（细胞生物学专业论文）氯苯降解菌cb2的降解特性及质粒特性的研究.pdf

摘要 本实验从大连瑞泽农药公司的废水中筛选到了一株氯苯高效降解菌，并对其进行了 菌种鉴定、生长曲线测定、抗性及最佳降解条件测定，同时对菌株质粒的提取、质粒的 消除及质粒消除后菌株的降解特性进行了探究。主要实验结果如下： ( 一) 氯苯降解菌的降解特性研究 l 、菌种的分离和鉴定 实验筛选到一株氯苯高效降解菌，该菌株能够以氯苯为唯一碳源进行生长。运用扫 描电镜、生理生化检测及1 6 s r d n a 序列分析，鉴定该菌株为肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 。其 对链霉素不敏感，具有抗性，而对实验中所选用的其他抗生素都比较敏感，不具有抗性。 2 、氯苯降解菌c b 一2 最佳降解条件 氯苯降解菌c b 一2 降解氯苯的最佳条件为：底物浓度1 2 0m g l ，p h 7 0 ，温度3 0 ， 摇床转速1 2 0 r p m ，接种量为5 。在上述最适培养条件下，该菌株对氯苯降解率可达7 5 。 ( - - ) 氯苯降解菌c b 一2 的质粒特性的研究 1 、质粒提取 对于野生菌株需要选择合适的方法进行质粒提取，实验采用了碱裂解法、煮沸法和 s d s 法三种方法进行质粒提取，结果显示，s d s 法提取效果最好，所得到的质粒带与检测 到的质粒带结果一致，质粒的大小约为2 3 k b 。s d s 法是一种相对比较温和的质粒提取方 法，适合于大质粒的提取。煮沸法的操作虽然快捷，但反应剧烈，对大质粒的破坏相当 严重，所以实验中没有提取到质粒；常规碱裂解法对质粒也有不同程度的损坏，提取到的 质粒浓度不高，效果也不理想。 2 、质粒消除 为了考察质粒的功能，本文采用了吖啶橙、s d s 和苯甲酸钠三种消除剂进行质粒消 除。结果表明s d s 可以消除质粒，质粒消除后的菌株在氯苯无机盐培养基上难以生长。 而苯甲酸钠和吖啶橙质粒消除效果不好。 3 、质粒消除后菌株的降解特性 经s d s 质粒消除后的氯苯降解菌c b - 2 对氯苯的耐受力和降解率明显下降，这表明 该质粒与氯苯的降解代谢过程有关，其降解基因在质粒上，随着质粒的消除，其利用氯苯 的性能也丢失。通过对质粒消除后菌株对抗生素抗性的检测，发现菌株对抗生素的抗性 没有变化，该质粒与菌株抗生素的抗性没有关系。 4 、质粒转化 为进一步确认该质粒携带有降解氯苯的基因，本实验将质粒转化到ec o l l 中，转化 子能够在以氯苯为唯一碳源的无机盐培养基上生长，且能够降解氯苯，证明该质粒上携 带有氯苯降解性基因。 关键词：氯苯降解菌c b - 2 ；氯苯的降解；降解性质粒 a b s t r a c t a h i g h l ye f f e c t i v ec h l o r o b e n z e n e - d e g r a d i n gs t r a i ni ss e l e c t e df r o mt h ew a s t ew a t e r i t w a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e da se n t e r o b a c t o r t h es t r a i ni ss t u d i e do nt h er e s i s t a n t , o p t i m a l d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n s ， e l i m i n a t i o n o f p 1a s m i d , d e g e n e r a t i o n c h a r a c t e r i s t i c o f e l i m i n a t e d - p l a s m i ds t r a i n s ( 一) d e g e n e r a t i o nc h a r a c t e r i s t i co fc h l o r o b e n z e n e d e g r a d i n gs t r a i n 1 、s e p a r a t i o na n da p p r a i s a lo ft h es t r a i n as t r a i nt h a th a da c a p a b i l i t yt od e g r a d ec h l o r o b e n z e n ew a si s o l a t e df r o mt h ew a s t e w a t e rs a m p l e 1 1 1 es t r a i nc o u l du s ec h l o r o b e n z e n ea st h es o l ec a r b o ns o u r c e i tw a sp r i m a r i l y i d e n t i f i e da se n t e r o b a c t o rb a s e do nm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o - b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d 