（遗传学专业论文）人类新基因arhgap19的克隆和初步功能研究.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导f 进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特另j ) j n 以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均己在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：日期 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名： 日期： 人类新基因a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 摘要 r h o 家族蛋白参与各种细胞过程如细胞骨架重组织、细胞周期调控、基因 表达调控等。r h o 家族蛋白g t p 酶激活蛋亡l ( r h og t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n s ， r h o g a p s ) 是r h o 家族蛋白的负调控因子。所有的r h o g a p 蛋白都含有一个r h o g a p 结构域，它可以刺激r h o 家族蛋白内在的g t p 水解酶活性，使激活的r h o 能够 及时灭活。 本实验室经大规模e d n a 测序从人胎脑e d n a 文库中克隆到l 条全新的含 有r h o g a p 结构域的e d n a ，长2 3 0 9 b p ，与a r h g a p l 9 具有相同的开放阅读框， 编码一4 9 4 个氨基酸的蛋白质，预测的分子量为5 5 8 0 6k d a 。蛋白结构域分析显 示该蛋白除含有r h o g a p 机构域之外还含有一个双向的核定位信号，这与该蛋白 的亚细胞定位实验结果一致。a r h g a p l 9 定位于1 0 号染色体q 2 4 1 区段，通过 b l a s t n 发现该基因含有1 2 个外显子。在组织表达谱分析实验中发现在测试的1 6 个成人组织中只有在胰腺，脾，胸腺，卵巢组织中有微弱表达，而在测试的8 个重要胎儿组织中均有很高的表达量，表达谱结果显示该基因可能与胎儿的发育 有关，也提示了其在成人组织中的功能。通过组织表达谱分析、绿荧光蛋白定位 等技术，初步得出该基因可能在个体的发育过程中起着重要作用。 关键词：a r h g a p l 9 基因，r h o g a p 结构域，r h o 家族蛋白，生物信息 学分析，克隆，r t - p c r ，表达谱分析，亚细胞定位 人类新基困a r h g a p l 9 的克隧和初步功能研究 a b s t r a c t r h og t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n s ( r h o g a p s ) a r en e g a t i v er e g l d a t o r so fr h o f a m i l yp r o t e i n st h a ta l ep r o p o s e dt op a r t i c i p a t ei n av a r i e t yo fc e l l t d a re v e n t s i n c l u d i n gr e o r g a n i z a t i o no fa c t i ne y t o s k e l e t o n , g i c e l l c y c l ep r o g r e s s i o n , g e n e e x p r e s s i o na n ds oo n a l lt h er h o g a p sc o n t a i nac o n s e r v e dr h o g a pd o m a i n , w h i c h a c ta ss t i m l a l a t i n gt h ei n t r i n s i cg t ph y d r o l y s i sa c t i v i t yo f r h o h e r ew ei s o l a t e dan o v e lr h o g a pd o m a i n - c o n t a i n i n gp r o t e i ng e n eo f2 3 0 9 b p f r o mh u m a nf e t a lb r a i ne d n a l i b r a r yw i t ht h es a n l er e a d i n gf r a n l ew i t l la r h g a p l 9 g e n e ，w h i c hh a sa l lo r f o f1 4 8 5b pe n c o d i n gap u t a t i v ep r o t e i no f4 9 4a m i n oa c i d r e s i d u e sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f5 5 8 0 