（细胞生物学专业论文）青岛文昌鱼trp14和ycacr基因的表达和功能鉴定.pdf

l p 国海 = f _ 人学博二卜学位论文 青岛文吕鱼t r p l 4 和y c a c r 基因的 表达及功能鉴定 摘要 文昌鱼是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是现存的与脊椎 动物祖先最接近的无脊椎动物，一直被作为研究牛物进化和胚胎发育的典型 材料。佛罗望达文昌鱼基因组的测序完成，为利用分子生物学手段，研究文 晶鱼基因的结构、进化和表达，揭示文昌鱼发育的分子生物学机制奠定了孥 实的基础。本论文对青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e t c h e r it s i n g t a u n e s e lt r p l 4 和y c a c r 基因的克隆与鉴定、结构、进化、表达以及功能展开了研究。 a m p h i t r p l 4 ，是硫氧还蛋自相关蛋白家族成员，全长7 7 5b p ，最大开放 阅读框编码由1 2 3 个氨基酸组成的蛋白质，其理论分子量大约为1 4k d a ，理 论等电点为4 8 。该蛋白质与人的t r p l 4 蛋白的相似性为5 6 ，序列中含有一 个类似t r x 的基序c y s - p r o a s p c y s ( c p d c ) ，二级结构含有五个d 折叠和五个 螺旋，这些都是t r p l 4 蛋白的典型特征。高等牛物( 人、动物和植物) 到 细菌体内都存在着t r p l 4 同源序列。对t r p l 4 蛋白同源序列和代表性的硫氧 还蛋白序列，通过n e i g h b o r - j o i n i n g 方法构建的系统进化树显示：a m p h i t r p l 4 蛋白和人类的t r p l 4 以及其他物种的t r p l 4 蛋白聚到7 起，而和t r x 蛋白归 属不同分支，这表明t r p l 4 蛋白是类含有c p d c 序列，不同于t r x 的保守 蛋白。从佛罗里达文昌鱼基因组数据库中也搜索到t r p l 4 ，和青岛文昌鱼 t r p l 4 同源性达9 4 ，其基因组序列包含四个外显子和三个内含子，与后口 动物包括人、牛、人鼠、小鼠和海胆的t r p l 4 基斟结构一致。原口动物如果 蝇和线虫t r p l 4 基因则含有三个外显子和两个内含子。这显示t r p l 4 基因 f o u r - e x o n t h r e e i n t r o n 的结构在原fl 动物和后口动物分化后出现，并且在后 j 动物中高度保守。青岛文昌鱼的t r p l 4 基因插入p e t 2 8 a 融合表达载体，在 原核e c o l i 叶i 实现了高效稳定的表达，并纯化出a m p h i t r p l 4 融合蛋白。用 还原胰岛素二硫键的方法，发现a m p h i t r p l 4 蛋白具有还原酶的活性，并且 显示出一定的浓度依赖性。a m p h i t r p l 4 蛋白的_ 二硫键的还原能够将色氨酸的 荧光强度提高近2 7 倍，这暗示色氨酸残基周围微环境的变化。切片原位杂交 结果显示，a m p h i t r p l 4 在肝盲囊、卵巢、鳃和肠表达丰度较高，而在其他组 织中表达较低或者是没有表达，表明t r p l 4 在文昌鱼体内的表达具有组织特 中国海洋大学博i 学位论文 异性。利用a m p h i l r p l 4 原核表达重组蛋白质制备的多克隆抗体进行免疫组 织化学杂交，发现在蛋白水平也存在类似的表达分布，而人类t r p l 4 蛋白分 布于所有组织内，呈现广泛表达的模式，这说明a m p h i t r p l 4 蛋白在这些组 织的高表达可能和其易于被氧化压力的损害有关或者是在食物消化过程中起 特殊的作用。 本文还报道一个类y c a c 的基因a m p h i y c a c r ，这是在除大肠杆菌以外的物 种中首次报道。它全长8 9 1b p ，最人开放阅读框编码由2 0 1 个氨基酸组成的 蛋白质，其理论分子量大约为2 2 k d a ，理论等电点为7 2 。a m p h i y c a c r 含有 一个保守的y c a c r e l a t e d 的蛋白质结构域，且含有保守的可能的催化残基d 1 9 、 r ( k 18 4 和c l l 8 ( 1 y a c ；按大肠杆菌y c a c 中标号) 和保守的非脯氨酸的顺 式肽键，并且具有与y c a c 蛋白相类似的三层三明治拓扑结构，这是y c a c 家 族的典型特征。系统进化分析发现，a m p h i y c a c r 蛋白单独聚类，与 i s o c h o r i s m a t a s e 超家族的其他亚家族明显分开，说明a m p h i y c a c r 与y c a c 虽 然有类似的残基，但分属不同的亚家族。从佛岁里达文昌鱼基因组数据库中 也搜索到y c a c r 基因，和青岛文昌鱼y c a c r 氨基酸同源性达9 3 ，其基因组 序列包含四个外显子和j 个内含子，后口动物包括人、大鼠和狗的y c a c r 基 因结构含有五个外显子和四个内含子，原口动物如果蝇和线虫y c a c r 基因则 含有三个外显子和两个内含子，说明存物种进化过程中，该基因外显子呈现 增多趋势。应用原核蛋白表达的方法构建原核表达载体，纯化融合蛋白 a m p h i y c a c r 。用i s o c h o r i s m a t a s e ，n o c i t i n a m i d a s e 和n c a r b a m o y l s a r c o s l n e a m i d o h y d r o l a s e 活性测定方法测定a m p h i y c a c r 的活性，发现a m p h i y c a c r 不 具有这三种酶的活性。蛋白质互作实验鉴定了两种相互作用蛋白，一个是文 昌鱼组织液巾正常含有的y c a c r 蛋白，说明文昌值y c a c r 蛋白可能是以同源 多聚体发挥生理功能；另一个是肌酸激酶，可能通过相互结合问接参与能量 反应。a m p h i y c a c r 切片原位杂交表明a m p h i y c a c r 在成体文昌鱼不同组织中 表达量变化较大，在肝旨囊、肠、内柱和卵巢表达量较高，其他组织表达量 较低，呈现完全表达摸式。制备多克隆抗体，并应用于免疫组织化学定位， 研究结果j 切片原位杂交结果。致。结果说明这是一类位于线粒体的 i s o c h o r i s m a t a s e 超家族成员，可能与肌酸激酶相互作h j 。广泛表达的模式说明 它可能行驶基本的生理功能，肝占囊、后肠、卵巢和内柱的高量表达与这些 组织的快速能量代谢有关。 