（遗传学专业论文）一种组织特异性connexin+31表达载体的构建.pdf

摘要朱怀虚硕士学位论文 摘要 背景： 间隙连接蛋白( c o n n e x i n s ) 是一类可以在细胞的膜上组装成为间隙连接通 道( g a pj u n c t i o n s ) 以介导相邻细胞间小分子物质( 2 0 0 0 0 9 ，4 离心1 5 分钟。 8 ) 用q b t 溶液平衡t i p 一5 0 0 柱，允许柱子流空。 9 ) 将第7 步的上清加入t i p 一5 0 0 柱，让其借助重力进入树脂。 1 0 ) 用2 3 0m lq c 溶液洗t i p 一5 0 0 柱。 1 1 ) 用1 5m lq f 溶液洗脱d n a ，使溶液滴入干净的离心管。 1 2 ) 离心管中加入1 0 5 m l 异丙醇混匀后以 1 5 0 0 0 9 ，4 离心3 0 m i n 。 1 3 ) 离心后倒去上清，每管加入7 5 乙醇5 m l 后以 1 5 0 0 0 9 离心l o m i n 。 1 4 ) 离心后，吸去乙醇，待干燥后用5 0 0g ld d h ：0 溶解质粒，用分光光度计测定 d n a 含量。 此质粒主要用于转染细胞。 1 8 第一章朱怀虚硕士学位论文 2 结果与分析 2 i c x 3 1 野生型和f 1 3 7 l 突变体表达载体p g r u 3 一k 1 4p r o m o t e r - c x 3 1 的双酶切鉴 定 将c x 3 1 野生型和f 1 3 7 l 突变体片断与k e r a t i n l 4p o l ya 尾共连接进入 p g e m 3 - k 1 4p r o m o t e r 载体，然后转化至) 【l 一1b l u e 大肠杆菌，挑取克隆，经k p n i 和s p hi 双酶切证实连接片断的大小正确。然后将其送测序证实。图2 3 为一 次正确的c x 3 1 野生型和f 1 3 7 l 突变体表达载体的双酶切结果，获得了一条大小 约为4 1 k b 的片断和一条大小约为3k b 的片断( 见图2 3 ) ，分别应为k e r a t i n1 4 p r o m o t e r + r a b b i tg l o b i n + c x 3 1 一f l a g k e r a t i n1 4p o l ya 尾和p g f _ 瑚3 载体骨架。 证实已经将c x 3 1 野生型和f 1 3 7 l 突变体d n a 片断连接入表达载体内。 2 2 测序分析 图2 - 3 k 呻i 和s p h i 双酶切鉴定结果 对经过双酶切分析证实后的c x 31 野生型和f 1 3 7 l 突变体进行测序证实。图 为野生型和f 1 3 7 l 突变的测序结果( 图中只显示了包含突变位点的部分序列) 。 经与野生型c x 3 1 序列比较，f 1 3 7 l 突变除了突变位点发生了改变外，其余位点 均与野生型序列完全匹配( 图2 4 ) 。因此说明c x 3 1 野生型和f 1 3 7 l 突变体表达 载体已构建成功。 朱怀虚硕士学位论文 第一章 ccgc a gcc ch cchagc c hchg 一j删从一m 肌肌凡 t c 上 3 讨论 图2 - 4c x 3 l 野生型和突变体的测序结果 f 1 3 7 l 通过对构建好的载体进行的酶切鉴定，得到预期的目的条带，证明载体的构 建是成功的。然后将得到的质粒进行测序分析表明，除了在预先设计的突变位点 发生了改变外，其余部分均与野生型序列相同，证明在p c r 过程中没有产生新的 突变。至此全部野生型和f 1 3 7 l 突变体c x 3 1 表达载体已经构建完全。并且可以 使用k p ni 酶和s p hi 酶对这两种载体进行线性化，去除p g e m 3 骨架。 第二章 朱怀虚硕士学位论文 第二章c x 3 1 野生型和f 13 7 l 突变体的表达与检测 本章介绍将己构建好的组织特异性表达的c x 3 1 野生型和f 1 3 7 l 突变体转染 进入h a c a t 细胞，并使用免疫沉淀和免疫荧光的方法对c x 3 1 蛋白的表达情况及 其形成间隙连接斑的能力进行检测。为了使c x 3 1 蛋白能够更加稳定，我们分别 将其培养在2 7 和3 7 。这里，我们还使用了p c d n a 3 1 a ( 一) c x 3 1 一m y c 作为阳 性对照。 为了说明本表达载体的组织特异性表达的能力，还转染了人胚。肾来源的h e k 2 9 3 t 细胞进行免疫荧光检测。 