6k d a p r o t e i np a t t e r na n a l y s i s s h o w st h a ti tc o n t a i n sab i p a r t i t en u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a lb e s i d e st h er h o g a p d o m a i n , a n di ti sc o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l to f s u b - c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n a r h g a p l 9i s l o c a t e di nc h r o m o s o m e1 0 q 2 4 1a n dc o n s i s t so f1 2e x o n sa c c o r d i n gt ot h eb l a s t n r e s u l t w e a ke x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di na d u l tp a n c r e a s ，s p l e e n , t h y m u sa n do v a r yo f t h e1 6a d u l tt i s s u e se x a m i n e d ，w h i l ei th a dam o r ea b u n d a n te x p r e s s i o np a t t e r ni n8 i m p o r t a n th u m a nf e t a lt i s s u e s t h ee x p r e s s i o np a t t e r no fa r h g a p l 9s h o w si tm a y h a v ef u n c t i o n sr e l a t e dt of e t u sd e v e l o p m e n ta n dg i v e su ss o m ec l u e so ni t sp r o b a b l e f u n c t i o n si na d u l tt i s s u e s b a s e do nt h er e s l t l t so fe x p r e s s i o np r o f i l e ，s u b c e l l o a a r l o c a l i z a t i o ni d e n t i f i c a t i o ne r e w ep r i m a r i l yt h i n kt h a tt h eg e n em a yp r a ya l l i m p o r t a n tr o l ei ni n d i v i d u a ld e v e l o p m e n t k e yw o r d ：a r h g a p t 9g e n e ，r h o g a pd o m a i n , r h of a m i l y p r o t e i n s , b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s , c l o n i n g , r t - p c r , e x p r e s s i o np a t t e r n , s u b - c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n a b b r e v i a t i o n s ：g a p s r h og t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n s ；k b k i l o b a s e ( s ) o r 1 0 0 0 b p ；k d a k i l o d a l t o n s ；n l s n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l 2 人类新基因a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 第一章前言 一r h o 家族 小g t p 结合蛋白( g 蛋白) 是一类能和g t p g d p 结合的分子量在2 0 3 0 k d a 左右的蛋白。到现在为止，已发现超过1 0 0 种小o 蛋白，它们存在于从酵母到 人类的所有真核细胞中，组成了一个庞大的蛋白超家族。根据蛋白结构的相似性， 这个超家族可分成至少五个家族：r a s ，r a b ，r h o ，s a r l a r f 和r a n 。 r h o 表示r a s - h o m o l o g o u s ，其蛋白家族成员有：r h o ( 包括r h o a ，r h o b ， r h o c ) ，c d c 4 2 ( c d c 4 2 h s 和g 2 5 k ) ，g a c ( 包括r a c l ，r a c 2 ，g a c 3 ) ，t c l 0 ，t r f ， r h o g ，r h 0 6 r n d l ，r h 0 7 门陋d 2 ，r h 0 8 r n d 3 ，r h o e ，砒1 0 d 和r h o h 。