关键词：文昌鱼：进化；表达：硫氧还蛋白相关蛋白；y c a c 相关蛋白 中国海洋大学博士学位论文 e x p r e s s i o na n df u n c t i o n a i id e n t i f i c a t i o no ft r p l 4a n d y c a o rg e n ef r o ma m p h io x u sb r a n c h i o s t o m ab e i c h e r i a b s tr a c t a m p h i o x u so rl a n c e l e t ，ac e p h a l o c h o r d a t e ，h a sl o n gb e e nr e g a r d e da st h el i v i n g i n v e r t e b r a t em o s t c l o s e l y r e l a t e dt ot h ep r o x i m a t ei n v e r t e b r a t ea n c e s t o ro f v e r t e b r a t e s i ti sw e l l k n o w nm o d e l o r g a n i s mw i d e l yu s e d f o r i n t e r s p e c i e s c o m p a r a t i v eg e n o m es t u d i e sa n dd e v e l o p m e n t a lh o m o l o g ya n a l y s i s s e q u e n c i n go f t h ew h o l eg e n o m eo ff l o r i d aa m p h i o x u so f f e r san e w o p p o r t u n i t yt ot h er e s e a r c ho f m o l e c u l a ra n de v o l u t i o n a r yb i o l o g yo fa m p h i o x u s i nt h i sp a p e r ，w er e p o r tt h e c l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o n ，e x p r e s s i o n ，p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s a n df u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o no f a m p h i o x u s t r p l 4g e n e ，a m p h i t r p l 4a n d a r n p h i o x u s y c a c r e l a t e dg o n e ，a m p h i y c a c rf r o mt h eg u te d n al i b r a r y o fa m p h i o x u s b r a n c h i o s t o m ab e t c h e r it s i n g t a o e n s i s a m p h i t r p l 4o b t a i n e df r o mt h eg u te d n al i b r a r yo fa m p h i o x u s 丑b e l c h e r ii s 7 7 5b pl o n ga n di t sl o n g e s to p e n r e a d i n gf r a m e ( o r f ) c o d e sf o rap r o t e i no f12 3 a m i n oa c i d sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so fa p p r o x i m a t e l y1 4k d aa n da n i s o e l e c t r i cp o i n to f4 8 t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c es h a r e s5 6 i d e n t i t yt o h u m a nt r p l 4 ，a n dh a dat r x l i k em o t i fc y s p r o - a s p c y s ( c p d c ) i th a sf i v e p s h e e t sa n df i v e 旺一h e l i x e s ，c h a r a c t e r i s t i co f h u m a nt r p l 4 t h e r ea r ean u m b e ro f p u t a t i v et r p l 4s e q u e n c e sf r o mav a r i e t yo fo r g a n i s m si n c l u d i n ga n i m a l s ，p l a n t s a n db a c t e r i a t h ep h y l o g e n e t i ct r e ec o n s t r u c t e db yn e i g h b o r - j o i n i n gm e t h o du s i n g t h es e q u e n c e so ft r p l 4p r o t e i n s ，p u t a t i v et r p l 4p r o t e i n sa n dr e p r e s e n t a t i v et r x p r o t e i n ss h o w st h a tb o t ha m h i q r p l 4a n dh u m a nt r p l 4a sw e l la s p u t a t i v e t r p l 4p r o t e i n sa r ec l u s t e r e dt o g e t h e r , s e p a r a t i n gf r o mt r xp r o t e i n s t h e s ei m p l y t h a tt r p l 4i sah i g h l yc o n s e r v e du b i q u i t o u sp r o t e i nw i t ht h ea c t i v es i t ec p d c a s e a r c ho ft h er e c e n t l yc o m p l e t e dd r a f ta s s e m b l ya n da u t o m a t e da n n o t a t i o no f 丑 f l o r i d a eg e n o m er e v e a l st h ep r e s e n c eo faf l o r i d aa m p h i o x u st r p l 4e d n aa n di t s g e n o m i cd n as e q u e n c e s e