（细胞生物学专业论文）运用实时荧光pcr和dna芯片技术检测和鉴定食源性致病菌方法的研究.pdf

速用实时荧光? c r 和d 雠芯片技术检测和鉴定食溽性致病茸方法的研究运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检测和鉴定食源性致病菌方法的研究研究生：金大智指导老师：谢明杰曹际娟专业：细胞生物学研完方向：微生物分子生物擘摘要：食品中常见的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可导致多种疾病的发生，严重威胁着人们的健康，而且这些细菌大多数都难培养。目前，食品检验检疫工作中的细菌鉴定仍然停留在生化水平上，少数用于p c r 、免疫学、探针杂交等技术检测。快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原苗感染的前提条件。本文运用实时荧光p c r 、实时荧光r t - p c r 和d n a 芯片技术建立了快速检测食源性致病菌的方法。在实时荧光p c r 方法中，设计了小同的引物和探针可以特异的检测八种食源性致病菌，分别是单增李氏菌、肠出血性犬肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、副溶血性弧苗、沙r j 氏菌、空肠弯曲菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、志贺氏菌。以单增李氏菌为例，建立了基因组d n a 、细胞、定量分子质粒三种标准曲线进行定量检测，检测的灵敏度可达1 0 c f u m l ：并且运用实时荧光r t p c r 技术将单增李氏菌的死活状态进行区分：同时本文运用d n a 芯片技术建立了对常见食源性致病菌进行检测的方法，检测的目的菌株是雀乱弧凶、肠出血性夫肠杆苗0 1 5 7 ：h 7 、副溶血性弧凿、耶尔森氏凿、单增李氏菌、寓氏忐贺氏苗、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲菌。致病菌的d n a 分别通过自行设计的三对在1 6 sr d n a 、2 3 sr d n a序列上的通用引物在同一条件f 扩增后与d n a 芯片上的探针杂交，通过杂交结果可以看出设计的探针特异性强，并且相对于传统的方法操作简单、用时少，稳定性、重复性都1 l 常盘| f _ ，灵敏度可达到1 5 5 c f u m l 。上述实验结果表明运用丈时荧光p c r , 实时荧光r t p c r 录id n a 芯片技术所建立的四种检测方法准确、可靠、实用性强。是检测食品中常见致病苗技术水平的一次e 跃。并且使用d n a 芯片技术可一次实验搛作同时检测6运用实时荧光p c r 和d m 芯片技术拴测和鉴定食源性致病茸方法的研究八种食源性磐病菌本文所建立的四种检测食源性致病菌的方法为今后在食源性致病菌检测、鎏瓷领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定可靠的理论与技术基础。关键词：。实时荧光p c rr t - p c rd n a 芯片检测食源性致病菌7运用卖时莞光p c r 和d 芯片技术检测和娄定食糠性致病茵方法的研究文献综述1 食品中常见致病菌及常规的检测技术1 1 食源性致病菌危害的严重性食品是人类赖以生存和发展的物质基础细菌导致的食源性疾病自然成为了人们关注的焦点，世界上大多数国家都非常重视食品安全性问题。各国政府都采取了相应的措施控制和检测食源性致病菌，并以立法的形式来确保食品的安全，但由于天然的食物源生产的全球化、新的食品生产工艺的应用、人们饮食习惯的改变等各种冈紊在一定程度上降低了食品的安全性。据权威资料报道，病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。近年来，在世界范围内食品安全方血的恶性、突发性事件屡屡发生。继犬规模发生丁日本、欧洲、美国的人肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 食物中毒后欧洲和日本义出现了牛海绵状脑病( b s e ，俗称疯牛病) ，法国出现了李斯特氏菌的疾病“【，香港出现了禽流感比利时出现了_ 二嘧英，以及具有多重抗药性的鼠伤寒沙门氏菌在多国的流行等l ”。其中有的引起大最急性发病乃至死亡：据不完全统计，1 9 9 9年美国暴发了由冰激凌污染造成的沙门氏菌疾病估计有2 2 4 0 0 人患病：2 0 0 0 年全球有2 1 0 万人死于腹泻，大部分归因于食物和饮用水中致病菌的污染”1 ；全球每年约有1 4 0 0 0例忠贺氏菡病，估计发病人数达3 0 万。1 9 7 6 年在美国纽约暴发过一起耶尔森氏菌导致的疾病，有2 1 7 名学生感染。据f d a 统计，1 9 9 7 年美国加州等5 个州食源性疾病共为8 0 5 1 例，其中志贺氏菌引起的为1 2 6 3 例。自从1 8 1 7 年至今，在南弧地区霍乱弧菌引起的食源性疾病人暴发已达七次；j 二业化国家每年患食源性疾病者高达3 0 。例如，美国每年约有7 6 0 0 万例食源性致病菌导致的疾病，其中有3 2 5 0 0 人住院治疗，5 0 0 0人死亡；包括我国境内的江苏、浙江、安徽、山东等地在内暴发的人肠杆菌0 1 5 7 ：h 7食物中毒至今也导致近万人发病”。；2 0 0 1 年1 月7 日法国卫生部宣布，由丁受到单核细胞增生李斯特氏菌的污染，法国已有9 名食用受污染肉制品的消费者发病。其中两名死亡，其他人昏迷不醒”。而且据世界卫生组织( 删0 ) 统计报告表明，食源性疾病的实际发病率要比报告的病例数多3 0 0 - 5 0 0 倍，全世界的患病者以选数亿，并且每年的统计数值都居高1 i 卜，消耗了大量的人力和物力。