其中研究 的最多的是r h o a ，r a c l 和c d e a 2 h s 三个成员蛋白。经过十几年的工作，现在 对r h o 家族蛋白的功能和活性调控都有了比较全面的了解。 r h o 家族蛋白的功能 r h o 家族蛋白广泛参与细胞内的各种过程，主要包括参与肌动纤维细胞骨架 的重组织、控制细胞生长、基因转录调控、参与调控细胞粘附和迁移，小泡运输， 分泌，吞噬，轴突生长，胞质分裂等。 表1 总结了r h o ，r a c 和c d c 4 2 参与的胞内活动。 a c t i ns r f j n k p 3 8 n f n “a j d a s c p d h 雀渊c e l l - c e l ls e c r e t i o n 出t r a n s f o r m a t m +?+ 表1 r h o ，r a e 和c d c 4 2 参与的胞内活动。这些途径能被激活的r h o 家族蛋白诱导或能被 显性负效应的r h o 家族蛋白抑制。n a p d h 氧化酶复合体只存在于某些吞噬细胞中，有r h o 蛋白参与的分泌只限于m a s t 细胞。本表来自b i s h o p a l ，h a l i 九b i o c h e m j 2 0 0 0 j u n l ：3 4 8 p t2 ：2 4 1 5 5 r h o 蛋白的活性调控 和其他小g 蛋白一样，r h o 家族成员蛋白也结合g 卯俺d p 。当细胞处于静 息状态时，r h o 家族蛋白和g d p 结合，没有活性；当细胞受到某些刺激的时候， 结合的g d p 被换成g t p ，r h o 家族蛋白被激活而可以和下游蛋白作用；完成作 用之后结合的g t p 又被水解为g d p ，r h o 家族蛋白回到原来的无活性状态。有 3 类蛋白参与r h o 家族蛋白的这一活性循环。 1 ) 、鸟苷酸解离抑制因子( g u a n i n en u c l e o t i d ed i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r s ，g d i s ) g d i s 和g h o g d p 结合，抑制g d p 从r h o 蛋白解离。它结合在r h o 蛋白的 c 端，还使r h o g d p 从细胞膜上脱离下来并阻止其与膜再结合。细胞在静息状 3 慧一 人类新基因a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 态下，r h o 蛋白绝大部分以g d p 结合的形式和g d i s 形成复合体存在于细胞质中。 g d i s 与r h o 分离是g d p 换成g t p 必需的，但分离机制现在还不清楚。 2 ) 、鸟苷酸交换因子( g u a n i n en u c k o f i d ee x c h a n g ef a c t o r s ，g e f s ) g e f s 又称g d p 解离刺激因子( g d pd i s s o c i a t i o ns t i m i il a t o r s ，g d s s ) ，其主 要功能是使g d p 从r h o 蛋白解离，从而促使r h o 蛋白和g t p 的结合，因为胞 内g t p 摩尔浓度大约是g d p 的l o 倍。r h o 蛋白的g e f s 都有两个共同的结构域： 一个是d b l - h o m o l o g y ( d h ) 结构域，它是体外g e f 活性必需的；另一个是p h ( p l e e k s t r i nh o m o l o g y ) 结构域，决定着g e f s 在胞内的正确定位。有些g e f s 的p h 结构域是d h 结构域的负调控因子，p h 和d h 结合形成自抑制，当p i p 3 和p h 结构域结合时才释放d h 结构域。 3 ) 、g t p 酶活化蛋白( g t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n s ，g a p s ) r h o 蛋白有内源性的g t p 水解酶活性，但活性很低，g a p s 能促进这种活 性，从而加速r h o 蛋白水解结合的g t p 。有关g a p s 的内容详见下文。 二r h o g a p 蛋自 由于r h o 家族蛋白自身的6 t p a s e 活性很弱，因此它被激活后的活性持续时 问主要是由r h o g a p 蛋白决定的。r h o g a p 蛋白可以极大促进r h o 家族蛋白的g t p 水解酶活性，如p 5 0 r h o g a p 可使r h o a 的g t p 水解酶活性提高1 0 5 倍。 r h o g a p 蛋白的发现 最早发现含r h o g a p 结构域的蛋白是在1 9 9 1 年。在这之前已经在人类脾脏 抽提物中分离出一个2 9 k d a 的蛋白具有r h o g a p 活性，对这个蛋白部分测序后在 s w i s s p r o t 数据库中搜索出了话个蛋白：b e t 和n c h i m a e r i n ，它们成为最先找 到的含r h o g a p 结构域的蛋白。