q u e n c ec o m p a r i s o nd e m o n s t r a t e st h a ta m p h i t r p l 4 s h a r e s9 4 i d e n t i t yt ot h ed e d u c e dp r o t e i ne n c o d e db yf l o r i d aa l n p h i o x u sg e n ea t t h ea m i n oa c i dl e v e l a n a l y s i so ft h eg e n o m i cs t r u c t u r ee x h i b i t e st h a tf l o r i d a 中国海洋大学博士学位论文 a r n p b i o x u st r p l 4g e n ec o n s i s t so f f o u re x o f l sa n dt h r e ei n t r o n s ，w h i c hi si na c c o r d w i t ht h eg e n o m i cs t r u c t u r e sf r o md e u t e r o s t o m e ss u c ha sh u m a n , b o v i n e ，m o u s e ，r a t a n ds e au r c h i n ，w h i l ep u t a t i v et r p l 4g e n e si np r o s t o s t o m e sl i k ef r u i tf l ya n d n e m a t o d e c o m p r i s e t h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n s t h e s ed e m o n s t r a t et h e e v o l u t i o n a r ye m e r g e n c eo f t h ef o u r - e x o n - t h r e e i n t r o no r g a n i z a t i o no f t r p l 4g e n e s a f t e rt h es p l i to fp r o t o s t o m e d e u t e r o s t o m e ，w h i c hi sh i g h l yc o n s e r v e ds i n c et h e n a i le x p r e s s i o nv e c t o ri n c l u d i n gt h ee n t i r eo p e nr e a d i n gf l a m eo f a m p h i t r p 1 4a n d a5 a d d i t i o n a l t a go fp e t 2 8 ai s c o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t oec o i l r e c o m b i n a n tp r o t e i ni se x p r e s s e da n dp u r i f i e d a m p h i t r p l 4 ，w h i c hc o n t a i n s 妒。， w 7 5a n dw 9 9 ，y i e l d e da2 7 一f o l di n c r e a s ei nt r y p t o p h a nf l n o r e n c e n c ew h e nr e d u c e d ， s u g g e s t i n gc h a n g e s i nt h em i c r o e n v i r o n m e n ta r o u n dt h et r p ( w ) r e s i d u e s j u x t a p o s i n g t h ec x x ca c t i v e s i t e a m p h i t r p l 4 e x h i b i t s a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n td i s u l f i d er e d u c t a s ea c t i v i t yt o w a r di n s u l i n ，w h i c hc o n t a i n s o n ei n t r a m o l e c u l a ra n dt w oi n t e r m o l e c u l a rd i s u l f i d e s i ts h o w st h a ta m p h i t r p 14 i s ad i s u l f i d er e d u c t a s e ns i t u h y b r i d i z a t i o nh i s t o c h e m i s t r y r e v e a l st h a t a m p h i t r p l 4t n m s c r i p ti sa b u n d a n ti nt h eh e p a t i cc a e c u ma n do v a r y , a n da t a l o w e rl e v e lp r e s e n ti nt h eh i n d g u t 。e n d o s t y l e ，e p i p h a r y n g e a lg r o o v e ，g i l la n dt e s t i s ， w h i l ei ti sa b s e n ti nt h en e u r a lt u b e n o t o c h o r da n dm u s c l e i ti sc l e a rt h a tt r p14 g e n e i s e x p r e s s e d i n a n l p h i o x u si nat i s s u e s p e c i f i cm a n n e r t h i si s f u r t h e r c o r r o b o r a t e db yi m m a n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gu s i n gt h er a b b i ta n t i s e r u ma g a i n s t t h ep u r i f i e d , r e c o m b i n a n ta m p h i t r p l 4 ，w h i c hs h o w e dt h a ta m p h i t r p l 4w a s p r e d o m i n a n t l yl o c a l i z e di nt h eh e p a t i cc a e c u m ，o v a r