16 s r d n aa n a l y s i so fs e q u e n c e r e s i s t a n c eo ft h i ss t r a i nt oa n t i b i o t i ci sd e t e c t e d t h er e s u l t s h o w st h i ss t r a i nh a sr e s i s t a n c et os t r e p t o m y c i n , b u to t h e r s 2 、n eo p t i m a ld e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n so fc h l o r o b e n z e n e - d e g r a d i n gs t r a i n t h e o p t i m a ld e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n s a r e s t r a t ec o n c e n 仃a t i o n12 0 m g l p h 7 0 ，t e m p e r a t u r e3 0 。c ，r o t a t i n gr a t e12 0 r p m ，a n di n o c u l a t i o na m o u n t5 ( 二) pla s m i dc h a r a c t e r i s t i co fc h l o r o b e n z e n e d e g r a d i n gb a c t e r i u mc b 2 l 、e x t r a c t i o no f t h ep l a s m i d 刀始p l a s m i de x t r a c t i o nf r o mw i l ds t r a i n sn e e d sa na p p r o p r i a t em e t h o d 刀圮s t u d yu s e d t h r e ed i f f e r e n tm e t h o d st oe x t r a c tp l a s m i d ：a l k a l i n el y s i sm e t h o d , b o i l i n gm e t h o da n ds d s m e t h o d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t ：f o rl a r g ep l a s m i d s ，t h es d sm e t h o di sb e a e rt h a n t h eo t h e rt w om e t h o d s s d si sar e l a t i v e l ym i l dp l a s m i de x t r a c t i o nm e t h o ds u i t a b l ef o rt h e e x t r a c t i o no fl a r g ep l a s m i d s 1 1 1 ep l a s m i da p p r o x i m a t e l yi s2 3k b a l t h o u g ht h eo p e r a t i o no f b o i l i n gm e t h o d i sf a s t ，i ts e r i o u s l yd a m a g e dt h el a r g ep l a s m i d , w i t h o u tp l a s m i de x t r a c t e d a l k a l i n el y s i sm e t h o dd a m a g e dp l a s m i d , s ot h ee f f e c ti sa l s on o ti d e a l 2 、e l i m i n a t i o no ft h ep l a s m i d t od e t e r m i n ef u n c t i o no ft h ep l a s m i d ，t h ee x p e r i m e n ti sd o n et oc u r et h ep l a s m i df r o m t h ec e l l i nt h i sp a p e r , w eu s e da c r i d i n eo r a n g e ，s d s ，s o d i u mb e n z o a t et oe l i m i n a t et h e p l a s m i d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s d sc o u l de l i m i n a t ep l a s m i dw i t h o u ta n ys t r a i n sg r o w t h o nt h es e l e c t i v em e d i u mc o n t a i n i n gc h l o r o b e n