（内科学专业论文）扩张型心肌病患者il33st2信号通路和表达和分泌.pdf

， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文 的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大 学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密面。 学位论文作者签名：却搬 指导教 芦11 年b 月ip 日 弘f l 分类号r 5 垒21 2 u d c6 1 6 密级公珏 一 编号s q 墨1 3 鳢鱼 江菇大擎 硕士学位论文 扩张型心肌病患者il - 3 3 s t 2 信号通路的表 达和分泌 t h es e c r e t i o na n de x p r e s s i o no fi l 3 3 s t 2 s i g n a lp a t h 俏c yo fp z t i e n t sw i t hd i l a t e d c a r d i o m y o p a t h y 作者姓名： 指导教师： 申请学位： 学科专业： 郑枫 张国辉 硕士 内科学 论文提交日期： 2 0 11 年4 月 论文答辩日期：2 0 1 1 年6 月 学位授予单位：江苏大学 学位授予日期：2 0 1 1 年6 月 江苏大学硕士学位论文 摘要 目的：初步观察扩张型心肌病( d i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y , d c m ) 患者 外周血单个核细胞( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ，p b m c s ) 中i l 3 3 ( i n t e r l e u k i n 3 3 ) 和s t 2 的表达和分泌，分析其与d c m 疾病严重程度及 相关指标的相关性，探讨其在d c m 疾病中的作用。 方法：选择d c m 的患者( d c m 组) 及健康体检者( n c 组) 各3 6 歹1 j 。用酶 联免疫吸附法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y , e l i s a ) 检测其血浆中 i l - 3 3 和分泌型s t 2 ( s o l u b l es t 2 ，s s t 2 ) 水平；用实时定量p c r 法测定其 外周血单个核细胞中i l 3 3 m r n a 、s t 2 l m r n a 的表达水平；用w e s t e r nb l o t 检测其外周血单个核细胞中i l 3 3 和跨模型s t 2 ( t r a n s m e m b r a n es t 2 ， s t 2 l ) 蛋白水平。 结果：1 ( 1 ) 与对照组相比，d c m 组患者血清s s t 2 浓度明显升高 0 7 7 ( 0 6 8 0 9 8 ) n g m l 和o 3 2 ( 0 17 0 3 9 ) n g m 1 ，差异具有统计学意义 ( 尸 o 0 5 ) ，并且随着n y h a 心功能分级增高，血清s s t 2 浓度也随之增 高( 氏o 0 5 ) ，与b 型利钠肽( b t y p en a t r i u r e t i cp e p t i d e ，b n p ) ( r = 0 3 5 6 ， p 0 0 5 ) 和血尿素氮( b l o o du r e an i t r o g e n ，b u n ) 浓度( f o 312 ，p 0 0 5 ) 正相关，与左室射血分数( 1 e f tv e n t r i c u l a re j e c tf r a c t i o n ，l v e f ) 负相关( f - 0 2 4 9 ，p 0 0 5 ，s t 2 蛋 白水平明显升高 ( 1 5 0 + 0 1 4 ) 和( 1 2 2 4 - 0 0 9 ) ，p 0 0 5 。 结论：( 1 ) s t 2 是d c m 心衰新的生物标记物，可反映心力衰竭严重 程度；( 2 ) d c m 患者外周血单个核细胞i l 3 3 表达和分泌水平与正常人相 比没有明显变化；( 3 ) d c m 患者外周血单个核细胞s t 2 蛋白分泌量明显增 加，m r n a 表达水平没有明显变化。 关键词：i l 3 3 ；s t 2 ；心肌病，扩张型；外周血单个核细胞 i i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r c t o b j e c t i v e ：1 t op r e l i m i n a r i l yo b s e r v et h es e c r e t i o na n de x p r e s s i o no f i n t e r l e u k i n 一3 3 ( i l - 3 3 ) a n ds t 2i nt h ep e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ( p b m c s ) o fp a t i e n t sw i t hd