在美国由7 种特定的食源性致病菌引起的疚痫花费和生产损火每年高达3 5 0 亿美元：沙氏菌特别是对儿种抗生素有耐药性的伤寒沙r j 氏菌的感染人群i 3 以上需要住院治疗，约3 的病例死亡运用实时荧光p c r 和d m 芯片技术检测和鉴定食番性致病菌方法的研究”1 。1 9 9 1 年秘鲁出现的霍乱弧菌污染导致鱼平鱼产黼年山口损火选5 亿美元。细菌污染造成的食源性疾病( 食物中毒) 也仍是我国食赫安全中最突出的问题。在我国，食源性致病菌如大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、耶尔森氏菌、创伤弧菌等被公认为主要的食源性致病菌。据卫生部统计，2 0 0 0 年共收到重大食物报告达1 5 0 起，中毒6 2 3 7 人死亡1 3 5 人”：2 0 0 1 共发生重大食物中毒事件1 8 5 起，1 5 7 1 5 人中毒1 4 6 人死亡”0 1 。这些由于各种因素导致的食源性疾病影响的国家范围之广、危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的，而且还给国家之间相关的食品贸易带来危机。这使得食品安全问题受到了空前的关注。这些事实也可以充分说明尽管现代科技已经发展到了相当的水平。但食源性致病菌导致的疾病不论在发达国家还是在发展中国家，都没有很好的被控制，仍然危害着人民的健康、食品安全面临着严峻的挑战。1 ，2 常见的食源性致病菌目前，常见的食源性致病菌有以 f 一些种类：单核细胞增生李斯特氏菌( 以下简称单增李氏菌) 属丁李斯特氏菌属，致病菌株的血清型一般根据菌体( 0 ) 为1 2 b 、1 2 c 、3 a 、3 b 、3 c 、4 a 、5 、i 2 a 和4 b ，后两型尤多“。是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中该菌在4 的环境中仍然可以生艮繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的土要病原菌2 一l 。沙门氏菌属于肠杆菌科嗜温性细菌，在常温、中性p h 、低盐和高农活度条什r 生长最佳。在伯杰细菌分类手册( 第8 版) 中对该属细菌作如f 描述：革兰氏阴性直杆菌，大小0 7 - i 5 x2 0 5 o p m “。沙门氏菌属含有许多种主要分为肠炎沙门氏凶利鼠伤寒沙j 氏菌等。沙门氏菌病潜伏期一股6 - 7 2 h r ，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛，病程一般卜2 天或者更欧，感染剂晕为1 5 2 0 个菌，死亡率达i - 4 。晟易感人群是年幼儿童、虚弱者、年欧老人、免疫缺陷者等。志贺氏菌属下忠贺氏菌属，其形态与一般肠道轩苗无明显区别，为革兰氏阴性轩菌，长约2 - 3 p m 宽0 5 - 0 7 p m 。不形成芽孢、无英膜、无鞭毛、有菌毛。d n a 的g + c为4 9 5 3 9 分子( t m 法) 。主要分为富氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌，人和灵艮类是忠贺氏绪的适宜寄主营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更易感染。志贺氏菌土要是经过水和i 食物传捅，只需少晕病菌( 至少1 0 个细菌) 进入体内就可引起细菌性痢疾，运用实时荧光p c r 和d m 芯片技术捡洲和鉴定食薄性致病茵方法的研究严重时可导致毒血症。副溶血性弧菌属于弧菌属中致病菌之一，是近2 0 年才被发现和重视的，其主要污染的食品有鱼类和贝类。尤其在夏秋季节的沿海地区常会出现含有副溶血性弧茁的海产品引起的暴发性食物中毒，主要能引起胃肠炎，常出现恶心、腹泻、腹部痉挛、呕吐、头痛等症状1 。空肠弯曲菌属于弯曲菌属，是7 0 年代命名的一群革兰氏阴性徽需氧菌，螺旋形，弯曲杆状：大小为( 0 2 _ 0 8 ) p t a x ( 0 5 - 5 ) 脚，有一个以上螺旋可长达8 m ，也可出现s 形或似b 翔的海鸥形菌体一端或二端有单根鞭毛。长度约为茁体的2 3 倍。有活泼的动力或不产生动力。该菌感染称为弯曲杆菌病，可引起腹泻是人类急性胃肠炎的常见病原菌1 。耶尔森氏菌属包括1 1 个种其中小肠耶尔森氏茵和与它关系十分密切的3 个同源群被作为耶尔森氏菌。该菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为( 1 - 3 5 ) i | m ( o 5 - 1 3 )帅，多单个散在。无荚膜，不形成芽孢，有周鞭毛。在3 0 1 2 以。f 有动力，而3 5 以上则无动力。该菌分布很广，猪的带苗率较高，日本报告检出率为“。加拿大为3 6 ，丹麦为1 0 - 1 7 ，是导致肠胃炎的只要病原苗。霍乱弧茵在伯杰细菌分类手册( 第8 版) 中作如一f 描述：该菌属革兰氏阴性兼性厌氧杆萄、弧萄辩、弧菡属中的一种，d n a 中的6 + c 平均含量为4 7 9 分子，大多数菌株的值介于4 5 4 9 9 分子“。霍乱弧菌导致的疾病称为霍乱，是流传时间长、影响范嘲广的一种食源性疾病，由于该菌在繁殖过程中产生霍乱肠毒素，系外毒素它促使肠黏膜细胞人量分泌肠液导致严重呕吐、腹泻，严重时出现脱水、腹部痉挛甚至死亡。肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 是1 9 8 2 年美国疾病控制中心和预防中心( c d c ) 在对密西根州和俄勒例州因食用汉堡包快餐而暴发的两宗溶血性腹泻进行流行病学调查时分离出来的，该菌具有菌体抗原( 0 抗原) 和鞭毛抗原( h 抗原) 7 ”“故称肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 。