z e n e 1 1 1 es o d i u mb e n z o a t ea n da c r i d i n eo r a n g e m e t h o dc o u l dn o te l i m i n a tp l a s m i d 3 、d e g e n e r a t i o nc h a r a c t e r i s t i co fe l i m i n a t e d - p l a s m i ds t r a i n s t o l e r a n c ea n dd e g r a d a t i o nr a t eo fe l i m i n a t e d - p l a s m i ds t r a i n st oc h l o r o b e n z e n ew e r e m e a s u r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e e l i m i n a t e d - p l a s m i d s t r a i n s g r e wd i f f i c u l t l y o i l c h l o r o b e n z e n ei n o r g a n i cs a l t sc u l t u r em e d i u m s t r a i n st o t h et o l e r a n c eo fc h l o r o b e n z e n e c o n c e n t r a t i o na n dd e g r a d a t i o nr a t eo fc h l o r o b e n z e n ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y w i t ht h e e l i m i n a t i o no ft h ep l a s m i d ，t h ep e r f o r m a n c eo fd e g r a d a t i o nc h l o r o b e n z e n ei sa l s ol o s t 4 、t r a n s f o r m a t i o no f p l a s m i d t h ee x p e r i m e n tt r a n s f o r m e dt h ep l a s m i di n t oe c o l i t h et r a n s f o r m a n t sc a r lg r o wo n i n o r g a n i cs a l t sm e d i u mo fc h l o r o b e n z e n ea ss o l ec a r b o ns o u r c e ，s ow ed e t e r m i n et h ep l a s m i d i s d e g r a d a t i n gp l a s m i d t h ep l a s m i d w a sr e l a t e dw i t ht h em e t a b o l i s mp r o c e s so f c h l o r o b e n z e n ed e g r a d a t i o n k e y w o r d s ：s t r a i n c b - 2 ，d e g r a d a t i o no fc h l o r o b e n z e n e , d e g r a d a t i v e p l a s m i d 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名： 盔堡! 霞 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 垄坌垦星 指导教师签名： 签名日期： 3 8 嘈1 ， 年舌月厂。日 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 引言 氯苯是由人工合成、化学性质比较稳定的一类化合物，其广泛用于医药、农药、工 程塑料、家庭卫生、材料合成以及染料工业等行业中。但氯苯中的氯原子有较高的电负 性，能够强烈吸引苯环上的电子，从而使苯环成为一个疏电子环，因而化学性质相当稳 定，很难降解，而且毒性大，甚至是致癌的，一旦将它们排放到环境当中，就会对水体 和土壤造成不同程度的污染。因此，研究氯苯类化合物的降解己成为当务之急。 人们在处理氯苯废水的过程中，研究过许多化学方法和物理方法，化学方法和物理 方法虽然处理工艺相对简单，处理效率高，但处理成本高，存在二次污染，反应条件比 较苛刻，不利于实际工程的应用等问题，因此难以在实际应用中取得满意的效果。后来 人们开始逐渐将注意力转移到研究氯苯类的生物降解上。但自然界中的微生物由于缺乏 相应的降解酶，因而难以被微生物所利用，为了解决这些问题，人们开始通过对菌种进 行接触驯化，寻找可以耐受氯苯毒性，又对氯苯具有高效降解性的微生物资源，希望能 将其应用到氯苯的处理当中，提高处理效率。 