ya n dh i n d g u t ，a n dw e a k l yi n t h et e s t i sa n dg i l l t h i ss u g g e s t st h a ta m p h i t r p l 4m a yp l a yaf i m d a m e n t a lb u t t i s s u e s p e c i f i c r o l ei nf o o d d i g e s t i o n f o r e x a m p l e ，o ra l t e r n a t i v e l y r e f l e c t d i f f e r e n c e si nt h et i s s u es u s c e p t i b i l i t yt oo x i d a t i v ed a m a g e t h i sp a p e ra l s or e p o r t st h ec h a r a c t e r i z a t i o na n de x p r e s s i o no fa m p h i y c a c r t h e c d n ai s8 9 1b pl o n ga n dt h eo r b c o d e sf o rap r o t e i no f2 0 1a m i n oa c i d sw i t ha p r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so fa p p r o x i m a t e l y2 2k d a a n da ni s o e l e c t r i cp o i n to f7 2 t h ed e d u c e dp r o t e i nh a say c a cr e l a t e dd o m a i n ，w h i c hb e l o n g st ot h e t h e i s o c h o r i s m a t a s es u p e r f a m i l y i , i k ey c a c ，a m p h i y c a c rh a dt h ep u t a t i v ec a t a l y t i c t r i a d ：d 1 9 ，r ( k ) 8 4a n dc 11 8 ( n u m b e r i n ga si nk c o l i ) a n dt h ep r e d i c t e ds t r u c t u r e h a st h r e e l a y e rc 【- b 一位s a n d w i c ht o p o l o g ys t r u c t u r e ，c h a r a c t e r i s t i co ft h ey c a c 中国海洋大学谛士学位论文 f a m i l y t h ep h y l o g e n e t i ct r e ec o n s t r u c t e db yn e i g h b o r - j o i n i n gm e t h o du s i n gt h e s e q u e n c e so fp u t a t i v ey c a c rp r o t e i n s a n dr e p r e s e n t a t i v em e m b e r so ft h e i s o c h o r i s m a t s es u p e r f a m i l ys h o w st h a ta m p h i y c a c ra n do t h e rp u t a t i v ey c a c r p r o t e i n s a r ec i u s t e r e d t o g e t h e r , s e p a r a t i n gf r o m o t h e rs u b f a m i l i e so ft h e i s o c h o r i s m a t a s es u p e r f a m i l y t h e s ei m p l yt h a ty c a c ri sah i g h l yc o n s e r v e dp r o t e i n w i t ht h ea c t i v es i t e so fy c a cs u b f a m i l y a ne x p r e s s i o nv e c t o ri n c l u d i n gt h ee n t i r e o r fo fa m p h i y c a c ra n da5 a d d i t i o n a lt a go fp e t 2 8 ai sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e di n t oec o i l r e c o m b i n a n tp r o t e i ni se x p r e s s e da n dp u r i f i e d a s s a y sf o r i s o c h o r i s m a t a s e ，n i c o t i n a m i d a s e a n d n c a r b a m o y t s a r c o s i n ea n a i d o h y d r o l a s e d e m o n s t r a t et h a ta m p h i y c a c rd o e s n ts h o wt h ea c t i v i t yo ft h et h r e ee n z y m e s p u l l d o w na s s a ys h o w st h a tt h e r ea r et w op r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t ha m p h i y c a c r o n ei s a m p h i o x u sn a t i v ey c a c rp r o t e i na n dt h eo t h e ri sc r e a f i n ek i n a s e t h e s es h o w e d t h a ta m p h i y c a c rm a yb ef o r mp o l y m e r sa n di n d i r e c t l yi n v o l v e di ne n e r g y t r a n s d u c t i o n ns i t uh y b r i d i z a t i o nh i s t o c h e m i s t r yr e v e a l st h a ta m p h i y c a c r t r m l s c r i p ti sa b u n d a n ti nt h eh e p a t