后来发现分离到的2 9 k d a 蛋白其实只是一个更大 蛋白( 5 0 k d a ) 的一部分，这个蛋白到1 9 9 4 年才获得完整序列，称为p 5 0 r h o g a p 。 自从第一个r h o g a p 蛋白被找到以后，发现的r h o g a p 蛋白越来越多，迄今 为止( 2 0 0 4 5 1 0 ) ，用c d a r t ( c o n s e r v e dd o m a i n a r c h i t e c t u r er e t r i e v a lt o o l ， b 逝；丛凸坚盟n 蝤：趔塑：西b ：殴型墨地! 曲! 丝d 经也醛q 趔壁i n 豳n ：g 西) 在g e n b a n k 数据库 中查到的含有r h o g a p 结构域的蛋白序列共有约8 0 0 条( 见图1 ) 。对于为什么会 有如此多的r h o g a p 蛋白( 比r a s g a p 蛋白多的多) ，目前还没有合理的解释。不 同的组织分布是个原因，但不是主要的，因为大部分r h o g a p 蛋白都是广谱表 达的( 见表2 ) ；底物特异性和催化能力不同可能是另一个原因；另外，不同的 r h o g a p 可能被限制在胞内不同的部位起作用，因为很多r h o g a p 蛋白都有蛋白相 互作用的结构域或膜结合的结构域( 见图1 ) 。 4 人类新基冈a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 图1 g e n b a n k 中含有r h o g a p 结构域的蛋白汇总。具有相同蛋白结构的被并为一类。图中红 色长方形代表r h o g a p 结构域。 主要r h o g a p 蛋白的组织分布和底物特异性 不同的r h o g a p 有不同的底物特异性和组织分布( 例子见表2 ) 。体外实验获 得的底物特异性可能比体内实际的底物特异性要宽，如p 5 0 r h o g a p 在体外可以刺 激r h o ，r a c ，c d c 4 2 的g t p 酶活性，但在体内却只能和r h o 作用。 5 人类新基闻a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 表2 ：哺乳动物一些含r h o g a p 结构域蛋白的底物特异性和组织分布。本表是在a e l s tl ve t a l , g e n e sd e v e l o p m e n t1 9 9 7 ：1 1 ：2 2 9 5 2 2 表2 基础上补充而来 r h o g a p 蛋白的催化机理 r h o g a p 结构域大约长1 5 0 个氨基酸，含该结构域的不同蛋白的同源比对表 明它们的r h o g a p 结构域的相同程度( i d e n t i t y ) 在2 0 一4 0 之间，其催化反 应的本质是促进r h o 家族蛋白的g t p a s e 活性。近些年从结构角度开展的研究使 得我们对r h o g a p 蛋白的催化机理有了更深入的认识。 尽管r h o g a p 结构域与其他g a p 蛋白家族( 例如：r a s g a p ) 的结构域不尽相 同，但它们在肽链的折叠方式以及基本的催化机理上似乎是相同的。r h o g a p 结 构域含有9 个a 螺旋和一个处于“环”结构中的高度保守的精氨酸残基。它与 r h o 蛋白的s w i t c hi ，s w i t c h i i 区域以及p - 环相互作用，而这三者刚好是r h o 蛋白结合g t p 的核心区域( 图2 ) 。将c d c 4 2 6 a p 催化反应的基态( 小g 蛋白与一 种不会水解的g t p 类似物g m p p n p 连接) 和过渡态( 小g 蛋白与g d p 和a 1 f 3 结合) 相比，会发现g 蛋白相对于g a p 的位置发生了一个2 0 度的旋转。这种构 型变化将会使r h o g a p 的精氨酸残基处于r h o 蛋白的活性位点上，并使过渡态得 到稳定。接着，精氨酸与g t p a s e 的第6 1 位谷氨酰胺相互作用，使其稳定。这个 谷氨酰胺残基的作用是负责安置一个与催化有关的水分子，它的的稳定将限制水 分子的自由，降低g t p 水解的能障。从而提高r h o 家族蛋白的g t p a s e 活性。但 是，还有一个问题需要解决：当r h o g a p s 和r h o 家族蛋白成对反应时r h 0 6 a p 的 底物特异性是如何获得的? 因为突变研究已证明r h o 蛋白的s w i t c h 和p - l o o p 之外的区域确实参与了r h o g p 的特异性形成。 在生化水平上，p 5 0 r h o g a p 的g a p 结构域催化c d c 4 2 一g t p 的反应动力学参数 已经被测定。p 5 0 r h o g a p 和c d c 4 2 - g t p 迅速结合并达到平衡，二者结合不是反 应的限速步骤；用不同的r h o g a p 蛋白和c d c 4 2 作用发现催化效率和亲和常数成 正比；p 5 0 r h o g a p 和c d c 4 2 一g d p 不能结合，说明反应产物对反应无抑制作用。