为了实现利用微生物来提高氯苯降解率的目的，人们展开了关于高效氯苯降解菌的 分离鉴定、最佳降解条件测定等方面的研究，并且取得了一定的成果，对氯苯的微生物 降解性已经有了比较深入的认识，但目前对于氯苯生物降解的遗传学研究还不够深入， 为了在分子水平上对微生物降解氯苯进行深刻理解，还需要对其降解性质粒进行提取、 消除和转化研究。本论文在对菌株c b - 2 进行分离、抗性和最佳降解条件测定等方面研 究的基础上，还对其质粒的特性进行了研究，相信对微生物降解氯苯遗传学机制的把握， 一定会帮助我们更好的利用生物法来解决氯苯污染的环境问题。 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 第一章文献综述 1 1 氯苯及氯苯类化合物 氯苯及氯苯类化合物是由人工合成，广泛应用于工农业生产中，化学性质比较稳定 的一类化合物。氯苯类化合物的氯离子电负性高，使苯环成为一个疏电子环，并随着氯 取代基的增多，氯苯类化合物的活性逐渐下降，稳定性增强。氯苯类化合物对人体的皮 肤、结膜和呼吸器官产生刺激；进入人体内有蓄积作用，抑制神经中枢；严重中毒时， 会损害肝脏和肾脏u 1 。 由于氯苯类化合物污染面积广，毒性大，不易生物降解，因此被美国环保局列为优 先控制污染物。近年来，国内外专家针对净化处理水中的氯苯化合物做了大量的研究工 作，本文就此方面的研究情况作一综述。 1 2 物理化学法处理氯苯废水的研究 1 2 1 化学氧化法 化学氧化法处理氯苯废水，一般选用的氧化剂是臭氧和过氧化氢瞳1 。c o t e ss b 1 曾 用0 3 和h ：0 2 0 3 作氧化剂氧化2 种不同浓度氯苯溶液，并分析氧化产物，得出2 一氯苯酚和 4 一氯酚是第l 氧化副产物。他们还在p h 7 0 的条件下，用0 。氧化和o 。在以f e 2 + 、f e 3 + 、m n 2 + 作催化剂，催化剂浓度为6 l o 巧m o l l 时催化氧化处理氯苯工业废水，这种金属催化臭 氧化是近几年发展起来的新技术。 1 2 2 催化氧化法 催化氧化法是应用于处理含难生物降解的有机物废水的技术。它是利用化学物质作 为催化剂，在一定压力、温度条件下，将难生物降解的有机物分解、转化为易生物降解 的有机物或彻底氧化成为无机物。氯苯作为难生物降解的有机物，国内外学者对此进行 了大量的催化氧化处理研究，这些研究目前基本上还处于实验室阶段。k e a n em a h 3 等 人在温度为4 7 3 - 5 7 3 k 时，用1 5 ( 质量分数) 的n i s i o 。做催化剂，对气化状态的氯苯 进行脱氯加氢形成苯和氯化氢。h a g hb iji a nf 5 】，m u r e n af 哺1 等人用n i m o ya l 。0 。的 硫化物作催化剂，在t = 3 0 0 - 3 4 0 c 、氢气的压力p = 4 1 0 6 p a ，反应介质是十六烷条件下， 对氯苯和噻吩的混合物进行催化氢化处理。结果表明，n i m o 催化剂有很高的活性和选 择性。s c h u t hc h r is t o p h 盯3 等用催化方法，在p d m ：0 。催化剂，h ：饱和溶液中，在高温 和常压下对氯苯进行降解研究。m u r e n af 随1 等对一氯苯的水溶液进行了催化脱氢的实验 和理论研究，实验是在3 0 4 c 、氯的压力在2 10 5 - 6 x1 0 6 p a 下，用p d c 作催化剂的带有 混合设备的压力容器中进行的。通过动力学分析，该反应符合l a n g m u i rh i n s h e l w o o d 方程，反应速率的控制步骤是表面反应。l i uy a n 1 等通过比较不同催化剂与氧化锰组合 催化氧化氯苯的效果，得出m n o 。t i o ：的活性最高，在温度大约4 0 0 。c 时，氯苯可完全氧 化，其中间产物为甲酸盐、乙配盐和顺丁烯二酸脂。周红艺n 们等人发现钯铁双金属能 2 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 有效地进行氯苯的催化脱氯，把钯作为催化剂可加速氯苯还原脱氯反应，并且脱氯率随 着钯化率增加而增加。在温和条件下 室温、常压、低钯化率( 0 0 0 5 ) ，5h 内氯苯脱 氯率达4 5 以上。 1 2 3 吸附法 运用于吸附氯苯的吸附剂最常见的是活性炭。此外，0 1 i v e i r al u i zc a m 利用活 性炭的吸附特性和氧化铁( f e 。0 4 ) 的磁性联合作用形成一种磁性吸附剂，可用它去除水中 氯苯等污染物。 1 2 4 超声波降解 超声波化学法是指利用超声波来启动新的反应通道或加速化学反应，进而获取新的 化学反应物或提高化学反应速率。9 0 年代以来，国外开展了利用超声波来降解有毒性污 染物的研究。w u n 铂等人研究了在水溶液中氯代有机物的超声波降解，并建立了降解过 程的动力学模型。p e t r i e rc n 朝等在研究氯苯、4 一氯苯酚时发现，超声波首先导致c c l 的断裂，然后热解产生c o 、c 0 2 、c 2 h 。，最终产物为h c l 、c o 、c 0 2 。g u t i e r r e zm n 4 1 等研究了聚乙烯基吡咯烷酮、乙醇、4 一硝基甲烷的降解特性，发现这类化合物的降解过 程类似高温热解反应，且挥发性的提高有利于污染物的降解。 