i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y ( d c m ) 2 t oa n a l y s e st h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ni l 一3 3a n ds t 2a n ds e v e r i t yo fd c m a n do t h e rr e l a t i v e i n d e x s m e t h o d s ：3 6p a t i e n t sw i t hd i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y ( d c m ) ( d c mg r o u p ) a n d3 6h e a l t h yv o l e n t e e r s ( n cg r o u p ) a tt h es a m et i m ew e r ee n r o l l e d i l 一3 3a n ds o l u b l es t 2 ( s s t 2 ) l e v e l si ns e r u mo ft h o s e p e o p l ew e r e m e a s u r e db ym e a n so fe l i s a ；i l 一3 3a n dt r a n s m e m b r a n es t 2 ( s t 2 l ) m r n a s i nt h ep e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ( p b m c s ) o ft w og r o u p sw e r e d e t e c t e dw i t hr q - p c r ；i l 33a n ds t 2 lp r o t e i n si nt h ep b m c so ft h e s e p e o p l ew e r ed e t e r m i n e db ym e a n so f w e s t e r nb l o t r e s u l t s ： 1 ( 1 ) c o m p a r e dw i t hn cg r o u p ，t h es e r u ml e v e lo fs s t 2i s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e di nd c m g r o u p 0 7 7 ( 0 6 8 0 9 8 ) n g m l v s 0 3 2 ( 0 17 0 3 9 ) n g m l ，尸 o 0 5 a n ds i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ta m o n gp a t i e n t s w i t hd i f f e r e n tc a r d i a cf u n c t i o n ( n y h ac l a s s i f i c a t i o n ) ( 尸 o 0 5 ) t h es e r u m l e v e lo fs s t 2w a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hb t y p en a t r i u r e t i cp e p t i d e ( b n p ) ( r = 0 3 5 6 ，p o 0 5 ) a n db l o o du r e an i t r o g e n ( b u n ) l e v e l s ，a n d n e g a t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hl e f tv e n t r i c u l a re j e c tf r a c t i o n ( l v e f ) ( r = - 0 2 4 9 ， 尸 5 5 m m ，心脏可呈球型。( 3 ) 心室收缩功能减低：超声心动图检测室壁运动弥漫性减 弱，射血分数小于正常值。( 4 ) 必要时可以做冠脉造影及心内膜心肌活检心除外冠心 病与心肌炎，并排除特异性继发性心肌病和地方性心肌病克山病包括缺血性心肌 病、围产期心肌病、酒精性心肌病、代谢性和内分泌性疾病如甲状腺功能亢进、甲 状腺功能减退、淀粉样变性、糖尿病等所致的心肌病、遗传家族性神经肌肉障碍所 致的心肌病、全身系统性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等所致的心肌病、 中毒性心肌病等。 ( 三) 排除标准：活动性感染、系统性炎症、自身免疫性疾病、哮喘等变态反 应性疾病及恶性肿瘤。 ( 四) 对象分组：( 1 ) d c m 组3 6 例，为符合以上诊断标准的d c m 患者，其中男 2 8 例，女8 例，平均年龄( 4 2 4 - 4 ) 岁，平均射血分数( e f ，3 3 34 - 1 1 7 ) 。心功能按n y h a 分级标准( 以下均是) ，i i 级1 2 例，i 级1 1 例，级1 3 例；( 2 ) j 下常对照组( n c 组) 3 6 例， 为同期在江苏大学附属人民医院健康体检者，近期无感染史。