配系数 式 ( 1 . 7 ) 。 不同盐的盐析效果不同，因此，盐的种类和浓度 ( 离子强度)影响溶质如 蛋白质的表面疏水性增量 h f s ， 从而影响蛋白质的分配系数 式(1. 1 1 ) 。 当盐 浓度高于某一数值时，由于强烈的盐析作用，蛋白 质的溶解度达到极限，使分 配系数增大，因此分配系数与蛋白质浓度有关。 盐浓度不仅影响溶质的表面疏水性，而且扰乱两水相体系，改变各相中成 相物 质的 组 成 和 相体 积比 。 例 如， p e g / 磷酸 钾( k p i)系 统中 上、 下相 组成 随 n a cl 浓度的 增大而 改 变洲。同 时， 随 着n acl 浓 度的 增加， 物质 分配 系数也受很 大影响。这主要是盐的添加对被分配物质的疏水性产生重要影响。 添加有机溶剂对分配的影响 两水相体系中的一部分水可被有机共溶剂取代，使两相间疏水性能发生变 化， 界面张力以 及电 位差也随之改变侧， 从而进一步影响蛋白 质等溶质的分配。 另一方面，有机溶剂可直接作用于蛋白质分子，通过剥离蛋白质分子表面的结 合水改变蛋白质分子表面的水化层，即改变氢键和疏水作用，从而影响蛋白 质 的分配。通常认为，有机共溶剂对溶质分配行为的影响主要是由于有机溶剂和 成相聚合 物相互作用的结果2l。 如 在p e 以000 / d e x l 住 口 4 0 000 的 体系中 分别加入相 同量 (2%) 的乙醇、甲 醇、丙酮，发现b s a 的 分配系数均与未加前有显著的降 低，且加入乙醇后分配系数达最小。 添加表面活性剂对分配的影响 表面活性剂的加入可以调节界面张力以及上、下相组成，从而影响溶质的 分配。同时表面 活性剂的增溶作用还可用于水不溶性蛋白 质的 分离洲。 第1 章 引 言 b o d h 歇 止 ar 和g a ik ar 等咖研究了四类表面活性剂 ( 即阳离子表面活性剂、阴 离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂)在p e g / d e x tr a n 体系中 对溶质分配的影响。实验表明，表面活性剂是通过改变界面张力，上、下相组 成等两相特性来影响溶质分配的。又如bl al lk sc h t e in 等人主要以 ci西 ( 十烷基四 聚氧乙 烯醇) 这种非离子表面活性剂为对象，研究了两水相对不同性质或不同结 构的生物 物质的 分离 作用 ( 如 各种蛋白 质、 酶、 细胞、 噬菌体、 病毒等) 圈。 发现亲水性蛋白 质易被分配到两水相的下相，且蛋白质分子量越大，分配效果 越好闭 .同时 还发现在 分配亲油性蛋白 时 表面活性剂两水相系统比 高聚 物两水 相系统好，高聚物两水相则易于分配亲水性蛋白。 (4)p h 值 对 分 配的 影响 不同 ph值下 可离解 溶质的 离 解度不同， 故调节 p h 可改 变溶 质的 表面电 荷数 阁 ， 从 而 改 变 分 配 系 数 式(l . 7 ) 。 对 某 些 溶 质， ph的 很 小 变 化 也 会 使 分 配 系 数 改 变 2 一 3 个 数 量 级 陈 幻 。 根据式 (l. 7)， 在 相间电 位为零的 两水 相中， 溶质的 分配系 数不受 ph值的 影响， 但对 于很多 溶质， 当 相间电 位为 零时 分配系 数【 即 式(1. 5) 中的 与 随 p h 值的变化有所增减。 (5 ) 温度对分配的影响 温度的变化影响体系物理性质的变化，如粘度和密度等，从而影响溶质的 分配。但总的来说，温度对分配系数的影响是通过对相图的影响来间接达到的 吻 (6 ) 外加电场对分配的影响 当在两相分界的垂直方向上加上电场时，由于电位差增加而使分配系数发 生改变。