i cc a e c u n l ，g u t ，e n d o s t y l ea n do v a r y , a n da ta l o w e rl e v e lp r e s e n ti nt h ee p i d e r m i s ，e p i p h a r y n g e a lg r o o v e ，g i l l ，t e s t i s , m u s c l e ， n e u r a lt u b ea n dn o t o c h o r d i ti sc l e a rt h a ta m p h i y c a c rg e n ei se x p r e s s e di na u b i q u i t o u se x p r e s s i o n p a t t e r n t h i s i s 知i t h e rc o r r o b o r a t e d b y i m m t m o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gu s i n gt h er a b b i ta n t i s e r u ma g a i n s tt h ep u r i f i e d a m p h i y c a c r ，w h i c hs h o w st h a ta m p h i y c a c ri sp r e d o m i n a n t l yl o c a l i z e di nt h e h e p a t i cc a e c u m ，e n d o s t y l e ，o v a r ya n dh i n d g u t ，a n dw e a k l yi nt h et e s t i sa n dg i l l i h i s s u g g e s t st h a ta m p h i y c a c rm a yb ean o v e lm e m b e ro fi s o c h o r i s t a m a s e s u p e r f a m i l y , w h i c hi sm a i n l yl o c a l i z e di nt h em i t o c h o n d f i a if r a c t i o n ，a n di sc a p a b l e o t li n t e r a c t i n gw i t ht h ec r e a f i n ek i n a s e t h eu b i q u i t o u se x p r e s s i o np a t t e r ns u g g e s t s t h a tb b y c a c rp l a y sac o n s e r v e df u n d a m e n t a lc e l l u l a rr o l ei nm n p h i o x u s ，l e n d i n g a d d i t i o n a ls u p p o r tt ot h ep r o p o s a lt h a tb b y c a c ri si n v o l v e di ne n e r g yt r a n s d u c t i o n t h ep r e d o m i n a n te x p r e s s i o ni nt h eg i l l ，h e p a t i cc a e c u m ，h i n d g u t ，e n d o s t y l e ，a n d o v a r ym a yb ei nl i n ew i t har a p i de n e r g yt n l t l o v e ri nt h e s et i s s u e s k e yw o r d s ：a m p h i o x u s ；e v o l u t i o n ；e x p r e s s i o n ；t h i o r e d o x i nr e l a t e dp r o t e i n ； y c a cr e l a t e dp r o t e i n 中国海洋大学博士学位论文 缩略语 a m p ( a m p i c i l l i n ) a p ( a l a k a l i n ep h o s p h a t a s e ) b c i p ( 5 一b r o m o 一4 一c h l o r o - 3 一i n d o y lp h o s p h a t e ) b p ( b a s e p a i r ) b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) e d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) d a ( d a l t o n ) d a b ( d i a m i n o b e n z i d i n e ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) d i g ( d i g o x i g e n i n ) d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) d n t p ( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) d t tf d i t h i o t h r e i t 0 1 ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e d t a ( t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a e e t i ca c i d ) e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) h r p ( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ) i p t g ( i s o p r o p y l t h i o n b d g a l a c t o s i d e ) k a n ( k a n a m y c i n ) m c s ( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ) m o p s ( 3 - o q - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d ) n a d h ( n i e o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e ) n b t ( n i t r o b l u et e t r a z o l i u