该菌属于肠杆科埃希氏菌属。革兰氏阴性，无芽孢。有鞭毛，可产生大量的v e r o 毒素( v t ) ，是主要的致病囡子。肠出血性人肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 感染剂量低，潜伏期为3 - 1 0 天，病程2 9 天。通常是突然发生剧烈腹瘸和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻部分患者可发展为删s 、t t p 等。严重者可导致死亡。传播途径为牛肉、生奶、鸡肉及其制品和蔬菜等牛肉为主要的传播载体i 。美国彝l 办口拿人的研0运用宾时荧光p c r 和d m 芯片技术检测和鉴定食l 再性致病菌方法的研究究显示：肠出血性火肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 感染致病比志贺氏苗更普遍“。据资料显示，美国每年约有2 0 0 0 0 人染上肠出血性火肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 病，其中约有5 0 人死于该病”。创伤弧菌是对人类危害较大的一种细菌该菌为革兰氏阴性短杆菌，多呈单个捧列无芽孢，无英膜，有运动性，有抗吞噬作用。需氧或兼性厌氧”。感染后不出现消化道症状，这是本菌区别于本属其它菌的一大特点。由于本菌对于糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、肝炎及原因不明的月= f = 功能障碍或其他重病患者的危害相当严重，特别是败血病病例，死亡率可高达5 0 。由于人类的感染不同，症状也有差别。经口感染的表现为发热、畏寒、衰竭等败血症症状；外伤感染首先在伤口的周围出现红斑，进而表现出急性炎症，皮肤病变明显，没有呕吐、腹泻等肠道症状。该菌通常以各种肉类为主要的传播途径“。以上简单介绍了一下常见的九种食源性致病菌，还有一些如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、腊状芽孢杆菌、肉毒梭菌等，由于本论文建立的三种方法所检测的致病菌中不包括这几种细菌，所以在这里就不进行介绍了。1 3 食源性致病菌检测技术应用的现状目前在实际的检验检疫工作中常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要有p c r 、s o u t h e r nb l o t 杂交、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 等一些简单的分子生物学希l 免疫学方法。质检总局动植物检疫研究所的朱水芳等运用p c r - e l i s a 亲和诱扑方法检测番茄环斑病毒：青岛局的寇运同等用p c r 技术检测食品中的单增李氏菌。；上海局的韩伟等运用p c r 和v i d a s 的方法检测食品中的弯曲菌属”1 ；覃文等运用v i d a s 法和a p il i s t e r i a 法对食品中李斯特菌进行检测和分类”：曹泽虹等用p c r 法检测肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、沙门氏菌、肠炎弧茵、金黄色葡萄球菌8 ；w 订l i a mp ce ta l 雨lr u d o l fae ta l 运用d n a 探针杂交法检测食品中的沙门氏菌”。：t o r t o r ag j 等和h a z e ld m k e l ld b 运用细胞计量术对牛奶中的单增李氏菌进行检测1 ”l 。周帼萍等用基因重组方法对志贺氏菌进行检测”“：白薇等运用p c r r d b 方法以1 6 sr d n a 为引物检测空肠弯曲菌和沙门氏苗“”：谢晓红等运用p c r 技术检测食品中的副溶血性弧菌1 。由于单增李氏菌的检测周期& 、菌属之间生化差别不明显等的特殊性，故对于该菌检测的研究相对比较多，d a m n o r t o n 等运用p c r 和d n a 足迹法检测熏鱼加：l ：业中的单增李氏菌，检测的灵敏度达到小于3 x 1 0 “；l 0 c o n n o r 等运用快速p c r 和d n a探引- 膜转移法检测食品中的单增李氏菌，将探针设计在1 6 sr d n a 上，检测的灵敏度为运用实时荧光p c r 和d h 芯片技术栓_ 疆 和鉴定食j 毫性致病茸方法的研究卜l o c f u m l ”“；m m a n z a n o 等运用p e r 和探针扑捉原位朵交的方法( o s e p h ) 检测食品中的单增李氏茵”“：g i o v a n n af r a n c i o s a 等p c r 技术和足迹法对侵袭和非侵袭性李氏菌病的单增李氏菌进行定性检测l ；a m s e w e l l 等用酶联荧光的方法检测食品中单增李氏菌i ：l r o k s y e h 等以鼠伤寒沙门氏菌的f i m y 作为检测的目的基因对其进行检测1 ，检测的灵敏度达到3 4 c f u m l ：m a r i j a 等以1 6 sr d n a 设计引物对肠炎沙门氏菌进行检测”：k e n j ih i r o s e 等选取t y v ( r f b e ) p r t ( r f b s ) ，酊a 占等基因用多重p e r 技术检测肠炎沙门氏菌。p i n am f r a t a m i c o 等用多重p e r 法快速检测食晶中的肠出血性人肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ”：g r c a m p b e l l 等用多重p e r 技术检测水中的肠出血性火肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 。”