如用p e g 800 0 / d e x t r ant- s oo体系分离肌红蛋白，在外加48. i v l c m的电场 强度4 肠 m i n 后，分配系数k 从0. 81变为 38.7 ， 上相回收率从44.7 % 增加到98.0 % 细 。 1 . 6两水相萃取操作 1 . 6 . 1体系的选择 利用两水相萃取技术分离提纯时，选择两水相体系的一般原则是 目 标产物在两相中有较大的分配系数; 可利用静置沉降或离心沉降法进行相分离: 第 1 章 引言 操作运行成本低，用价格相对便宜的两水相体系来萃取分离; 保持被分离 物质的生物活性。 影响生物分子分配系数的因素很多，给两水相体系的选择和设计带来一定 的困难，式( 1 . 12 ) 可有效地指导两水相萃取系统的设计。根据目 标产物和共存 杂质的表面疏水性，相对分子质量，等电点和表面电荷等性质上的差别，综合 利用静电作用、疏水作用和添加适当种类的盐和改变盐的浓度，可选择性萃取 目 标产物冻3 1 。 在上述理论和经验分析的基础上，可通过实验确定最佳两水相萃取系统。 1 6 . 2两水相萃取流程 两水相萃取流程包括以下几个步骤:两水相的形成、溶质在两水相中的分 配、两水相的分离。在实际操作中，经常将固体 ( 或浓缩)的聚合物和盐直接 加入到目 标产物中，同时进行机械搅拌使成相物质溶解形成两水相。再次，溶 质在两相中进行传质，最终达到分配平衡。由于常用的两水相体系的界面张力 很小 ( 例如，p e g/ 盐系统为0. 1 l m n 阳 m;peg / d e x t r a n 系统为1 、 1 0 -4 0 . l m n z c m) ， 相间混合所需能量很低， 通过机械搅拌很容易分散成微小液滴， 相 间比表面积极大，达到相平衡所需时间很短，一般只需几秒钟。所以，如果利 用固状聚合物和盐成相，则聚合物和盐的溶解多为萃取过程的速率控制步骤。 达到分配平衡后的两相分离可采用重力沉降 ( 静置分层)或离心沉降法， 沉降速率符合s t o kes 定律。 重力沉降 d z d 厂 ， =二 下 尸 -9 1 石 户 ( 1 . 1 3 ) 离心沉降 t ， _ d z 劫_ _ j 犷 二 r 口 1 8 户 ( 1 . 1 4 ) 其中， d 一分散相液滴直径; “ -连 续相薪 度; p 一 .相间密度差: 9 一 一 重力加速度; 第 1 章 引言 卜 离心半径; 于 离心角速度。 两水相体系的相间密度差很小。 例如， peg l d e x t 口 叮 两水相系统的密度差为 0.02 一 0. 0 7k 岁 m 3 ， p e g / kpi 两 水 相 系 统为 0. 04 一 。 . i k 酬 m 3 。 另 外 ， 处 理 某 些 薪 度 很 大的 溶质时， 尽管溶质的 存在致使两相密度差增大， 但薪度的 增大占主导地位， 即 p/p随 溶 质 浓 度的 增大 而 降 低， 这 给 沉降 分 离 带 来了 困 难。 由 于 两 水相 体系 的 界面张力很小，离心机内己 分离的两相很容易重新混合。研究结果表明， 存在 最佳的 处理 流 量q ， 使流出 液中 分散 相浓度最 小。 在 较低流速 下不能使两 相完 全 分离，说明离心机内 存在相间重新混合现象。一般情况下，重力沉降比 较困难， 所以 利用离心沉降可大大加快相分离速度，并易于连续化操作。 常用的离心沉降设备有管式离心机和碟片式离心机，其中用于两水相分离 的碟片式离心机下相出口半径可调。通过调整下相出口半径，可使两相在分界 面处完全分离。利用连续离心沉降法可使两相在数秒至数分钟的停留时间内得 到完全分离川 ，具体停留时间 根据萃取系统和离心机的能力而异。 例如，以下是p e g/盐或p e g z d e x tr an两水相体系萃取生物物质的工艺流程 网，见图1 . 