这 与r h o a 不同，r h o a g d p 和g a p 还有相当的结合能力，这表明了不同r h o g a p 蛋 白对r h o 家族蛋白在催化动力学上的多样性。另外还发现了m 9 2 + 在该反应中的作 用：r h o 家族蛋白结合g t p 不需要m g ”，但m g ”能够稳定r h o - g t p ，r h o g a p 对r h o 家族蛋白的催化作用在2 + 存在条件下可提高1 0 倍，而且特异性增强。 6 人类新基因a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 图2 r h o g a p 的催化机制 ( a ) c d c 4 2 g a p 与c d c 4 2 - g m p p n p 反应的基态的晶体结构；( b ) c d c 4 2 - g d p - a i f 3 - c d c 4 2 g a p 复合物结构，r h 0 g a p 催化反麻过渡态结构模拟；( c ) c d c 4 2 g a p 第3 0 5 位置的精氨酸突变为丙氨酸后，c d c 4 2 g a p 催化反应过渡态的模拟结构。与( a ) 中的基 态构型相比，过渡态复合物中c d c 4 2 的位置相对于g a p 结构域旋转了2 0 度。在c d c 4 2 g a p 和c d c 4 2 - g d p a i f 。复合物中，c d c 4 2 的两个s w i t c h 区域被c d c g a p 稳定。其中a i f 。的作_ i h 是： 模拟g t p 的y 磷酸。c d c 4 2 g a p3 0 5 位置精氨酸的突变使得g a p 的a - a i 环的活动性增强，从 而减弱了这个环和c d c 4 2s w i t c h i i 区域间的氢键( c ) ，导致c d c 4 2 第6 l 位的谷胺酰胺错位 且不能正确安置水分子。 r h o g a p 蛋白的活性调控 含有r h o g a p 结构域的蛋白一般都比较大，大多数还含有其他结构域如p h 、 s h 2 、s h 3 等。很可能r h o g a p 除了可以促进6 t p 水解以外，还在细胞信号转导中 有更多的作用，这一猜测已在n c h i m a e r i n 上得到证实。研究发现它除了有对 r a c 的g a p 活性外，其n 端不含g a p 结构域的一段区域还可辅助r a c i 和c d c 4 2 蛋白诱导细胞骨架形态改变，这一功能是与g a p 活性相独立的。另外，p 1 9 0 g a p 可以和p 1 2 0 r a s g a p 结合形成复合体，可能在r a s 和r h o 信号途径的交互协调中 起桥梁作用。 由于很多r h o g a p 蛋白都是广谱表达的，因此它们在细胞内必须受到小心的 调控，才能使r h o 家族蛋白在必要的时候能被激活。r h o 家族蛋白激活有两个模 型( 见图3 ) ：模型1 认为细胞静息时r h o g a p 和r h o g e f 活性是都受到抑制的， 当细胞受到刺激时r h o g a p 和r h o g e f 活性都增强，但r h o g e f 活性增强程度更大， 使平衡向r h o g t p 方向移动；模型2 认为细胞静息时r h o g a p 和r h o g e f 都是有活 性的，但r h o g h p 活性更强，当有刺激信号时r h o g e f 活性增强，而r h o g a p 活性 受到抑制，r h o g t p 因而大大增多。有实验证据支持模型2 ：抑制r h o g a p 的活性， 在r h o g e f 未被激活时就足以诱导r h o 蛋白介导的肌动纤维重组织。无论哪种模 型，r h o g a p 蛋白活性在r h o 家族蛋白激活前后都有很大变化，这说明对r h o g a p 7 人类新基闻a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 蛋白的活性调控是r h o 信号途径中很重要的一环。有研究表明r h o g a p 蛋白的非 r h o g a p 结构域部分会影响到其g a p 活性，如b c r 的r h o g a p 结构域比全长蛋白具 有更强的g a p 活性，n - c h i m a e r i n 的一段c y s 富集区能结合脂类，这种结合直接 影响到其体内的g a p 活性，p 1 9 0 g a p 的g a p 活性受到其n 端的g t p 结合结构域的 调节，p 5 0 r h o g a p 的c 端一个区域对g a p 活性是必需的。但目前对r h o g a p 蛋白 的活性调控方面的工作还很少。 图3 r h o 家族蛋白激活的两个模型。本图来自s y m o n sm ，s e t t l e m a nj ，t r e n d sc e l lb i 0 1 2 0 0 0o c t ；i 0 ( 1 0 ) ：4 1 5 9 图2 。 本实验室经大规模c d n a 测序从人胎脑c d n a 文库中克隆到1 条全新的c d n a ， 长2 3 0 9 b p 。