l 。w i r ej b w a n n e r 等用复合p e r 法快速、灵敏的检测耶尔森氏菌。：k h c h o w等p e r 技术以斤硝作为目的基因检测霍乱弧菌：c h k i m 等以n u c 为检测的目的基因，检测牛奶中的金黄色葡萄球菌“l 。e l i s a 技术也被广泛应用丁食鼎检测中a o a c甲在1 9 9 0 年就将e l i s a 作为检测沙门氏菌、单增李氏菌的官方方法1 。此外有报道称细菌的检测和鉴定还有使用物理希i 化学的方法，如电阻抗测量法、放射测鼍法、生物发光法、直接外荧光过滤技术和色谱的方法”“。1 4 上述的检测技术应用的不足我国目前对于食源性疾病的病原菌检测、鉴定手段仍停留在培养、血清和生化水平，检溺的周期相当长，一般达到7 - 1 0 天有些滩培养的致病菌如单增李氏菌的检测流程要达到2 0 天左右，在相当大的程度上限制了对食源性疾病病源食品的快速检测鉴定能力。并且在判断是否为阳性时只靠实验人员肉眼观察，没有足够可靠的依据，降低实验结果的准确性。一些简单的分子生物学的方法如p e r 、e l i s a 都有较高的假阳性结果出现，并且运用p e r 和e l i s a 得出的结果都不能作为晟终的检测依据。目前丹麦、澳人利弧等一些欧洲和澳洲国家食源性病原蓝的检测结果均综合实时荧光p e r 平e l i s a 两种技术在d n a 车蛋白质两种水平上检测的结果进行判断，并且实验操作只有l h r 左右。因此我国有必要建立起食源性致病菌的高通最、快速、准确的监测体系，以确保在相对较短的时间内正确判定食品的安全性，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要自h 提。只有这样才能在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害。提高我国食源性疾病的检测和控制能力，为加入w t o 后尽甲与其他国家达成通荚协议搭建雄厚的技术平台。2 实时荧光p c r 技术简介运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检测和鉴定食潭性致病茴方法的研究2 1 实时荧光p c r 及其定量检测技术的原理p c r 技术自问世以来，就因其高特异性和灵敏度而倍受推崇，在核酸的定量检测研究上也作了一系列的尝试，传统的定景p c r 方法包括内参照法、竞争法和p c r e l i s a方法。但是这三种传统定量p c r 方法一直面临着两大难题。即p c r 的假圈| 性污染和定量的准确度。用这些方法进行检测都依赖于各种刁i 同类型的p c r 后处理过程，而这些处理过程很易使数量巨大的p c r 产物飞散到空气中，形成气溶胶，使p c r 假阳性污染成为可能，而且电泳所用染色剂e b ( 澳化乙锭) 为强烈致癌物质若操作不当会严重危害操作者的健康。另一方面，所有这些方法的定量都是针对p c r 终产物来进行的，而p c r 的平台效应在一定程度上千扰了p c r 的原始模扳数景和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。2 1 1 荧光探针的技术原理实时荧光定量p c r 技术于1 9 9 6 年由美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司推出，由于该技术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且采用完全闭管检测，不需p c r 后处理，避免了交义污染。定量p c r 仪采用激光器光源进行实时监测。保证高能、稳定、无干扰的荧光激发由一系列透镜、滤镜和一个双色镜组成的光学系统将激发荧光聚焦到光谱仪上，光谱仪以问隔的方式将荧光按照波长的不同分开进入c c d 相机，序列检测应用软件从c c d 相机中收集这些荧光信号，对数据进行分析。从检测开始到定景结束，整个过程耗时短，操作方便。这种方法采用一个双标记荧光探针来检测p c r 产物的积累，可1 f 常精确、重复地定量基因拷贝数。实时荧p c r 所用荧光探针主要是基于荧光共振能景转移现象( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r f r e t ) 设计的。当一个荧光分子( 又称为供体分子) 的荧光光谱与兄一个荧光分子( 又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子白身的荧光强度衰减这种现象即是f r e t 。f r e t 现象发生程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一股为7 - 1 0n m 时即可发生f r e t ；随着距离延长，f r e t 星l 扩显著减弱。f r e t 现象已广泛应用于生物人分子内和分子间相互作用等生物学研究。f 运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术捡测和鉴定量潭性致病茴方法的研完2 1 2 实时荧光p c r 所用探针实时荧光定量p c r 所用荧光探针主要有三种：t a q m a n 荧光探针、杂交探针和分子信标探针二种，其中t a q m a n 荧光探针使用瑷为广泛。2 1 2 1t a q m a n 探针t a q m a n 技术是在普通p c r 原有的一对特异性引物基础上，增加了一条特异性的荧光双标记探针。t a q m a n 探针是一段5 端标记报告荧光基团，3 端标记淬灭荧光基团的寡核营酸。报告荧光基团如f a m 共价结合到寡核苷酸的5 端，t e t 、v i c 、j o e 及l t e x也常用作报告荧光基团。