3 。 第1 章 引言 匀浆液 4 pe g 十 盐 或 ” extran p e g 一 盐或p e g 一 d e x t 在 口系统 上相 ( p e g 、 杂蛋白) 下相 ( 产物) p e g 一 盐系统 上相 ( 产物) 下相 ( 细胞碎片、 杂蛋白、 核糖、 多 搪) 图13 peg / 盐或peg /dex l 口 盯两水相萃取原则流程图 翼目 的 产 物 的 萃 取 原料匀浆液与p e g 和无机盐或葡聚糖在萃取器中 混合，然后进入分离器分 相。 通过选择合适的两水相组成， 一般使目 标蛋白质分配到上相(pe g 相) ， 而细 胞碎片、核酸、多搪和杂蛋白等分配到下相( 富盐相) 。 第二步萃取是将目 标蛋白 质转入富盐相，方法是在上相中加入盐，形成新 的两水相体系， 从而将蛋白 质与 p e g 分离， 以 利于使用超滤或透析将p e g 回收利 用和目 的产物进一步加工处理。 ( 2 ) p e g 的循环 在大规模两水相萃取过程中， 成相材料的回收和循环使用，不仅可以 减少 废水处理的费用， 还可以 节 约化学试剂，降 低成本。 p e g 的回收有两种方法: 加入盐使目 标蛋白 质转入富盐相来回收 p e g: 将p e g 相通过离 子交换树脂， 用洗脱剂先洗去p e g ，再 洗出 蛋白 质。 (3 ) 无机盐的循环 第 1 章 引言 将含无机盐相冷却，结晶，然后用离心机分离收集.除此之外还有电渗析 法、膜分离法回收盐或除去p e g 相的盐。 工业上一般先用超滤等方法浓缩发酵液， 再用两水相萃取酶和蛋白质，这样 能提高对生物活性物质的萃取效率。最后，用层析等技术进一步纯化以得到产 品。 1 . 7国内外研究现状 1 9 5 5 年由 albe比 so n 首先利用两水相技术分离生物分子，他主要研究了p e g/ d e x t r an系 统 和p e g / (nh4h s 伍系统 在分离 提纯中 的 应用。 在随 后的 几十 年中， 这 项技术有了 长足的发展。在两水相的分离模型研究中，主 要提出了 两类模型 闯 ， e d m o n d 等人 提出 的 渗 透 维里 模型， 即 f 刁 m o nd 一 饨s ton方 程: f fo ry 和 h ug g ins 根据热力学的基本原理提出晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质 的分配上有较高的准确度， 后者在粒子的能量概念上可以很好地拟合实验数据。 自 20世纪80年代中期以 来，各国学者开展了 进一步的研究工作，各类用于计算 生物物质在两水相系统分配系数的模型也时有报道，诸如b as k ir 晶体吸附模型 因 、 h a y n e 模 型 、 pi tzer 模 型 阅 、 g r o s s 一 inan 自 由 体 积 模 型 等 ， 但 结 果 均 难以 令 人 满 意 ” ， 。 1 9 89 年， di amo nd和 h su 以 fl ory一 hug gi ns 理 论 为 基 础， 推导 出 生 物 分 子在有关两水相体系中的分配模型。 diaj 旧 o n d . h su模型既可计算聚合物/ 聚合物两 水相系统中 低分子质量肤的分配系统，又能计算高分子质量蛋白 质的分配系数， 有一定的普适性。此后，针对用该模型计算蛋白 质在聚合物/ 盐两水相系统中的 分配系数时精确度不高的缺点，di别 m o n d 等和梅乐和等侧相继提出了改进的 di 别 旧 o n d . h s u 模 型 圃， 进一 步 提高了 di amo n d 一 h su 模 型的 精 确 度 和 普 适 性。 