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白有一个r h o g a p 结构域，是一 个典型的r h o g a p 蛋白，暂时将该基因命名为# 3 u - i g a p b 。本论文从生物信息学、 基因的组织表达谱、产物胞内定位等方面研究了该基因的功能。 人类新基阳a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 第二章材料和方法 一生物信息学软件及数据库 n c b i 数据库：h ! l 乜；z z ! ! ! 型：垒! b i ：翌! 坠! i 垫：g q ! p r o s i t e 数据库：丛地；! 墨殴z ：b z 塑! ! ! ! ! 匹i ! ! s m a r t 数据库：h t t p ：s m a r t , e m b l - h e i d e l b e r g , d e d n a m a n 软件：l y n n o nb i o s o f t 公司( h t t p ：删1 y n n o n e o m ) d n a s s i s t 软件、p r i m e rp r e m i e r5 。 二实验所需质粒的构建 本论文中共需构建各类质粒3 种，见下表。 名称载体抗性插入片段内切酶( 5 - 3 )用途 2 4 b r g a p p e t 2 4 b ( n o v a g e n ) 卡那 1 2 b p - 1 4 9 3 b p e c o r i x h o l 原核表达 3 2 a r g a p p e t 3 2 a ( n o v a g e n ) 氨苄 1 2 b p 1 4 9 3 b p e c o r i x h o l 原核表达 g f p r g a p p e g f pc l ( c l o n t e c h ) 卡那 1 2 b p - 1 4 9 3 b p x h o l e c o r i 绿荧光定位 材料与仪器 1 e l o n g a s e 酶 2 t a q 酶 3 e c o m 内切酶 4 i 内切酶 5 t 4 l i g a s e 6 d n a m a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) 7 质粒抽提试剂盒 8 p c r 纯化试剂盒 9 割胶回收试剂盒 l o 载体 1 1 p c r 仪( 9 6 0 0 ) 1 2 引物： 2 4 b r g a p 3 2 a r g a p ： g i b c ob r l 生工 n e w e n p j a n db i o l a b s n e w e n g l a n db i o l a b s n e we n g l a n db i o l a b s t a k a r a q t a o e n q t a o e n q i a o e n 见上表 p e r k i ne l m e r 上游：q 鱼丛卫a t gg c ga c tg a gg c ac a ga g tg a a e c o r i 下游：c c g c t cg a gg a g 从at c ct t tt t tc c cc t ct t tc 9 人类新基因a r h g , d a l 9 的克隆和初步功能研究 x h o i g f p r g a p ： 上游：c c c t cg a gg g a t gg c ga c tg a gg c ac a ga g tg a b x h o l 下游：c g g a a ”cc g g a ga a at c ct t tt t tc c cc t ct t tc e c o r i 注：所有引物都加酶切接头和保护碱基，e c o r i 的保护碱基是c g ，x h o i 的保护碱基是c c 。 试剂 1 0 5 m o l ie d t a( p h8 05 0 0 r a l ) ： e 叫a n a ：( 7 - - 胺四乙酸二钠) 9 3 0 6 9 ，加入3 0 0 r a l 水和l o m l l o m o l ln a o h ，调 p | i 至8 o ，加水定容至5 0 0 m 1 ，分装后高压灭菌，备用( 或过滤后就无需灭菌) 。 2 t f b i ( p h5 8 ，5 0 0 m 1 ) ： 3 0 删 乙酸钾( m w = - 9 8 ) 1 4 7 9 l o m m氯化钙( y a r = - 1 4 7 ) 0 7 4 9 5 0 m m氯化锰( m w = - 1 9 8 ) 4 9 5 9 l o o m m 氯化铷( m w = 1 2 1 )6 0 5 9 1 5 甘油7 5 m i 无水甘油 加入2 0 0 m lm i l l i - q 水搅拌溶解后，加无水甘油7 5 m i ，用1 m 乙酸调节p h ( 5 8 ) ， 定容至5 0 0 m i ，过滤备用( 滤纸灭菌，试剂无需灭菌) 。 