1 材料与方法 1 - l 材料与仪器 1 1 1 主要仪器 恒温二氧化碳细胞培养箱 摇床 a c c s e n tm u l t i s k a n 分光光度计 m i n ig e l 电泳盒 转膜盒 x 一0 m a t 洗片机 5 4 1 7 r 型冷冻离心机 荧光显微镜 超声仪 细胞刮子 1 1 2 材料与试剂 a n t i f l a gt a g 多克隆抗体 a n t i c m y ct a g 单克隆抗体( 9 e l o ) a n ti b t u b u li n 单克隆抗体 m 2 一a n ti f l a gb e a d s 山羊抗鼠i g g 二抗 t h e r m o 公司 v w r 公司 t h e r m o 公司 i n v i t r o g e n 公司 b i o - r a d 公司 k o d a k 公司 e p p e n d o r f 公司 o l y m p u s 公司 c o l e & p a r m e r 公司 c o r n i n g 公司 s i g m a 公司 u p s t a t e 公司 h a nz h a n g 博士提供 s i g m a 公司 j a c k s o n 朱怀虚硕士学位论文 第二章 山羊抗兔i g g 二抗 c y 3 标记的山羊抗鼠二抗 a l e x af l u o5 6 8 n m 山羊抗兔二抗 t r it i o nx - 1 0 0 s d s d e o x y c h o l i ca c i d t r i s h c l n a c l k c i 丙三醇 b 一巯基乙醇 溴酚兰 甘氨酸 甲醇 抑胰肽酶( a p r o t i n i n ) 胃酶抑素( p e p s t a t i na ) 亮肽酶素( l e u p e p ti n ) p m s f n a 3 v 0 4 n a f d cp r o t e i na s s a yk it s b s a k h ：p q n a ：h p o 2 2 i m m u n o r e s e a r c h l a b o r a t o r i e s 公司 j a c k s o n i m m u n o r e s e a r c h l a b o r a t o r i e s 公司 s i g m a 公司 i n v i t r o g e n 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 f i s h e r 公司 j t b a k e r 公司 m a l l i n c k r o d t 公司 s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a 公司 公司 公司 公司 j t b a k e r 公司 j t b a k e r 公司 c a l b i o c h e m 公司 c a l b i o c h e m 公司 c a l b i o c h e m 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 b i o r a d 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 第二章 朱怀虚硕士学位论文 s e e b l u e 预染蛋白质m a r k e r 4 - 2 0 梯度t r i s - g l y c i n es d sp a g e 胶 p v d f 膜 e c lp l u s 显影液 胶片 o p t i m e m d m e m f b s 青霉素链霉素 丙酮酸钠 2 5 胰酶 6 c m 细胞培养皿 2 4 孔细胞培养平板 9 6 孔板 l i p o f e c t a m i n el t x 细胞转染k i t c a c l 2 b e s 多聚甲醛 蔗糖 m o u n tm e d i aw it hd a p ik i t 载玻片 盖玻片 r i p a b u f f e r 1 t r i t o nx 一1 0 0 0 5 d o c ( d e o x y c h o li ca c i d ) o 1 s d s 5 0m m o l lt r i s h c i ，p h8 0 1 5 0m m o l ln a c l 2 3 i n v it r o g e n 公司 i n v it r o g e n 公司 m i l l i p o r e 公司 g eh e a l t h c a r e 公司 g e n e s e e 公司 i n v i t r o g e n 公司 h y c l o n e 公司 h