1 3 生物法降解氯苯 理化法处理氯苯废水虽然有处理工艺相对简单、处理效率高的特点，但是它存在着 一些目前尚难克服的缺陷，比如存在二次污染，处理成本较高，反应条件苛刻等，因此 给实际的应用带来了许多的困难。生物法处理废水是一种应用最广泛的方法，经过很长 时间的发展，目前也是应用最成熟的方法，它运行管理简单，处理成本低，没有二次污 染，适用于各种成分复杂的废水，处理效果显著，若能用生物法取代理化法处理氯苯废 水，将能够大大提高排放氯苯废水的处理率。但是由于氯苯是人工合成的环境外来有机 物，自然界的微生物缺乏和它相适应的酶系统，所以显现出难以生物降解的性能。如果 让环境中的微生物与氯苯长期接触，微生物之间基因簇相互联结、杂交变异，可产生出 具有降解氯苯能力的基因特性。目前，已有许多研究者从受氯苯污染的底泥、水体和土 壤中发现并筛选出了一些微生物，并验证了降解质粒的存在和进行了基因克隆n 纠引。 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 1 3 1 降解氯苯的微生物资源 表1 - 1 降解氯苯的微生物资源 t a b l el 一1m i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e so fd e g e n e r a t i o - c h l o r o b e n z e n e 降解对象研究者降解菌研究结果& 降解率 一氯苯 r e i n e k ewp s u d o m o n a s 属的菌株发现菌株 & k n a c k m u s乃疋j 3 d 6 sh j n 9 1 一氯苯 s f n i s h i p p u t i d a & b a c i l l u s 属 发现菌株 n o 等2 0 1的菌株 一氯苯 k ie r n i c k ae s c h e r i c h i a h e r m a n i i 在氯苯浓度大于4 0 0 m g l 时也能 世【2 1 】 存活寸 一氯苯 罗如新单孢菌属在3 周内的氯苯降解率为3 3 沈标等n 5 1翻e r o m o n a s ) 存在质 粒，并成功转入大肠 杆菌中 一氯苯罗如新邻单孢菌属有氧情况下1 8 天内氯苯降解率 李顺鹏等 ( p l e s i o m o n a s ) 为5 0 9 6 ：厌氧情况下1 8 天内氯苯 【2 2 】 降解率为3 7 2 1 ，3 - - - 氯苯 王磊等1高效突变株 3 1 m g ( l d ) p f - 1 1 ( b a c i l l u s c i r c u s ) 菌 氯苯王战勇苏f y 0 1 f y 0 4 假单孢杆经4 8 h 培养，4 株菌株中fy 0 4 婷婷等2 们菌属p s e u d o m o n a s对氯苯的降解效果最好，达到了 f y 0 2 & f y 0 3 芽孢菌属5 2 4 ，其次是fy0 1 达到 4 7 2 ，而fy 0 2 、y 0 3 的降解 率分别为4 4 8 和4 2 6 。而4 株 菌株的混合菌株对氯苯的降解率 达到了6 7 8 。 能以邻二氯苯和一美国的假单胞菌发现菌株 氯苯为唯一碳源和 b e a i g l e r( p s e u d o n o n a s ) f s l 0 0 能源，除了一氯苯等2 5 1是一种格兰氏阴性杆 和邻二氯苯，它还菌 可以独立降解间、 4 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 对二氯苯和3 ，4 一 二氯酚，但不能降 解甲苯 l ，2 - - - - - 氯苯、1 ， 荷兰学者p 5 1 菌发现编码代谢功能的质粒 4 一二氯苯和1 ，2 ， 【 4 一三氯苯 i ，4 一二氯苯 e k e s p l e s sx a n t h o b a c t e r f l a v u s 1 ，4 一二氯苯的致毒浓度是o 1 m ，c l e s s ， 1 4 pj 是一种格兰氏 m x f l a v u s l 4p1 对1 ，4 一二氯 c l a u c i a s o 阴性的多形态细菌，苯的降解有高度的专一性，除了 m i l l e r 等 菌落微小，呈黄色 1 ，4 一二氯苯，它几乎不能降解其 它氯代或非氯代的芳香化合物。 1 ，4 一二氯苯、1 ，荷兰的 a i c a l i g e n e s a1 7 5 发现菌株 3 一二氯苯和一氯苯g o s e s e s c h r e a 等 】 1 ，4 一二氯苯为唯一 ol t m a n n s 两种假单胞菌杂交驯能够降解一氯苯的两种假单胞菌 碳源 雒r 【船】 化分离出能够以1 ，4 一杂交，驯化分离出能够以1 ，4 一寸 二氯苯为唯一碳源的 二氯苯为唯一碳源 菌株nr 1 3 2 l ，2 ，3 ，4 一四氯苯德国学者好氧微生物这是格兰氏阴性菌，严格好氧， 为唯一碳源除了 f 凹】 p s e u d o n o n a s h l o r o r a p 3 7 和4 下能够存活。