近年来，两水相技术在动力学研究、两水相和分离、多级逆流层析、反应 分离祸合等方面都取得了显著的成绩。两水相技术已 经被广泛应用于生物大分 子物质的 分离纯化中， 在生物小分子的分离和生物无机化学等方面应用研究也 已 经展开.此外两水相技术还被应用于中草药有效成分的提取，免疫分析，生 物分子间相互作用力的测定以 及细胞数的测定方面都取得了显著的成绩。 到目 前为止，两水相技术几乎在所有的生物物质的分离提纯中得到应用。 如:氨基酸、多肤、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等，特别是成功 地应用在蛋白 质的大规模分离中141 一。 第1 章 引言 在生物物质的分离纯化中，所涉及的聚合物/ 聚合物体系是包括聚乙二醇 (p e g ) / 葡聚糖( d ext 脚) ，以及用变性淀粉、糊精、麦芽糖糊精和阿拉伯树胶等 廉价的有机物代替昂贵的dex t 住 叮 和用羚基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚乙 烯毗咯烷酮等代替p e g 所组成的类p e g / d e x t “ 口 体系，且对后两种类p e g / d e x t r an 两 水相体 系的 研究己 经 取得了 一 些成果44。 如 u fuk g u n d uz，konc a kor la m az 考察 t z o oc 下， 在 p e o 3 3 5 o ( 8 % w/ w ) - d e x t r a n 3 7 5 o o ( 6 % w 彻) 的两 水相中， p h 和n acl 浓 度 对 b s a 分配 的 影 响; 谭 天 伟 等词 用 p e g / 羚 丙 基 淀 粉( repp al p e s)两 水 相 体 系从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶 ( p g k )和磷酸甘油醛脱氢酶 ( g a p d h ) ， 收率 在80%以上。 萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液， 用离心萃取器完 成两水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的 特点 . m.c al meida 等 圈 用 p e g 瓜 e p p a l pes 两 水 相 体 系 萃 取角 质 酶， 收 率 最高 可 达78%。同时研究发现，这类类p e g / d e x t r a n 体系的相图与p e g / d ext r a n 体系的相 图非常相似，其稳定性也比 p e g / 盐体系好，并且具有蛋白质溶解度大，薪度小 等优点， 而且成本只有p e g / d e x t r an 体系的1 /8 。 对于聚 合物 / 盐两 水相体系的 研究也比 较完善。 如瑞典 alfa-l a v al 们 公司用 p e g 4000 (6.6 % )/ 磷 酸盐 ( 1 4 % ) 构成 的 两水相体系从 重组 大肠杆菌 碎片 中 提 取人生 长 激 素 ( h g h ) 进 行 萃 取 实 验， 总 收 率 可以 达 到 81 % ， 纯 化 系 数 为 8. 5 ; y a n g 训 等 人采 用不同 的 聚乙 二 醇 / 盐 体系， 通过改 变体系的 p h 值， 加入表面活 性剂、 水溶 性有机溶剂及中性盐来达到头抱霉素c 与脱乙酞基头抱霉素c 的有效分离; m o ni ca等圃利用p e g/磷酸盐两水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶，确 定最佳体系是2 2 % p e g 6 0 0 0 ， 1 0 % 从h p 0 4 和1 2 % n aci ， 活性酶的产率可达9 8 %。 