y c l o n e 公司 g i b c o 公司 s i g m a 公司 g i b c o 公司 f a l c o n 公司 f a l c o n 公司 n u n c 公司 i n v it r o g e n 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 v e c t o r 公司 v w r 公司 v w r 公司 朱怀虚硕士学位论文第二章 i pw a s h i n gb u f f e r 1 t r i t o nx - 1 0 0 0 5 d o c ( d e o x y c h o l i ca c i d ) 0 1 s d s 5 0m m o l lt r i s h c i ，p h8 0 1 5 0m m o l ln a c l 1 0 0 蛋白酶抑制剂 a p r o t i n i n p e p s t a t i na l e u p e p t i n 无水乙醇 - 2 0 保存 l o o m m o l lp m s f p m s f 异丙醇 - 2 0 保存 l o m g l o m g l o m g l o m l 1 7 6 m g 1 0 m l 2 0 0 m m o l ln a 3 v 0 4 n a 3 v 0 43 6 8 m g d d h 2 0 l o m l 先用水溶解n a ：，v 0 4 粉末然后调p h 值为1 0 o ，煮溶液约l o m i n 至无色，再调p h 值至1 0 0 。重复煮溶液至保持无色，其p h 值也稳定在1 0 0 。最后定容至l o m l 。 - 2 0 保存。 5 0 0 m m o l ln a f n a f 2 4 2 1 0 m g 第二章朱怀虚硕士学位论文 d d h ：0 4 避光保存 2xs d ss a m p l eb u f f e r 6 3m m o l lt r i sh c i 1 0 甘油 2 s d s 混合好后调p h 至6 8 2xs d sl o a d i n gb u f f e r 6 3m m o l lt r i sh c l 1 0 甘油 2 s d s 0 0 0 2 5 溴酚兰 混合好后调p h 至6 8 然后加入1 0 - 2 5 1 3 一巯基乙醇 i 0 x t r i s g l y c i n es d s p a g e 电泳液 t r is 甘氨酸 s d s d d h ：0 1 0 转膜液 t r i s 甘氨酸 d d h 。0 1 转膜液 2 5 1 0 m l 3 0 3 9 1 4 4 9 l o g l l 3 0 3 9 1 4 4 9 1 l 朱怀虚硕士学位论文 第二章 1 0 转膜液 甲醇 d d h ：0 1 0 x p b s n a c l k c l n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 调p h 值为7 4 ，然后加d d h ：0 定容至l l 1xp b s i o x p b s d d h 2 0 高压蒸汽灭菌 多聚甲醛固定液 3 多聚甲醛 1 0 蔗糖 4 保存 2 x b e s b e s n a c l n a 2 h p 0 4 调p h 值为7 0 ，过滤除菌，4 c 保存 2 5 m m o l lc a c l 2 c a c l 2 d d h ：0 2 6 1 0 0 m l l o o m l 8 0 0 m l 8 0 9 2 o g 1 4 4 9 2 4 9 1 0 0 m l 9 0 0 m l 5 0 m m o l l 2 8 0 m m o l l 1 5 m m o l l 3 6 7 4 9 1 l 第二章朱怀虚硕士学位论文 过滤除菌，40 c 保存 1 2 实验方法 i 2 i 细胞培养及转染 1 2 1 1h a c a t 细胞的培养及转染 按照l i p o f e c t a m i n el t x 细胞转染k i t 的说明书进行，步骤如下： 1 ) 转染前一天，将h a c a t 细胞用胰酶消化后接种在6 c m 细胞培养皿和2 4 孔细胞 培养平板( 孔中预先放有圆形盖玻片) 中，用1 0 f b s d m e m 培养于3 7 ， 5 c o ：培养箱中，使其在2 4 小时后汇合度达到9 0 以上。转染前1 h ，将培养基 分别替换为5 m l 和5 0 0i ll 的o p t i m e mi 无血清培养基。 2 ) 分别用l m l 和1 0 0ul o p t i m e mi 无血清培养基稀释5 u g 和5 0 0 n g d n a ，轻轻 混匀。 