除了1 ， 1 ，2 ，3 ，4 一氯苯， h s 2 ，3 ，4 一氯苯，该菌还能够以1 ， 该菌还能够以1 ，4 一二氯苯和l ，2 ，3 一三氯苯为唯 3 一、1 ，4 一二氯苯和一碳源和能源 1 ，2 ，3 一三氯苯为 唯一碳源和能源 氯苯张晶，王命名为lp 0 l 属于假对氯苯降解的最佳条件为：培养 战勇，苏婷单孢菌属 温度为3 5 ，底物质量浓度为3 0 婷 ( p s e u d o n o n a s s p ) r ng l ，ph 值为8 ，摇床转速 为1 2 0r min 。在该条件下该 菌株对氯苯的降解率可达到 9 3 9 。 氯苯瞿福平通过分析贡献因子的邻二氯苯、间二氯苯的共存有利 张晓健方法，对氯苯驯化污于整个体系的降解，但氯苯的耗 5 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 何苗泥中氯苯类同系物共氧速率有所降低，竞争和共代谢 顾夏声b 帕存时对氯苯生物降解作用是它们的作用机；对二氯苯、 性能的影响及作用机1 ，2 ，4 三氯苯的共存会抑制整 制进行了研究个体系及氯苯的降解。 对单氯苯和l ，2王磊周突变株pf1 1 为以前 二氯苯均有降解作琪张伯生未见报导的革兰氏阳 用，降解能力为一 世f 2 3 】 性寸 氯苯 1 ，3 二氯苯 1 ，2 二氯苯 1 3 2 微生物降解氯苯的遗传学机制 随着分子生物学和基因工程技术的发展，人们对生物降解氯苯废水的研究也进入到 了一个新的层次，不再局限于只对降解菌的分离、最佳降解条件和降解效率等外在的问 题进行探究，而是深入到菌株的内部探求控制氯苯降解性状的基因的所在。通过研究这 个问题，有利于更加深刻的研究微生物降解氯苯废水的内在机制，而且可以帮助我们利 用基因工程技术，通过对微生物降解基因的改造，构建出降解效率更高的基因工程菌。 当微生物在环境中遇到新的有机物时，它们可以通过两种途径来获得降解这种新有 机物的基因：第一种方法是通过基因突变来调整现有的基因，从而获得新的降解基因。 控制有机物降解的基因不仅仅位于微生物的染色体上，很多有毒的有机化合物，特别是 复杂的芳香烃类有机物的生物降解，一般都有降解性质粒的参与，其降解性基因可能部 分或全部位于质粒上；第二种方法是通过结合和转移的方式从其它的微生物那里得到所 需的代谢基因。降解同一种有机污染物的基因具有极高的同源性，即使是在不同的环境 中得到的菌株，他们降解同一种有机物的基因的同源性也很高，这种基因在微生物种群 内传播的现象很普遍，因此，研究一个基因对研究与其相关的其它基因也具有很高的参 考价值。 质粒是一种环状的d n a ，一般其大小在2 2 0 0 b p 到2 0 0 0 0 0 b p 之间，与染色体相比要 小很多。微生物体内的质粒种类很多，如：降解基因、抗性基因等。其中，降解性质粒 在有机污染物的生物降解过程中起重要作用，它们编码的一些蛋白酶类在降解过程中具 有关键作用，降解性质粒在微生物降解有机污染物的遗传学研究中具有重要的作用。质 粒的有无对宿主细胞的生死和生长基本上没有太大的影响，但在特定的环境下质粒能够 转化，获得质粒的菌体可以同时获得质粒上拥有的性状。 质粒的独特性质，决定了它在微生物生理代谢过程中的一些独特的功能。质粒由于 能够通过接合和转移在微生物细胞间移动，所以在基因传播过程中扮演着很重要的角 色。目前，人们已经发现了许多与降解有机污染物有关的质粒，并且对许多质粒进行了 6 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 分离和鉴定，对质粒的结构、功能和性质进行了研究。这些质粒一般都比较大，在受到 有机物污染的环境中生长的微生物，检出质粒的机率要高于其它环境中生长的菌种。 1 3 3 微生物降解代谢氯苯的机制 氯代芳香化合物生物降解至关重要的一步在于脱氯，根据脱氯过程中的电子得失， 可将其分为氧化脱氯和还原脱氯，除了脱氯机制外，还存在共代谢机制，该机制能够改 变化合物的分子结构，使其在生物培养中更易于其它微生物的降解。 1 3 3 1 氯代芳香化合物的氧化脱氯机理1 3 1 】 氯代芳香化合物氧化脱氯是指芳香环被氧化并脱去氯取代基的过程。根据脱氯发生 的先后，脱氯过程存在二种方式：一种是先开环再脱氯，另一种是先脱氯再开环。如果 经邻位开环降解，则是在双加氧酶作用下发生双羟基化反应，生成3 一氯一顺一1 ，2 一二羟 基一3 ，5 还己二烯( 顺式双醇) ，再在n a d 的参与下去掉一分子氢，生成氧化开环的中间 体3 一氯邻苯二酚。此中间体邻位裂解后形成2 一氯一2 ，4 一二烯一己二酸( 即2 一氯粘康酸) 。 脱氯过程发生在粘康酸内醋化形成4 一羟甲烯基一2 一丁烯一4 一内脂的过程中。此产物含有不 饱和双键，可以被逐步还原，生成只含一个不饱和键的顺丁烯二酰基乙酸( 即马来酰基 乙酸) 和碳链完全饱和的3 一羰基一己二酸，并最终进入三羧酸循环瞄幻( 如图卜1 所示) 。 图1 - 1 氯苯的好氧生物降解机制 f i 百- 1t h ea e r o b i cd e g r a d a t i o no fm o n o c l o r o b e n z e n e ( m c b ) 如果经间位开环方式降解，则由氯邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶催化开环，生成2 一羟基 粘康酰氯，水解脱氯行成2 一羟基粘康酸，然后经进一步代谢进入t c a 循环1 。