m ) o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) p a g e ( p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) p c r ( p o l y m c r a s cc h a i nr e a c t i o n ) r p m ( r e v o l u t i o np e rm i n u t e ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) t r i s ( t r i s 一( h y d r o x y m e t h y l ) - a m i n o m e t h a n e ) u t r ( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) 氨卞青霉素 碱性磷酸酶 5 一溴4 一氯3 一吲哚磷酸盐 碱基对 牛血清白蛋白 互补d n a 道尔顿 二氨基联苯胺 焦碳酸二乙酯 地高辛 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 表达序列标签 辣根过氧化物酶 异丙基硫代半乳糖营 卡那霉素 多克隆位点 3 - ( n 玛琳代) 丙黄酸 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 氯化硝基四氮唑蓝 开放阅读框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 每分钾转数 十二烷基硫酸钠 三( 羟甲基) 氨基甲烷 非翻译区 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 j 鎏l 垫邀壹基焦益蔓生别主塑的! 奎蕉卫窒j 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 兰竺堕兰竺苎竺兰! 望墨塑竺兰里塑! 竺i 兰i 望! ! 里 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部fj 或机构( 如中国科学技术信息研究所等) 送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适崩本授权书) 学位论文作者签名：导师签 签字目期：弦叼年6 月c7 日 签字日期：年月同 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 青岛文昌鱼t r p l 4 和y c a c r 基因的表达及功能鉴定 第一章文献综述 1 文昌鱼新兴模式动物 1 1 文昌鱼的发现及种类分布 文吕鱼，最早是由德国生物学家p s p a l l a s 于1 7 7 4 年在英国c o r n w a l l 海 岸发现。1 8 3 4 年，意大利的0 gc o s t a r e n 命名为b r a n c h i o s t o m a ( 鳃口类) 。英国 人w y a r r e l l 在1 8 3 6 年命名为a m p h i o x u sl a n c e o l a t u s ( 双尖鱼，尖矛) 。根据命名 优先原则，b r a n c h i o s t o m a 作为属名，a m p h i o x u s 为英文俗名。文昌鱼共有2 9 个种，分布在热带、亚热带浅水海域中。目前研究较多的主要是三个种：分 布于西大西洋的佛罗里达文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a f l o r i d a e ) 、分布于东大西洋和 地中海地区的矛形文昌鱼( b r a n c h i o s t o m al a n c e o t a t u m ) 和分布于太平洋地区的 波罗洲文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e n ) 。三个物种约在一亿一千万年至一亿九 千万年前发生歧化( c a n e s t r o , e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 我国的文昌鱼有二属三种，分别是： ( 一) 文昌鱼属( b r a n c h i o s t o m a ) ，包含两种： ( 1 ) 厦门文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r ig r a y ) ，又称白氏文昌鱼，主要分 布于福建厦门同安刘五店、蒲田县平海至广东的南沃县，台湾海峡南部等海 区。文昌鱼的拉丁文中，b r a n c h i 是鳃的意思，s t o m a 是口，所以也称为鳃口类。 ( 2 ) 青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u e n s e ) ，主要分布于山东的 青岛和烟台以及河北的秦皇岛海区( 图1 1 ) 。 青岛文昌鱼t r p l 4 和y c a c r 基因的表达及功能鉴定 f i g1 - 1s e x u a l l ym a t u r ea m p h i o x a s 。文昌鱼基因组中含有 a m p h i n k 2 一j 和a m p h i p a x 2 5 8 两个基因分别是脊椎动物n k x 2 - 1 和p a x 的同源 基因。在文昌鱼的发育过程中，a m p h i n t c 2 - 1 基因最早是在神经胚的专孛经管和 腹部内胚层中开始表达，后来该基因的转录信号裁只局限在内柱原基的位置， 这种表达模式一直延续到被检测的一周幼虫( v e n k a l e s h 。1 9 9 9 ) 。而 a m p h i p a x 2 5 8 基因最初是在神经胚的神经管、原肾和肠中表达，到早期幼虫 则主要在咽的内胚层强烈表达，包含了内柱和鳃条的形成部位，到一周幼虫 时期就检测不到a m p h i p a x 2 5 8 的表达( k o z m i k ，1 9 9 9 ) 。文昌鱼a m p h i n k 2 一j 和a m p h i p a x 2 5 8 基因表达的研究结果与形态学观察和生化研究的结果是 致的，进一步证明了文昌鱼内柱和脊椎动物甲状腺之间的对应关系。 除了p a x l 9 基因与文昌鱼咽发育有关外，目前报道的文昌鱼内胚层发育 相关基因较少。因此，克隆内胚层发育相关基因并研究其表达模式，对于了 解脊椎动物内胚层发育机制以及这些基因的功链茏为重要。 1 2 青岛文昌鱼t r p l 4 和y c o c r 基因的表达及功能鉴定 2 硫氧还蛋白及相关蛋白研究进展 细胞内的氧化还原状态随细胞内的各种生理过程发生变化( c a ia n dj o n e s ， 1 9 9 8 ；k i d i n , 1 9 9 9 ；h u n e r , 1 9 9 7 ；