3 t f b 2 ( p h6 5 ，1 0 0 m i ) ： 1 0 删m o p s ( 1 h r = - 2 0 9 ) 0 2 0 9 2 7 9 7 5 删氯化钙( m f l 4 7 ) 1 1 0 2 6 5 9 l o m m 氯化铷( m w = - 1 2 1 ) 0 1 2 0 9 2 9 1 5 甘油1 5 m i 无水甘油 加入5 0 m lm i l l i q 水搅拌溶解后，加无水甘油1 5 m l ，用i mk o h 调节p h ( 6 5 ) ， 定容至l o o m l ，过滤备用( 滤纸灭菌，试剂勿灭菌) 。 4 1 mm g s 0 4 ( 2 0 0 m i ) ： 硫酸镁( m g s o 7 h 2 0 ) 4 9 3 9 ，加入l o o m lm i l l y - q 水加热搅拌溶解，定容至 2 0 0 m i 灭菌备用。 5 氨苄青霉素( 5 0 m g m 1 ) ： 称取o 5 9 干粉，加l o m l 水，过滤除菌，0 5 m l 管分装。 6 卡那霉素( 1 0 0 m g m 1 ) ： 称取1 9 干粉，加i o m i 灭菌水吹打溶解后，过滤除菌，0 5 m i 管分装。 1 0 人类新基因a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 7 l b ( 5 0 0 蛐1 ) ： p o l y p e p t i o n ( 蛋白胨) 5 9 y e a s te x t r a c t ( 酵母提取物) 2 5 9 n a c l 5 9 加水3 0 0 n 1 1 使溶解，用i o mn a o h 调p h7 o ，定容至5 0 0 m l ，灭菌备用。固 体培养基加6 9 琼脂糖。 8 t e 缓冲液( p h8 01 0 0 0 m i ) ： 1 0 m mt r i s h c lp h8 o l m me d t a p h8 0 取i m o l lt r i s - h c lp h 8 0l o m l 和0 5 m o l 1e d t ap h 8 02 m l ，加水定容至 1 0 0 0 m 1 9 3 m 乙酸钠( s o d i u ma c e t a t e p h5 2 1 0 0 l l l l ) ： 称取n a a c3 也o4 0 8 2 4 9 ，加8 0 r a lm i l l i 一0 水溶解( 必要时加热) ，用水定容至 此l o o m l ，过滤后分装或灭菌备用。 p h 5 2 用冰乙酸调节p h 7 0 用稀乙酸调节 l o 1 0 t a e ( t r i s 一乙酸 p h 8 ，0 1 0 0 0 m 1 ) ： 称取t r i s4 8 4 9 ，先用3 0 0 1 1 1 1 水溶解后，加入1 1 4 m l 冰乙酸和2 ( h m0 5 m o l i e d t a ( p h8 0 ) ，然后加水定容至1 0 0 0 m l 。 方法 1 p c r 扩增插入片段 p c r 体系如下： 1 0 p c r d n t p ( 各5 吲物3 吲物 模板 组分水 t a q 酶 b u f f c r 1 0 m m )( 1 0 山v 1 )( t o m )( 1 0 n g p 1 ) 体积( “1 ) 3 9 5 ll1l2 反应条件：9 4 2 分钟，9 4 3 0 秒，6 4 3 0 秒， 7 z c6 0 秒， 7 2 c5 分钟，4 。一循环3 0 次。 p c r 产物用q i a g e np c r 纯化试剂盒纯化。 2 酶切连接载体和插入片段 酶切体系： l 缓冲液( e c o r i d n a i 组分才( b s a ( 1 0 m g m 1 )e c o r i x h o i f b u f f e r )( 1 0 0 n g p 1 ) 协积( 山) 3 2 55o 5l11 0 反应条件：3 7 。c 水浴2 小时。 反应结束后用q i a g e n 割胶纯化试剂盒割胶纯化酶切产物。 人类新基嗣a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 连接体系： l 载体插入片段 l组分 水1 0 x b u f f e rt 4 连接酶 l ( 5 0 n g p 1 )( 5 0 i l 山) i 体积( m ) 5 5lo 5l2 反应条件：1 6 。c 过夜。 3 转化与鉴定 连接产物取1 u 1 转化1 0 0 i l1 宿主菌b l 2 1 。( 感受态制备与转化步骤见附录) 在抗性平板上挑单菌落做p c r 鉴定。单茵落加3 “1 裂解液( p b s 缓冲溶液) ， 轻轻摇晃1 5 分钟左右，将其作为模板，用t a q 体系( 生工) p c r ，体系如下： l 1 0 x p c r d n t p ( 各5 吲物3 吲物 l组分 水 t a q 酶 模板 l b u f f e r 1 0 n 蛆v 1 ) ( 1 0 u m )( 1 0 u m ) i 体积( m ) 1 7 52 50 5o 5o 5o 53 反应条件：9 4 2 分钟，9 4 3 0 秒，6 2 3 0 秒， 7 2 1 26 0 秒， 7 2 5 分钟，4 。循环3 5 次。 挑出p c r 结果阳性的单菌落，接入3 m ll b 培养液，3 7 ，2 6 0 r p m 过夜，用 q i a g e n 质粒抽提试剂盒抽提质粒。 抽提出的质粒用酶切方法鉴定，酶切体系及条件见上文。 