一般3 一 氯邻二苯酚主要是邻位开环途径，很少有细菌经间位开环途径降解氯苯，但最近发现一 株假单胞菌g j 3 1 能通过问位代谢途径降解一氯苯，途径如图( 图卜2 ) 。氯苯化合物在氯 苯双氧化酶和醇脱氢酶作用下形成3 一氯邻苯二酚，由氯邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶催化开 环，生成2 一羟基粘康酰氯，水解脱氯形成2 一轻基粘康酸，然后经进一步反应进入t c a 循环。 7 也 删一 靖 仅岬 a 6 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 c i ，0h 0 ，0 魄百浯鹏t c a 图卜2 假单胞菌g j 3 1 一氯苯间位代谢途径 f i g1 - 2t h em e t a c l e a v a g ep a t h w a yo f m c bi np s e u d o m o n a s s p g j 3 1 g j 3 1 的氯邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶对粘康酸酰氯有较强的抵抗性，不会因为粘康酸 酰氯的积累而失活，因为g j 3 1 中有一个与氯邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶基因相邻的基因， 编码一种铁氧还蛋白，与氯邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶共价结合，当没有这种铁氧还蛋白 参与时，氯邻苯二酚一2 ，3 一双加氧酶就会迅速失活m 3 ，所以假单胞菌g j 3 1 得以通过问 位代谢途径降解一氯苯。 1 3 3 2 氯苯类化合物的还原脱氯机制 还原脱氯是指氯苯类化合物在得到电子的同时去掉一个氯取代基，并释放出一个氯 阴离子的过程。还原脱氯的降解机制主要是发生在厌氧的条件下，但在多氯化合物的好 氧降解过程中有时也可能会进行，持此之外还需要多种微生物共同参与。他们脱氯的机 理差异很大。多氯取代苯时，由于氯原子吸引苯环的电子云，致使苯环电子云密度降低， 一般在有氧情况下，单加氧酶或双加氧酶是很难从苯环上获取电子而发生氧化反应的， 氯原子数越多，苯环上电子云密度越低，氧化就越难，而在厌氧情况下，环境氧化还原 电势较低，多氯代化合物显示出较好的还原降解性。许多多氯代化合物在好氧条件下难 于降解的，在厌氧下变得甚至容易降解。还原脱氯使化合物取代氯原子数减少，降低这 些有机物毒性，易于被其它微生物降解m 矧。 1 3 3 3 共代谢 ， 共代谢最早由l e a db e t t e r 于1 9 5 9 年提出口7 1 ，其定义为在生长基质存在时对不可 利用基质的氧化，现在一般定义为只有在初级能源物质存在时才能进行的化合物的生物 降解过程。共代谢一般是由于辅助因子缺乏专一性和生长基质诱导产生的酶所致。 共代谢作用常使非生长基质发生结构转变，但不能将它彻底地降解。共代谢中选择 生长基质是很重要的，许多化合物虽然都可能成为微生物的生长基质，但在诱导产生的 酶可能不完全相同。许多氯苯类化合物虽然不能被微生物直接作为生长基质，但可通过 选择一种合适的生长基质来诱导产生它们所需的酶，进而产生足够的能量来驱动它们的 最初转化。 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 1 4 质粒消除的研究现状 1 4 1 利用消除剂对菌株质粒的消除 1 4 1 1 十二烷基硫酸钠( s d s ) 质粒d n a 与细菌染色体上d n a 的共同点是它们都附着于细胞膜上进行复制。s d s 是 一种离子型表面活性剂，在合适的浓度下它能溶解膜上的蛋白，破坏菌体的膜结构，改 变质粒在细胞膜上的结合位点，使d n a 不能精确复制，最终导致质粒不能正确地分配到 子细胞中，进而达到消除质粒的目的。s d s 的另一个作用机理还可能是，进入细胞质后， 使某些与质粒复制及分配有关的蛋白部分或完全失活，造成质粒的丢失。肺炎克雷伯氏 菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 中大的内生质粒( 9 6 k b ) 编码异柠檬酸脱氢酶，使用新生霉素、 朗、丝裂霉素c 等难以将它消除啪3 。 1 4 1 - 2 嵌合染料 嵌合染料包括溴化乙锭( e b ) 、吖啶黄、吖啶橙等，它们可用作质粒消除，其作用机 理是选择性地抑制质粒的复制。s i n g hm 等啪1 用吖啶橙消除e c o l i k l 23 5 3 中的质粒r 2 7 、 r p 4 、r 1 及p b r 3 2 2 ，每种质粒的消除率均不同，并随着吖啶橙浓度的增加而提高。质粒 r 2 7 最高消除率为4 1 2 ，r 1 为3 5 ，p b r 3 2 2 为1 6 5 ，r p 4 为1 0 0 , 6 。当e c o l i k l 2j 5 3 处于指数生长期时，吖啶橙作用效果最佳，细胞处于其它生长阶段或吖啶橙过量，质粒 消除率极低或根本无效。除吖啶类物质外，明也被广泛用于细菌质粒的消除。b o u a n c h a u d 等m 1 用e b 以较高的频率消除了肠细菌( e n t e r o b a c t e r i a ) 和葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c i ) r 扣带有 抗生素抗性的质粒，实验结果的可重复性也优于吖啶类物质。 