将p l u s 试剂轻轻混匀，然后向已经稀释的d n a 中分别加入5l l1 和0 5pl 。轻 混匀并室温静置5 m i n 。 3 ) 将l i p o f e c t a m i n el t x 试剂轻轻混匀，然后向已经稀释的d n a 中分别加入1 2 5 ul 和1 2 5ul 。轻轻混匀。室温静置3 0 m i n 。 4 ) 将d n a l i p o f e c t a m i n el t x 复合体分别加入到6 c m 细胞培养皿和2 4 孔细胞培 养平板中。轻轻前后摇动培养皿或培养板，使之混匀。 5 ) 将细胞放入3 7 ，5 c 晚培养箱培养。 6 ) 6 h 后更换培养基为1 0 f b s d m e m 。 7 ) 继续培养4 0 小时于2 7 或3 7 。 1 2 1 2h e k2 9 3 t 细胞的培养及转染 1 ) 转染前一天，将h e k2 9 3 t 细胞用胰酶消化后接种在6 c m 细胞培养皿和2 4 孔 细胞培养平板( 孔中预先放有圆形盖玻片) 中，用1 0 f b s d m e m 培养于3 7 ， 5 c 0 2 培养箱中，使其在2 4 小时后汇合度达到6 0 以上。转染前2 h ，更换培养 基。 2 ) 按下表配好c a c l 2 - d n a 共沉淀复合体： 2 4 孔细胞培养板( 每孔)6 c m 细胞培养皿 d n a l u g5 u g 2 5 m o l lc a c l25u12 5u1 朱怀虚硕士学位论文第二章 2 b e s 5 0ul2 5 0u1 加入d d h 。0 至总体积1 0 0 l il 和5 0 0 i l1 ，轻轻混匀，室温静置2 0 m i n 。 3 ) 用移液器吹打c a c i ：- d n a 共沉淀复合体一次，然后加入6 c m 细胞培养皿和2 4 孔细胞培养平板。轻轻前后摇动培养皿或培养板，使之混匀。 4 ) 将细胞放入3 7 ，5 c 0 ：培养箱培养。 5 ) 8 h 后更换培养基。 6 ) 继续培养4 0 h 于3 7 。 1 2 2w e s t e r nb l o t 检测和免疫沉淀检测 1 2 2 1 裂解6 c m 细胞培养皿中的h e k2 9 3 t 细胞 1 ) 吸去6 c m 细胞培养皿中的培养基。 2 ) 加入2 s d ss a m p i eb u f f e ri 0 0 u1 ，使s d s 能均匀覆盖培养皿。 3 ) 用细胞刮子将裂解液转移至1 5 m l 离心管中。 4 ) 置离心管于1 0 0 热恒温器上l o m i n 变性，然后用超声仪超声3 0 s ，离心i m i n 。 5 ) 按d cp r o t e i na s s a yk i t s 说明书方法测量蛋白质浓度： i ) 制备工作液a ： 根据检测样品的多少按以下比例制备适量的a 1 0 0 0 肛1 溶液a 和2 0 “1 溶液s 混合制备成a i i ) 稀释蛋白质标准品 稀释浓度( m g m 1 ) 0 0 2o 40 60 8 1 01 21 4 b s a ( 2 m g m 1 ) 0 1 02 03 04 05 06 07 5 p b s 1 0 09 08 07 06 05 04 02 5 i i i ) 稀释待检测的蛋白质样品： 将蛋白质样品用p b s 作适当稀释使浓度落在o 一1 4m g m l 之间 i v ) 检测 按下列比例将溶液混合： 样品或标准品 5 “l 溶液a 2 5 “l 溶液b 2 0 0p 1 混匀后放置在分光光度计上用0 d 7 5 0 检测。 v ) 计算浓度：根据蛋白质标准品的o d 值与浓度绘制标准曲线，然后求出未知样 第二章 朱怀虚硕士学位论文 品浓度。 1 2 2 2w e s t e r nb l o t 检测 1 ) 将4 一2 0 梯度t r i s g l y c i n es d sp a g e 胶装入电泳槽中，拔去梳齿，将电泳 缓冲液加入内外电泳槽中，确保凝胶的上部和底部都浸入缓冲液中。 2 ) 上样： 用2 s d sl o a d i n gb u f f e r 稀释约3 0 u g 蛋白，然后置1 0 0 c 热恒温器上l o m i n 变性。离心l m i n 。 3 ) 电泳： 用1 2 0 v 恒压进行电泳，待样品已跑至溴酚蓝带接近胶的底部，停止电泳。 4 ) 转膜： 电泳完毕，将凝胶从电泳槽中取出，卸下塑料盒，取出凝胶，将凝胶与p v d f 按 顺序置于转膜夹中，将转膜夹放入转膜槽中，以2 9 0 m a 恒定电流转膜1 5 h 。