所有这些报告荧光基通常都被位于3 端的t a m r a 所淬灭。当探针完整时。由于报告基团与滓灭基团在位置上很接近，导致其报告荧光的发射主要由于f o r s t e r 型能量传递而受到抑制。当p c r 反麻进行到延伸阶段时，t a q 酶在引物的引导f ，以四种核菅酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链延伸进行到探制结合部位时，t a qd n a 聚合酶的5 - 3 外切活性将t a q m a n 探针水解成单核苷酸，报告荧光基团和淬灭荧光基团由于探针水解而相互分开，与此同时标记在探针上的报告基团游离出来，随后t a q 酶的57 _ 3 聚台酶活性使新链继续延伸，聚合结束合成完整的新链( 图卜1 ) 。t a q m a n 探针的3 端则经过化学修饰以防止其在p c r 过程中被延伸。探针与产物的结合发生于p c r 的每一循环但并不影响p c r 产物的指数积累。报告荧光基团与淬灭荧光基团的分离导致报告荧光信号的增加，而荧光信号的增加可被系统检测到，它是模板被p c r 扩增的直接标志。t a q m a n 探针水解有两个前提：第一，引物和探钊。都必须与模板结合( 杂交) ：第二二，与探制特异结台的d n a 模板得到扩增。基r 这两点要求。即使发生1 | 特异性扩增，也1 i 会影响检测结果“。如上所述，p c r 进行一个循环合成了n 条新链的同时就水解了n 条探针亦释放了相应数景的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与p c r 反应产物的最早对应关系。随着p c r 反应的循环往复p c r 产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个p c r 循环结柬时所测得的荧光值为纵坐标以p c r 循环数为横坐标作幽，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线一称为扩增曲线。当检测标本中含有所1 4运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检测和鉴定食漂性韭璃茵方法的研究要检测的靶核酸序列时，所得到的曲线早“s ”型；而当标本中h i 含靶核酸序列时则p c r 过程a i 发生探针1 i 被水解，也就检测不到荧光信号此时扩增曲线为一水平线( 幽l 一2 ) 。圈卜1 t a o 脚a n 荧光探针t 作原理图卜2 c t 值的确定图卜2 中的c t 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。c 代表循环( c y c l e ) ，t 代表阈值( t h r e s h o l d ) ，在荧光定景p c r 技术中，c t 值是一个很重要的概念。p c r 反应的前1 5 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阚值的缺省设置是3 - 1 5 个循环的荧光信号的标准偏差的1 0 倍。研究表明，每个模扳的c t 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，c t 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代c t 值。因此只要获得米知样品的c t 值，即可从标运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检测和善定食潭性致藕茵方法的研究准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。t a q m a n 探针的纯度在很大程度上决定了检测结果的真实性和可靠性。探引+ 的纯度直接影响探钳荧光本底的高低，任何标记报告基团而无淬灭基团的分子都是污染源，未淬灭的报告荧光使探针的荧光本底增高导致难以辨认由于探针裂解而产生的报告荧光的变化。同时由于探针标记不完全，即只标记了报告荧光素或只标记了淬灭荧光素或二者均朱标记上，这样即使荧光探针与扩增产物结合，也小能检测到荧光信号的增长，很容易造成假阴性。另外，镁离子浓度的高低也直接影响了检测的灵敏度。2 1 2 2 分子信标t y a g i 和k r a m m e r 首次建立了分子信标( m o l e c u l a rb e a c o n ) 探针。分子信标长约2 5n t ，在空间结构上量攀环结构( 圈卜3 ) 。分子信标一般包括三部分：环序列、苇杆部分和连接于苇杆两端的荧光分子。环序列是与靶核酸互补的探针，这一部分长度为1 8 2 0n t 环序列应与靶标分子完全互补；茎杆部分长约5 7n t ，由与靶序列无关的互补序列构成，往往由g c 含量较高的核苷酸组成以提高结台能并减少长度，茎杆部分结合能的避择要与杂交结合能相匹配。此部分的存在使信标分子的杂交特异性明显高于相应的线性探针；茎杆的两端连接两种荧光素，一端连接荧光分子，另一端连接淬灭分子荧光分子般连接在信标分子的5 端。当无靶序列存在时，分子信标里发昔结构，茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近( 7 1 0n m ) ，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，此时检测不到荧光信号，即发生了f r e t ：当有靶序列存在时，分子信标的环序列与粑序列特异性结合，探针白发进行构型变化。形成的双链体比分子信标的茎环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分开，此时荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收，可检测到荧光( 图i - 3 ) ”。