1 4 2 控制菌体的生理状态或生长条件对质粒的消除 将菌株在高于其正常或最适生长温度5 c 一7 c 的条件下进行培养，并在相同温度下 连续转接培养数次，得到的指数生长期培养物，经稀释涂布平板，根据菌落的表现特征， 验证质粒存在与否。m o r r i s o nn a 等h 们将带有编码固氮酶质粒的快生型根瘤菌( r h i z o b i u m s p ) 的培养温度从3 0 提高至3 7 后，质粒的消除率约为2 3 。根瘤菌在正常温度下生 长时，质粒的复制与菌细胞的分裂同步；当温度升至3 7 后，质粒的复制受到抑制，随 着培养时间的延长及传代次数的增加，部分子代菌体中的质粒就被消除了。此外，有些 菌株体内生的质粒在高温下结构不稳定，也可导致质粒的丢失。g h o s hs 等h 盯为了确定 酸杆菌( a c i d c o c e l l as p ) g s l 9 中，大小分别为2 6 1 7 k b 、3 6 k b 、7 7 k b 的内生质粒是否编码对 c d 2 + 、z n 2 + 的抗性，首先用吖啶橙( 1 0 4 0 0l ag m l ) 及吖啶黄( 1 0 7 0 0l ag m l ) 消除质粒， 结果表明g s l 9 菌对这两种物质均不敏感，内生质粒一直稳定存在。将培养温度从3 0 升至4 2 。c ，并经过两轮转接培养后，3 种质粒的构型均发生了变化，又经过1 0 轮转接 培养，3 种质粒被完全消除。 9 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 1 5 本论文研究的主要内容 以往的研究，大都仅限于对氯苯高效降解菌的分离、寻找最佳降解条件，对菌体质 粒的降解特性研究的很少，本论文除探究了氯苯降解菌的分离鉴定及最佳降解条件测定 外，还在分子水平上探究了其质粒的降解特性，具体内容包括： 1 、氯苯降解菌的降解特性研究 1 ) 菌种的分离 2 ) 菌种的鉴定 3 ) 氯苯降解菌c b - 2 生长曲线与氯苯含量的测定 4 ) 菌株对抗生素抗性的测定 5 ) 氯苯降解菌c b - 2 最佳降解条件的测定 2 、氯苯降解菌c b - 2 的质粒特性的研究 1 ) c b - 2 质粒的检测 2 ) 质粒的提取 3 ) 质粒的消除 4 ) 质粒消除后氯苯降解菌c b 一2 对抗生素抗性的变化 5 ) 质粒消除后氯苯降解菌c b 一2 对氯苯耐受力的变化 6 ) 质粒消除后氯苯降解菌c b - 2 对氯苯降解率的变化 7 ) 质粒的转化 8 ) 转化子对氯苯的降解 1 0 氯苯降解菌c b - 2 的降解特性及质粒特性的研究 第二章氯苯降解菌c b - 2 的降解特性研究 2 1 实验材料 2 1 1 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 0 7 2 ，固体 培养基加1 8 9 琼脂，1 2 1 高压灭菌2 0 m i n ； 无机盐培养基：n i l n 0 。1 o g ，( n h 4 ) 。s 0 , 0 5 9 ，m g c l z 0 5 9 ，k h 2 p 0 , 0 5 9 ，n a c l 0 5 9 ，h 2 0 1 0 0 0 m l ， p h 7 2 - 7 4 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n ，加入适量氯苯。 2 1 2 药品与试剂 氯苯( 分析纯) 2 1 3 实验仪器 表2 - 1 实验仪器 t a b l e2 - li n s t r u m e n t so fe x p e r i m e n t 2 2 实验方法 2 2 1 茵种的分离 从大连瑞泽农药公司的废水中取1 0 m l 样品于1 0 0 m l 含有玻璃珠的无菌水中充分混 匀，配制成l ：1 0 的菌悬液。取5 m l 菌悬液接种于1 0 0 m l 浓度为5 0 m g l 的氯苯牛肉膏蛋白 胨液体培养基中，3 7 c ，1 0 0 r p m 摇床振荡培养5 d 。从培养好的培养基中取出5 m l 的菌液， 再接种到氯苯浓度为7 0 m g l 的牛肉膏蛋白胨液体培养基上，相同条件，培养5 天。重复 上述步骤，以2 0 m g l 为梯度培养，培养到氯苯浓度为2 0 0 m g l 为止。从驯化好的培养基 氯苯降解菌c b 2 的降解特性及质粒特性的研究 中挑取菌液在含氯苯浓度为l o o m g l 的无机盐固体培养基上，先进行稀释涂布，再进行 划线分离，直至分离出单一菌落。将分离到的单一菌落接于牛肉膏蛋白胨固体培养基上， 进行富集，斜面保存备用。 2 2 2 菌种的鉴定 2 2 2 1 形态学及生理生化鉴定 参看文献 4 2 对菌株进行形态学及生理生化鉴定。 2 2 2 21 6 s r d n a 鉴定 2 2 2 2 1 细菌总d n a 的提取 细菌总d n a 采用溶菌酶一s d s 一蛋白酶k 的方法进行提取。 2 2 2 2 2p c k 扩增、反应物的及质粒转化 扩增细菌1 6 sr d n a 的前5 0 0b p 的片段，