转 膜完毕，将p v d f 膜放入封闭液中封闭。 5 ) 封闭： 用封闭液封闭l 小时以上。 6 ) 上一抗： 9 e l oa n t i c m y ct a g 单克隆抗体1 ：1 0 0 0 ，均稀释于封闭液中，室温，在摇床 上摇动1 小时。 7 ) 洗一抗： 用o 1 t r i t o nx 1 0 0 p b s 洗p v d f 膜3 次，每次1 5 m i n ，洗时放在摇床上摇动。 8 ) 上二抗： 加入稀释1 5 0 0 倍的二抗( h r p 标记的山羊抗鼠i g g 二抗稀释于封闭液中) ，室 温，在摇床上摇动1 小时。 9 ) 洗二抗： 用0 1 t r i t o nx 1 0 0 p b s 洗p v d f 膜3 次，每次1 5 m i n ，洗时放在摇床上摇动。 1 0 ) 加e c l 液： 一 从e c lp l u s 显影液k i t 中分别取s 0 1 a ：1 0m l ，s 0 1 b ：2 5p l ，混匀，将 p v d f 膜从o 1 t r i t o nx 1 0 0 p b s 中取出，放于保鲜膜上，使转有蛋白质的一 面朝上，加e c l 液于p v d f 膜上，在p v d f 膜上反应5 分钟后，用镊子将p v d f 膜 从保鲜膜上夹取，用滤纸吸去多余的e c l 液，再将p v d f 膜放置在一新的保鲜膜 朱怀虚硕士学位论文 第二章 上使转有蛋白质的一面朝上，用保鲜膜包好p v d f 膜后，用透明胶固定在显影夹 上于暗室中显影。 1 1 ) 曝光： 在暗室中将胶片取出后，剪成适当大小，放在用保鲜膜包好的p v d f 膜上，关闭 显影夹，曝光3 m i n 后，将胶片放入洗片机中显影。 1 2 2 3 裂解6 c e 细胞培养皿中的h a c a t 细胞 1 ) 将细胞培养皿放在平整的冰上，吸去培养基。 2 ) 向皿中加入l m lr i p a 裂解液，使裂解液均匀分布在培养皿上。继续置冰上 1 0 2 0 m i n 。 3 ) 用移液器吹打细胞，使之与培养皿脱附，然后转移裂解液至1 5 m l 离心管中。 4 ) 将离心管置4 翻转摇床上，裂解1 h 。 5 ) 1 3 2 0 0 9 离心3 0 m i n 5 ) 按1 2 2 1 中步骤5 ) 所述方法测量蛋白质浓度。 1 2 2 4 免疫沉淀c x 3 1 蛋白 1 ) 向1 5 m l 离心管中加入约5ulm 2 一a n t i f l a gb e a d s 。 2 ) 根据1 2 2 3 中测定的蛋白质浓度，向b e a d s 中加入1 2 u g 裂解的蛋白质溶 液，再加入r i p a 裂解液使总体积为l m l 。 3 ) 置4 翻转摇床上，共沉淀6 - 8 h 。 4 ) 7 5 0 0 9 离心3 m i n ，吸去上清，加入l m li p 洗液，轻轻混匀。 5 ) 重复步骤4 ) 两次，然后1 3 2 0 0 9 离心3 m i n ，将离心管中的溶液吸干净。 6 ) 加入2 0ul2xs d sl o a d i n gb u f f e r ，轻混匀，然后置1 0 0 。c 热恒温器上l o m i n 变性。离心l m i n 。 7 ) 按1 2 2 2 所述方法行w e s t e r nb l o t 检测。所上一抗为a n t i f l a gt a g 多克 隆抗体l ：4 0 0 0 ，二抗为山羊抗兔i g g1 ：1 5 0 0 。 上样对照用一抗a n t i - b - t u b u l i n 单克隆抗体l ：1 0 0 0 0 ，二抗山羊抗鼠 i g g l ：1 5 0 0 进行检测。 1 2 3 免疫荧光检测 1 2 3 1 盖玻片的预处理 1 ) 用l m o l lh c l 浸泡盖玻片于烧杯中，用锡箔纸包紧烧杯口，置于5 5 。c 温箱 中1 2 1 6 h 。 第二章朱怀虚硕士学位论文 2 ) 用大量d d h ：0 冲洗盖玻片。 3 ) 用7 5 酒精浸泡盖玻片，然后将盖玻片放在滤纸上一片片分开，自然风干。 4 ) 将盖玻片移至干净的容器中，高压蒸汽灭菌。 5 ) 冷却至室温，待用。 1 2 3 2 免疫荧光实验步骤 1 ) 从培养箱中取出2 4 孔细胞培养平板，吸去培养基。 2 ) 向孔中加入约2 0 0i l13 7 多聚甲醛1 0 蔗糖溶液，固定细胞1 5 m i n 。 3 ) 吸去3 7 多聚甲醛1 0 蔗糖，加入约2 5 0u10 1 t r i t o nx - i o o p b s 透化处 理细胞l o m i n 。 4 ) p b s 漂洗细胞3 次。 5 ) 用5 b s a p b s 封闭3 0 m i n 。 