常用的荧光淬灭分子对是5 乙( 2 乙氨乙基氨基奈一卜磺酸) ( e d a n s ) 和4 0 ( 4 0二甲基氨基叠氮苯) 苯甲酸( d a b c y l ) ”，采用d a b s y l 作淬灭剂是由于它对多种荧光素都有很强的淬灭效率。当受到3 3 6n m 紫外光激发时，e d a n s 发山波长为4 9 0n m 的亮蓝荧光：d a b c y l 是仆荧光分子，但其吸收光谱与e d a n s 的发射荧光光谱重叠。只有分适用实时荧光p c r 和d n a 甚片技术捡洲和鉴定食源性致病菌方法的研究子信标时，e d a n s 彝id a b c y l 距离非常接近足以发生f r e t ，e d k n s 受激发产生的荧光转移给d a c y l 并以热的形式散发不能检测到荧光；相反当有靶核酸存在时即可检测到荧光。圈卜3 分f 信标工作原理与t a q m a n 探针类似，分子信标也可加入核酸扩增系统中，对核酸扩增过程随时进行监测同时也可对扩增产物直接进行定量检渊。由于采用闭管检测，有效消除了核酸的交叉污染。此外可选择不同的荧光分子一淬灭分子对，设计产生不同荧光的多个分子信标( 又称为多色分子信标，m u l t i c o l o rm o l e c u l a rb e a c o n s ) 用于对多个靶核酸或核酸的不同位点同进检测。常用的荧光一淬灭分子对有：香豆素( c o u m a r i n ) ( 蓝荧光) 一d a b c y l = e a d n s ( 蓝绿) 一d a b c y l ：荧光索( f l u o r e s c e i n ) ( 绿色) 一d a b c y l ：荧光黄( 1 u c i f e ry e l l o w ) 一d a b c y l ：四甲基罗丹明c t e r r a m e t h y l r h o d a m i n ) ( 橙色) 一d a b c y l ：德克萨斯红( t e x a sr e d ) - d a b c y l 等，以上荧光一淬灭分子对的淬灭效率均超过9 5 即检测的荧光背景很低。影响分子信标探针构型变化的参数主要有：臂长、两臂g c 含最、环序列k 度和溶液盐浓度，尤其是二价刚离子如m 9 2 对两臂形成的杂交笨有较强的稳定作用，在m g 存在条件下，4 一1 2 个核督酸可形成稳定的杂交翠。环序列k 度至少麻是臂k 的2 倍，才能保证探针与目标d n a 杂交及荧光紊与淬灭剂分开。2 i 2 3 杂交探针运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检测和簦定食_ i 毫性致禹蕾方法的研究杂交烈探针技术就是在在普通p c r 基础上增加了一对荧光单标记的探针，两条探针均与引物结合区之间的病原体核酸发生特异性结合。并且结台后的两条探针之间只相隔l 一2 个碱基( 见图卜4 ) 。结台丁靶序列5 端上的探制。在其臼身的3 。端标记了一种荧光素( 荧光素a ，幽中以绿色表示) ：结合i 丁靶序列3 端上的探针在其自身的5 端标记了另一种荧光素( 荧光素b ，图中以红色表示) 。当两条探针均蟹游离状态时，b 不发荧光( 图卜4 一a ) ：而在p c r 的退火阶段，两条探针均与模板相结合，a 和b 之间发生了称之为f r e t 的能景转移a 所发出的荧光信号可以被b 所吸收而发出荧光，此时用一种特殊的检测仪器便可以接收到b 发出的光( 图1 4 一b ) ：随着引物介导的新链形成，两条探针披逐一从模板上取代下来( 图卜4 - c ) ：当两条探针由模板上被取代下来重新成为游离状态，仪器就检测不到b 所发出的荧光( 图i - 4 - d ) 。荧光素b 所发出的光强度与模板景成正比，随着p c r 的进行，模板景晕指数增良，探针与模板结合的景同比增眭，能最转移也同比增k 。检测每一个p c r 循环退火阶段荧光素b 的荧光强度，以所检测到的荧光量为纵坐标。以p c r 循环数为横坐标，便可如上所述得到如图卜2 中所显示的扩增曲线，从而实现了对未知标本进行定性及定量检测。幽卜4 杂交探针1 _ ：作鲧理在p c r 反应体系中，加入过景s y b r 荧光染料，s y b r 荧光染料特异性地掺入d n a双链后发射荧光信号，而不掺入链中的s y b r 染料分子小会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与p c r 产物的增加完全同步。2 1 3 实时荧光p c r 的特点实时荧光p c r 有三个特点：实现实时监测，消除交义污染；特异性强：定景结果1 8运用实时荧光p c e 和n h 芯片技术检疆i 币嗒定食菲性致病菌方法的研究准确。由于传统定量方法都是终点检测即p c r 到达平台期后进行检测，而p c r 经过对数期扩增到达平台期时，检测重复性极幕。同个模板在9 6 孔p c r 仪上做9 6 次重复实验，所得结果有很人差异。囡此无法直接从终点产物景推算山起始模扳晕。而实时荧光p c r 方法通过对每个样品c t 值的计算，根据标准曲线获得定景结果，定景实时荧光p c r 无需内标是建立在两个基础之上的：c t 值的重复性：p c r 循环在到达c t 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期( 对数期) ，此时微小误差尚朱放大，因此c t 值的重复性极好。即同一模板不同时间扩增或同一时间小同管内扩增，得到的c t 值是恒定的( 幽卜5 ) 。蹦i 一5c t 值的晕习l l 性e t 值与起始模板的线性关系；由于c t 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量p c r 是一种采用外标准曲线定量的方法。