c 叹one 等人采用p e g/磷酸盐体系， 发现n acl 对牛血 清白 蛋白 的 分配系数几乎没 有影响; g ul llen n opi co等人研究了 p e g 分子量以 及聚合度对两水相中蛋白 质分 配的 影响; 常秀 莲 等侧 人 采用 三种聚乙 二醇 / 盐 体系 研究成相浓 度、 起始b s a 总 浓度、 外加有 机溶剂 及外加盐 对b s a 分配特性的 影响:胡 松青等浏人以 b s a 在 p e g 6000/ 磷酸盐两水相系统两相间的分配系数及其下相分配率为目 标，研究了 两水相系统成相浓度、 外加盐 n aci 、b s a 起始浓度对b s a 在两水相系统中分配 特 性 的 影 响 。 焦 庆 才 等 毗 用 p e g/ 困 氏万 5 04两 水 相 体 系 ， 经 一 次 萃 取 从 a- 淀 粉 酶 发酵液中分离提取a 一 淀粉酶和蛋白 酶，得最适宜萃取条件为 p e g 1000 ( 巧%) 一 伽比h s 仇(2 oofo) ， p h =8， a 一 淀粉酶收率为9 00/0 ， 分配系数为1 9. 6 ，蛋白 酶的分 离系数高达巧 . 1 ，比活率为原发酵液的1 . 5 倍，蛋白 酶在水相中的收率高于60%。 第 1 章 引言 通过向 萃取相 ( 上相)中加进适当 浓度的 侧比万 5 氏可达到反萃取。 实验结果表 明，随着( n 场h s 伍浓度的 增加，两水相体系两相间固体物析出量也增加。 对于 聚合物/ 盐 两水相体系，成本相对较低，粘 度相对地小，己 经成功地应用于工业 生产。但此类体系中高含量盐的毒害作用不可忽视，因此其应用范围受到了较 大限制。由 于柠檬酸盐的毒害作用相对较低，目 前正在加强对p e g / 柠檬酸盐体 系的研究。 对于由阴阳两种离子型表面活性剂组成的两水相体系，其含水量尤其高( 水 的质量分数可达望 抖 么 ) ，条件更加温和，已 经成为研究生物膜和用于生物活性物 质分离分 析的 理想模型1551. 同时 表面活性剂的 增 溶作用， 还可以 用于水不溶 性 蛋白 质的 分 离 冈。 如 朱 慎 林 等 词 人 用澳 化 十 二 烷基 三乙 按( c1 2 ne) 与 十二 烷 基 硫 酸钠(s d s)混合形成两水相体系， 测定了混合摩尔比与分相比例的关系， 并以 苯 丙氨酸为萃取对象，研究其在两水相体系中的分配及多级错流萃取效果。结果 表明，单级萃取率可达80%以上，二级萃取率可达99%以上;王世虎等人以阴阳 离子表面活性剂混合体系为研究对象，通过测定体系在不同种类盐溶液中的三 元相行为，探索了盐对体系相行为中的两水相区位置及相区宽度的影响规律; 童 爱 军 等 洲 用 c1 2 n e / s d s 两 水 相 体 系 对乙 酞 基 色 氨 酸( n 一 a c es 卜trp) 和 牛 血 清 白蛋白 进行萃取，发现二者最高萃取率分别可达8 7 .2 %和71. 7 %。针对此类体系 中阴阳两种离子型表面活性剂以1 :l 混合时极易发生沉淀的缺点，可以 通过选择 合适的溶剂( 如短链脂肪醇) 来达到改善其溶解度和促进特定有序组合体及两水 相形成的目 的。 如滕弘霓、 王利研究了 添加剂醇对s d s lct a b( 十六烷基三甲 基 溟 化按) 脸0 加az s 氏混 合系统 相行为、 两 水相 区宽 度、 相体积比 等性质的 影响 ， 揭示了醇的作用机理。 普通的能与水互溶的有机溶剂在无机盐的存在下也可生成两水相体系。此 类两水相体系具有价廉、低毒、较易挥发而无需反萃取和避免使用粘稠水溶性 高聚物等特点， 人们对该种