6 ) 上一抗，对h a c a t 细胞使用a n t i f l a gt a g 多克隆抗体1 ：3 0 0 ，对h e k2 9 3 t 细胞使用9 e l oa n t i c m y ct a g 单克隆抗体1 ：5 0 0 ，抗体均溶于5 b s a p b s 。室 温孵育1 h 。 7 ) p b s 漂洗细胞数次，然后再用p b s 洗3 到4 次，每次l o m i n 。 8 ) 上二抗：对h a c a t 细胞使用a l e x af l u o5 6 8 n m 山羊抗兔二抗1 ：3 0 0 ：对h e k2 9 3 r 细胞使用c y 3 标记的山羊抗鼠二抗1 ：3 0 0 。抗体均溶于5 b s a p b s ，室温孵育1 h 。 9 ) p b s 漂洗细胞数次，然后再用p b s 洗5 次，每次5 m i n 。 1 0 ) 用d d h ：0 漂洗数次。 1 1 ) 将含d a p i 的封片液滴在载玻片上，然后将盖玻片上有细胞的一面朝下，轻 轻覆盖在封片液上。避光保存。 2 结果与分析 2 1 转染h a c a t 细胞后免疫沉淀分析 转染h a c a t 细胞后，我们使用了m 2 - a n t i f l a gb e a d s 对c x 3 1 蛋白进行免疫 沉淀检测，同时还检测了b - t u b u l i n 作为上样对照。结果显示在3 7 。c 时野生型 的c x 3 1 蛋白表达量较2 7 。c 高，但3 7 c 的f 1 3 7 l 突变体c x 3 1 蛋白量则没有2 7 c 时高( 图3 - 1 ) 。总体来看，野生型的c x 3 1 蛋白表达量也比f 1 3 7 l 突变体的表达 朱怀虚硕士学位论文 第二章 量要高。 ( 一)w tf 1 3 7 l 2 7 3 7 2 7 3 7 2 7 3 7 _ r 一一嘲- _ _ _ a i m _ _ - i b t u b u l i n 图3 - l 免疫沉淀检测c x 3 l 蛋白和争n b u l i n 上样对照 2 2 转染h a c a t 细胞后免疫荧光检测 在转染h a c a t 细胞4 8 h 后，我们c x 3 1 的表达进行了免疫荧光检测。结果显 示，在h a c a t 细胞中c x 3 1 得到了成功的表达，野生型细胞中产生了明显的间隙 连接斑，而f 1 3 7 l 突变体则不能形成间隙连接( 图3 - 2 ) 。 p g e m 3 一k 1 4p r o m o t e r 图3 - 2 免疫荧光检测转染的h a c a t 细胞( 箭头示间隙连接斑) 2 3 转染h e k2 9 3 t 细胞后免疫荧光检测 我们还转染了h e k2 9 3 t 细胞，并进行了免疫荧光检测。在h e k2 9 3 t 细胞中， k 1 4 启动子不能使c x 3 1 表达，观察不到被染色后形成的荧光，而p c d n a3 1 a ( 一) 载体的阳性对照则显示野生型c x 3 1 能够成功表达，并形成间隙连接斑( 图3 - 3 ) 。 一 一 一 一 盼 弘 第二章朱怀虚硕士学位论文 c y 3d - a n t i i p 6 e m 3 - k 1 4p r o l o t e r 3 讨论 m e r g e m 强2 9 3 t 图3 - 3 免疫荧光检测转染的l i a c a t 细胞( 箭头示间隙连接斑) l i j f 1 3 7 l 我们将第一章中构建好的载体转染了表皮组织来源的细胞系h a c a t 细胞。结 果表明，应用k 1 4 启动子能够成功的使c x 3 1 蛋白得到表达并形成间隙连接斑。 而免疫沉淀检测则显示3 7 时c x 3 1 野生型的表达较2 7 更强，但f 1 3 7 l 突变体 的表达水平则恰好相反，2 7 c 较其在3 7 c 时为高。其可能的原因是f 1 3 7 l 突变 体在3 7 c 时的大量表达导致了细胞的死亡，反而使没有得到转染的细胞能够存 活，使得c x 3 1 蛋白的浓度降低，当上样量相同时，能够检测到的c x 3 1 蛋白就比 2 7 少了。这也说明了为什么野生型的c x 3 1 较f 1 3 7 l 突变体的表达量高。 对h e k2 9 3 t 的转染实验表明，k 1 4 启动子无法使c x 3 1 表达，而阳性对照则 可以表达并形成间隙连接斑。证明了k 1 4 启动子的表达特异性，即仅能在表皮组 织或表皮组织来源的细胞系中进行表达，与文献报道中k 1 4 的皮肤组织表达特异 性性质一致唧1 。证明了本载体的组织表达特异性。 目前，c x 3 1 的基因敲除和转基因小鼠模型中均未观察到耳聋或皮肤疾病表 朱怀虚硕士学位论文第二章 型。