外标法定量和内标法定量的比较结果表明：内标法作为定量或半定最的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法，已得到全世界的公认，广。泛用于基因表达研究、转基因研究药物疗效考核、致病菌检测等诸多领域。2 2 实时荧光p c r 技术应用的现状2 2 1 实时荧光p c r 技术在致病菌方面的应用现状到目前为i h ，实时荧光p c r 技术在国外已经广泛应用于食源性致病菌检测及其他一些领域。在定量检测方面发挥了巨人作用，因为有些致病凿只有在一定浓度的情况卜才能发病，所以在定性检测的基础上，将检测结果定晕有继人的文际意义。据报道金人智、曹际娟等选取h l y a 基冈运用实时荧光p c r 技术检铡食品中单增李氏菌：a m a r ki b e k w e 笛运用实时荧光p c r 技术定景检测污水中e s c h e r i c h i ac o l i0 1 5 7 ：1 1 7 ,选取e s e 基因作为内源参_ ! l c ，检测的敏感度为6 4 x1 0 3c f i j m l 8 ”；陈苏红等用实时运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检测牵鉴定食潭性最病茵方法的研究荧光p c r 技术检测炭痕杆菌其灵敏度为1 0 3 c f u m l ”：蔡兰等用实时荧光p c r 技术检测常见的性传播瘸原菌1 ；廖晓兰、朱水芳等运用实对荧光p c r 技术对水稻白叶枯病菌和i 水稻细菌性条斑病菌进行检测：廖晓兰、泉水芳等还用实时荧光p c r 技术建立了t a q m a n 探针检测植原体的方法。d a n b i n gk e 等运用实时荧光p c r 技术检测链球菌b ：h e g ek a r i nn o g v a 笛用5 核酸法( 实时荧光p c r 法) 定晕检测水中和朱经过巴斯德消毒的牛奶，选取单增李氏苗的溶血素0 作为目的基因，检测灵敏度为6 6 0 c f u m 0 “；k e nt a k a i 等使用荧光探针定量检测古细凿群中的苗数1 ：t h e a ny e nt a n 等运用实时荧光p c r 技术鉴定血平板中抗青霉素的金黄色葡萄球菌，整个实验操作过程仅需2 h r ；d a v i df w a l l e r 等运用该方法定量检测食品中的空肠弯曲菌，这个方法不需要莳增菌的步骤，使检测更箍便”：j a m e sc m c a v i n 等使用实时荧光p c r 技术建立了灵敏度高、特异性强的检测肺炎链球菌的方法”。d a w n m a r i en o r t o n 等运用5 核酸法反转录定量检测m r n a 鉴定食品中的单增李氏菌”“。2 2 2 实时楚光p c r 技术在其他方面的应用现状实时荧光p c r 技术除了在细菌检测中广泛虑用外，在其它方匝也有应用。如在转基冈检测方面曹际娟等运用实时荧光p c r 技术检测肉骨粉中牛节源性成分”“：覃文、曹际娟等用实时荧光p c r 技术定最检测转基冈玉米m o n 8 1 0 成分“：曹际娟等运用实时荧光p c r 技术对转基因玉米g a 2 1 品系进行鉴定l ：潘良文等运用该方法对转基因抗草甘磷油菜内源特异参照基因b n a c c 9 8 和外源e 9 3 终止子进行检测l 。此外，在人类疾病检测与防治方面也有r 泛应用，c h i uc h i ny u a n 等使用实时荧光p c r 技术对人体细胞中的e r v - 3 基囡组进行定量检测i 。综上所述，实时荧光p c r 技术从发明以来的短短儿年间，已经j 泛麻用在分子生物学的备个领域，它给p c r 扩增技术带来了质的飞跃，它不仅可以将p c r 反应产物定量，而且省去了常规p c r 后的电泳，可以直接在反应仪器上观察实验结果。在减少p c r污染的同时，增加了实验的安全性，使实验操作更加简便3 实时荧光r t - p c r 技术在食源性致病菌检测方面的应用3 1r t p c r 技术的原理r t p c r 技术是基丁体内反转录的原理，在体外用反转录酶将m r n a 反转录成c d n a ，然后用c d n a 进行p c r 扩增，这样可以人人提高m r n a 的检测敏感度，从而实现r n a 的运用实时荧光p e r 和b n a 芯片技术检潮和鉴定食译性致病蕾方法的研究p c r 扩增。3 2 实时荧光r t - p c r 技术鉴别食源性致病菌死活状态的原理实时荧光r t - p c r 技术是在传统的r t - p c r 体系中加入用荧光标记的探针，以一步法、运用反转录酶和荧光探针通过使用t t h d n a 聚合酶在一个封闭的体系中完成反转录r ip c r 的步骤，致病菌的死活状态是依靠其白身的m r n a 作为检测标忠如果待检的目的菌株已经死亡，体内的m r n a 将很快降解，对其进行m r n a 提取年反转录检测，其结震为阴性；相反如果检测的目的菌株为活菌时体内有完整的m r n a ，用实时荧光r t k r技术检测的结果为阳性，即有增幅曲线出现。这样就可以避免对其d n a 扩增出现的最阳性问题。因为细菌在死亡后的一段时间内，d n a 是不被降解的。因此，不论目的菌株的死活状态检 铡结果均为刚性。那么就使检测结果小够准确。将r t p c r 和实时荧七p c r 技术完美的结合起来就可以在不用凝胶电泳观察而直接通过软件直接判断m r n a 存在与否，避免了由于操作造成的污染。这也是r t - p c r 技术的一次创新，在国内尚无此类文章发表。