所有质粒送联合基因公司测序。 附录：感受态制备与转化 感受态细胞的制备( r b c l 法) 1 牙签接种菌株于含3 m ll b 的中试管( 摇床振荡2 5 0 r p n l ，3 7 ，过夜) 2 3 m l 过夜菌液+ l b1 4 7 m l + i mm g s 0 3 m i ( 以1 ：5 0 扩大培养，含2 0 m mm g s 0 4 用 5 0 0 m l 锥形瓶) 3 3 0 0 r p m ，3 7 ，2 - 3 h 摇至o d = o 4 - 0 6 4 冰上冷却片刻，离心收菌( 4 5 0 0 r p m ，1 0 r a i n ，4 ) 5 弃尽上清，加6 0 m lt f b i ，温和冲匀细胞( 0 4 v 的t f b i ) 6 冰浴5 m i n ，离心( 4 5 0 0 r p m ，1 0 m i n ，4 ) 7 弃尽上清，加6 m lt f b 2 ，轻轻地温和冲匀细胞( i 2 5 v 的t f b 2 ) 8 分装于1 5 1 1e p p e n d o r f 管中 9 冰上稳定1 5 3 0 m i n ( 此步骤可有可无) 转化 人类新基因a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 1 5 0 i il 感受态细胞+ 1 - 0 5 ul 质粒混匀 2 冰浴3 0 r a i n ( 每十分钟指弹混匀) 3 4 2 水浴9 0 秒 4 冰浴2 m i n 5 加l m ll b ( 超净台中进行) 6 3 7 水浴1 h 7 涂平板( 若转化效率高：取1 0 0 i i1 涂板，若转化效率低：4 0 0 0 r p m 离心 1 0 m i n ，弃上清余1 0 0u1 左右，打匀沉淀，将沉淀全部涂于平板上) 8 平板倒置于3 7 培养箱过夜 三组织表达分析 材料和仪器： 1 p c r 仪( 9 6 0 0 ) p e r k i ne l m e r 2 引物： 正向引物：a c a g a g t g 从g g g g a g g t g c c a g 反向弓i 物：a g a g c c t c a a t t t g c c g g t c c t t g 方法： 1 以成人十六个组织的c d n a 为模板进行r t - p c r 反应，p c r 的体系如下： il o + p c r d n t p ( 各 l组分水5 吲物3 吲物 t a q 酶各组织模板 l b u f i 打 l o m m ) i 体积( 山) 1 62 51l ll 2 5 反应条件：9 4 2 分钟，9 4 3 0 秒，6 4 3 0 秒，7 2 l m i n ， 7 2 5 分钟，4 。循环3 8 次。 2 1 琼脂糖凝胶电泳检测结果。 四细胞转染 本论文中需要转染的质粒是g f p r g a p ， 1 细胞传代培养 材料与仪器 1 i m d m 2 小牛血清 3 h a n k s 干粉 4 胰酶干粉 5 细胞培养箱 细胞株为2 9 3 h e k ，用于绿荧光蛋白定位。 g i b c 0b r l h y c l o n e g i b c ob r l g i b c ob r l h e r a 1 3 人类新基因a r h g a p l 9 的克隆和初步功能研究 试剂 1 i m d m ( 1 0 牛血清) 培养液 取5 l 的干净烧杯，用干净的量筒量取5 0 0 0m lm i l l i q 水倒入烧杯内。加入 i m d m 干粉( 每瓶5 l ) ，搅拌至干粉完全溶解。按瓶上说明要求称取n a h c 仉， 加入烧杯中，调节p h 至7 1 。倒出1 1 0 体积的无血清培养液，然后加入5 0 0 m l 新生牛血清搅拌均匀。用蠕动泵加0 2 2um l 滤膜先在准备室过滤一遍， 然后在无菌室内过滤。 2 h a n k s 液 取干净烧杯一只，量取5 0 0 0 m bm i l l i - 0 水倒入烧杯内。将5 包h a n k s 干粉 倒入烧杯内。称取适量的n a h c 0 3 ，加入烧杯中，调节p h 至7 1 。1 2 0 1 2 ，3 0 r a i n 蒸气高压灭菌。 3 胰酶消化液 吸取4 0 m lh a n k s 液于胰酶干粉中，摇匀。用n a h c 0 3 ，调节p h 至7 1 ，待溶 液颜色由橙黄逐渐变为红紫色即可。再用吸管吸取1 0 m l 溶液，加到4 0m 1 t a n k s 液中摇匀，其浓度为1 x 。 4 p f l s i l i l l i - 0 水 3 7 5 m 1 k h p 0 0 0 6 1 9 n a 捌p 0 , 1 2 h z 0 0 1 5 0 3gn a c l4 5g 溶解后，加水至5 0 0m l ，4 冰箱保存，3 个月。 方法 1 将准备传代的细胞置于倒置显微镜下观察细胞生长情况，当细胞融合达到 8 0 即可传代。 2 在超净工作台中，将细胞培养瓶中的培养液倒去。加入1 0 m lh a n k s 液，轻 轻晃动5 次洗涤细胞生长面，然后将h a n k s 液倒去。 3 加入3 m l 胰酶消化液，消化3 0 s 后，倒去2 3 的胰酶消化液，剩下的胰酶消 化液在超净工作台中，将细胞培养瓶中的培养液倒去继续消化5 8