仅s c h n i c h e l s 等嵋2 1 采用人c x 3 1 的启动子转基因小鼠模型的表皮中有部分角 质化。本载体采用皮肤组织特异性表达启动子，在线性化去除p g e m 3 骨架后，可 使用c x 3 1 表达的片断构建c x 3 1 转基因小鼠模型，由于k 1 4 的皮肤表达特异性， 其在皮肤组织能力可能会比c x 3 1 内源的启动子高，从而使更多的c x 3 1 蛋白表达。 我们选择的f 1 3 7 l 就是一种致e k v 皮肤病的突变，因此将有可能得到有e k v 表型 的转基因小鼠，将有利于进一步揭示其致病的机制。 总结 朱怀虚硕士学位论文 总结 1 本研究成功构建了以k e r a t i n1 4 启动子为主要元件的c x 3 1 野生型和 f 1 3 7 l 突变体的表达载体p g e m 3 一k 1 4 一p r o m o t e r c x 3 1w t f l a g 和p g e m 3 一k 1 4 一 p r o m o t e r c x 3 1f 1 3 7 l f l a g 。 2 将这两种载体转染h a c a t 细胞后进行免疫沉淀和免疫荧光检测表明此两 种载体能够成功的在细胞中得到表达。 3 将这两种载体转染h e k2 9 3 t 细胞后进行免疫荧光检测，无法检测到这两 种载体的表达，证明了此载体的组织表达特异性。 4 此两种载体在线性化去除其p g e m 3 骨架后，保留的各元件可用于构建c x 3 1 野生型和c x 3 1 f 1 3 7 l 突变体的转基因动物模型。 朱怀虚硕士学位论文参考文献 参考文献 f u r s h p a n ，e j ，p o t t e r ，d d ，t r a n s m is s i o na tt h eg i a n tm o t o r s y n a p s e so ft h ec r a y f i s h jp h y s i o l ，1 9 5 9 ，1 4 5 ( 2 ) ：2 8 9 3 2 5 r o b e r t s o n ，j d ，t h eo c c u r r e n c eo fas u b u n i tp a t t e r ni nt h eu n i t m e m b r a n e so fc l u be n d i n g si nm a u t h n e rc e l ls y n a p s e si ng o l d f i s h b r a i n s jc e l lb i o l ，1 9 6 3 ，1 9 ：2 0 1 2 1 r e v e l ，j p ，k a r n o v s k y ，m j ，h e x a g o n a la r r a yo fs u b u n it si n i n t e r c e ll u l a rj u n c t i o n so ft h em o u s eh e a r ta n d1i v e r jc e l lb i o l ， 1 9 6 7 ，3 3 ( 3 ) ：c 7 一c 1 2 4 r e v e l ，j p ，o l s e n ，w ，k a r n o v s k y ，m j ，at w e n t y a n g s t r o mg a p j u n c t i o nw i t hh e x a g o n a l a r r a yo f s u b u n i t si ns m o o t hm u s c l e jc e l l b i o l ，1 9 6 7 ，3 5 ：11 2 a 5 r i c h a r d ，g ，b r o w n ，n ，s m i t h ，l e ，e ta 1 ，t h es p e c t r u mo f m u t a t i o n si ne r y t h r o k e r a t o d e r m i a s 一一n o v e la n dd en o v om u t a t i o n si n g j b 3 h u mg e n e t ，2 0 0 0 ，1 0 6 ( 3 ) ：3 2 1 9 6 x i a ，j h ，l i u ，c y ，t a n g ，b s ，e ta 1 ，m u t a t i o n si nt h eg e n e e n c o d i n gg a pj u n c t i o np r o t e i nb e t a 3a s s o c i a t e dw i t ha u t o s