4 d n a 芯片技术简介4 1d n a 芯片技术的原理随着人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ) 的逐步实施及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物和微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以霸所未有的速度迅速增长“”。d n a 芯片( d n ac h i p ) 技术就是顺应这一科学发展要求妁产物，该技术是2 0 世纪9 0 年代初期发展起来的一fj 由分子生物学、微电子学、物翌学、化学、计算机科学等多学科交叉融合而成的高新技术，被评为1 9 9 8 年度世界十_ c =科技进展之一。d n a 芯片技术是继基冈1 ：程( 重组d n a 技术) 、聚台酶链式反应( p 嘧)之后，分子生物学技术发展的又一重大突破，不仅将推动分子生物学与生命科学的迅速发展，而且也将为阐明生命的本质，揭开生命之谜发挥重要的作用”1 。在h g p 计划启动后不久，美国的f o d e r 等在硅芯片表面涂布一种光敏材料，采哥光蚀刻技术，在光引导下原位合成多肽链。1 9 9 6 年底，综合应用生物科学、计算扎2运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检测和薹定食泺性致病菌方法的研究科学、数学等多种学科领域的多种理论和技术的世界上第一块d n a 芯片诞生。并在后来得到广泛的应用 i o id n a 芯片的原理简单地说就是核酸分子杂交( s o u t h c mb l o t 杂交技术) ，即利用d n a双链的特性，通过判断d n a 芯片上同定的火量已知序列的寡核苷酸、c d n a 或基因片段的探针与未知的靶分子进行变性、杂交，杂交发生与否采用荧光标记技术检测。其突出的特点是集成化、微型化、自动化l 。d n a 芯片操作的简单步骤为支持物的处理探针的制备点样样品的制备样品的标记样品的杂交杂交结果的检测”“。4 2d n a 芯片技术的种类4 2 1 按载体材料分类按照d n a 芯片所采用的载体材料将其分为砖芯片、陶瓷芯片、玻璃芯片、聚丙烯膜芯片和尼龙膜芯片等。目前，玻璃材料因易得、荧光背景低、应用方便等优点在国际上被，、泛接受。通常在玻片上连接活性基团比如氨基、醛基、巯基、氢氧基等使d n a 分子通过共价键或离子键牢固地固定在玻片上“。4 2 2 按点样方式分类根据d n a 芯片点样方式的不同，可将其分为原位合成芯片、微矩阵芯片( 分喷点利针点) 和电定位芯片。4 2 2 1 原位合成法原能台成法有三种制备方法，一是a f f y m e t r i x 公司采用的方法即显微光蚀刻法( p h o t o l i t h o g r a p h y ) ，将半导体中的光蚀刻技术运用到d n a 合成化学中。以单核苷酸或其他生物大分子为底物，在玻璃片或其他一些同相支持物上原位合成寡核营酸，以光敏保护基保护碱基的5 羟基。合成时利用光照射使光敏保护基脱保护，然后与光敏保护基、弧磷酰氨活他的碱基单体接触，在那些脱去保护基的地方合成寡核苷酸探针。每次循环都有特定的核苷酸结合上去，直到设定的寡核营酸长度：每个寡核茁酸片段代表一种特定的基因，存在丁d n a 芯片的特定能置上”。这种芯片的集成度较高，可返1 0 x 1 0 l 4 0 1 0 1 点阵c m 2 。但合成的寡核茁酸探针良度较短，一般为8 2 0 个核廿= 酸残运用实时荧光p c r 和d n a 芯片技术检洲和鉴定食潦性致病茵方法的研完基( n t ) ，最艮为5 0 个n t 。二是喷墨的原理将单核苷酸前体喷到设定的位置， 1 1 c ”ep h a r m a c e u t i c a l s 公司最先开发了压电打印法，以类似于彩色喷墨打印机的装置进行核酸台成，用四种碱基替代墨盒中的墨汁，在计算机控制下合成试剂被喷射在预设的底物位点表面所用合成技术也是冲洗、去保护、偶联笛常规的围相原位合成技术”“= 。7 。我国东南大学陆祖宏等用分子印章技术进行探针的原位合成也取得了成功”。这种方法是根据所需的微阵列设计制备有凹凸的微印章。然后根据预先的设计在刻好的印章上涂上对麻的单核营酸晟后按照设计的顺序将涂有不同的单核蕾酸的微印章逐个依次乐印在同一片上。然后利用可以自动进行清洗和脱保护，氧化及封闭等化学反应的液体流动池，按照设计的序列进行原位d n a 合成，直到得到所需的序列长度”。三是用物理方法如罩或物理障碍来限制前体物质的位置，同这种方法以复合的形式只需几步就能完成4 i 同的，但相关的序列的复杂矩阵：用环状或菱形的反应腔将前体物逐一加到介质表面上来制备扫描状或复瓦状矩阵。这种方法己用于杂交行为的研究l 。4 2 2 2 微矩阵又称d n a 微集芯片是以斯坦福大学p a t r i c kb r o w n 研究小组为代表制备的一类芯片，是将p c r 、分子克隆、d n a 合成技术等方法得到的寡核营酸、c d n a 片段落用制点或者喷点的方法直接排列到玻璃片等同相支持物上，从而制备成d n a 芯片。这种方法需要精密的打印装置，虽然芯片的集成度相对较低可达l l 一1 0 i 0 4 点阵c m 2 ，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成盼寡核苷酸片段，也可以采用来白基冈组的较k 的d n a 片段；可以是双链，亦可采用单链d n a 或r n a 片段，且技术实现未受到严格的专利控制，冈而近年来发展很快。原位杂交法与微矩阵相比，有以下的优点：原位合成直接从c d n a 数据库中得到信息合成寡聚核苷酸，避免了c d n a 样品获得及制备过程中的不确定因素而微矩阵法样品必须：事先准备和保存。原伉合成减小了片与片2 间的筹异可保证芯片的高精密度。原何合成法制备的芯片密度高，目前最高可达4 1 0 3 个寡核茁酸i 6c m ! 。而微矩阵目前是高只有6 4 5