o m a l d o m i n a n th e a r i n gi m p a i r m e n t n a tg e n e t ，1 9 9 8 ，2 0 ( 4 ) ：3 7 0 3 7 l i u ，x z ，x i a ，x j ，x u ，l - r ，e ta 1 ，m u t a t i o n si nc o n n e x i n 3 1 u n d e r l i er e c e s s i v ea sw e l la sd o m i n a n tn o n s y n d r o m i ch e a r i n gl o s s h u mm o lg e n e t ，2 0 0 0 ，9 ( 1 ) ：6 3 7 8 r i c h a r d ，g ，s m i t h ，l e ，b a i l e y ，r a ，e ta 1 ，m u t a t i o n si nt h e h u m a nc o n n e x i ng e n eg j b 3c a u s ee r y t h r o k e r a t o d e r m i av a r i a b i1 is n a tg e n e t ，1 9 9 8 ，2 0 ( 4 ) ：3 6 6 - 9 9 r i c h a r d ，g ，c o n n e x i n s ：ac o n n e c t i o nw i t ht h es k i n e x pd e r m a t o l ， 2 0 0 0 ，9 ( 2 ) ：7 7 - 9 6 1 0 g o t t f r i e d ，i ，l a n d a u ，m ，g l a s e r ，f ，e ta 1 ，am u t a t i o ni ng j b 3 3 6 参考文献朱怀虚硕士学位论文 i sa s s o c i a t e dw i t hr e c e s s i v ee r y t h r o k e r a t o d e r m i av a r i a b i l i s ( e k v ) a n dl e a d st od e f e c t i v et r a f f i c k i n go ft h ec o n n e x i n3 1p r o t e i n h u m m o lg e n e t ，2 0 0 2 1 1 ( 1 1 ) ：1 3 11 - 6 11 p a u l ，d l ，m o l e c u l a rc l o n i n go fc d n af o rr a t1i v e rg a pj u n c t i o n p r o t e i n jc e l lb i o l ，1 9 8 6 ，1 0 3 ( 1 ) ：1 2 3 3 4 1 2 k u m a r ，n m ，g il u l a ，n b ，c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a n a n dr a t1i v e rc d n a sc o d i n gf o rag a pj u n c t i o np r o t e i n jc e l lb i o l ， 1 9 8 6 ，1 0 3 ( 3 ) ：7 6 7 7 6 1 3 w i1l e c k e ，k ，e i b e r g e r ，j ，d e g e n ，j ，e ta 1 ，s t r u c t u r a la n d f u n c t i o n a ld i v e r s i t yo fc o n n e x i ng e n e si nt h em o u s ea n dh u m a n g e n o m e b io lc h e m ，2 0 0 2 ，3 8 3 ( 5 ) ：7 2 5 3 7 1 4 g o o d e n o u g h ，d a ，g o li g e r ，j a a n dp a u l ，d l ，c o n n e x i n s ， c o n n e x o n s ，a n di n t e r c e ll u l a rc o m m u n i c a ti o n a n n ur e vb i o c h e m ， 1 9 9 6 ，6 5 ：4 7 5 5 0 2 1 5 g o o d e n o u g h ，d a ，j a g o li g e r ， a n d d l p a u l ，c o n n e x i n s