平均年龄( 4 0 4 - 5 ) 岁、 性别( 男3 0 例，女6 例) 都与d c m 组相匹配。 1 5 标本采集与处理 1 5 1 标本采集 所有研究对象均在静息空腹时，采集肘静脉血1 2 m l ，其中5 m l 送检验科测定常 规指标，另夕b 2 m l 注入e d t a 抗凝管，3 0 0 0r m i n 离, 1 ) 15m i n ，吸取上清液置于一8 0 冰箱保存，待测血浆i l 3 3 、s s t 2 。另5 m l 抗凝全血用于p b m c s 的分离。 1 5 2p b m c s 的分离 江苏大学硕士学位论文 将5 m l 抗凝血用p b s1 ：1 稀释后，混匀，用滴管沿管壁缓慢加入叠加于1 0 m l 的 人淋巴细胞分离液( 密度为1 0 7 7 9 m 1 ) 的液面上，注意保持清楚的界面。室温中，水 平离一1 二, 2 2 0 0r r a i n ，2 3m i n ，收集试管中间悬浮的一层乳白色的液体，即为p b m c s 。 p b s 洗涤2 次，每次1 8 0 0 r m i n ，离心5m i n 。其中l 2 加入l m lt r i z o l ，放入- 8 0 。c 冰箱， 用于直接提取总r n a 。 1 5 3 实验试剂 人淋巴细胞分离液天津灏洋生物制品科技有限责任公司 t r i z o l 美国i n v i t r o n 公司 1 5 4 实验仪器 恒温水浴箱上海山连实验设备有限公司 超净工作台苏州工业园区三兴净化有限公司 离心机金坛医疗仪器厂 电子分析天平上海良平仪器仪表有限公司 8 0 低温冰箱 日本三洋 1 6 主要研究目的、内容和意义 扩张型心肌病是严重危害人民群众身体健康和生命安全的严重疾病，其发病有 逐步上升的趋势，死亡率较高，一般出现症状后5 年存活率4 0 ，1 0 年存活率2 0 。 由于其症状隐匿，很多患者就诊时心脏已经明显扩大，并出现严重的充血性心力衰 竭，因此，尽早有效地诊断和控制心力衰竭已成为扩张型心肌病的基础治疗，直接 关系着预后。以往的诊断和检测标准都侧重于神经内分泌系统，现在发现生物机械 刺激所致的力学超负荷所致的心脏反应也能导致损害性的收缩反应和致死性心律 失常，因此，弄清力学诱导途径可发现新途径来预防心力衰竭，同时也可以将神经 内分泌系统和力学系统有机结合，将更有助于心衰的诊断和控制。 本研究旨在初步观察扩张型心肌病患者外周血单个核细胞中i l 3 3 s t 2 信号通 路的表达和分泌，并探讨其与心衰相关指标的相关性，为改善d c m 临床早期诊断 和治疗，提高患者生存质量，降低死亡率提供可靠的理论依据。 江苏大学硕士学位论文 第二章e l i s a 法检测两组患者血浆中i l 一3 3 和s s t 2 水平 酶联免疫吸附测定( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 简称e l i s a ) 是在免 疫酶技术( i m m u n o e n z y m a t i ct e c h n i q u e s ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定 技术，其原理是1 ) 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2 ) 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫 活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本( 测定其中的抗体或抗原) 和酶标 抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固 相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与 标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色 产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或 定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达 到很高的敏感度。 2 1 材料 2 1 1 实验试剂 ” 人i l 一3 3e l i s a 试剂盒 人s s t 2e l i s a 试剂盒 2 1 2 实验仪器 酶联免疫检测仪( b e n c h m a r kp l u s ) t s 2 0 0 0 a 型多用脱色摇床 2 2 方法 美国r & d 公司 美国m d l 公司 美国b i o r a d 公司 海门市麒麟医用仪器厂 2 2 1 应用酶联免疫吸附法( e l i s a ) 直接定量测定上清液中i l - 3 3 含量 ( 一) 实验前准备 1 ) 使用前将盒内各试剂取出，室温放置3 0 分钟。 2 ) 准备各种实验仪器，如微量移液器、灭菌过的枪头、医用蒸馏水等。 ( 二) 操作步骤 1 ) 取出酶标板，设空白孔、标准品孔、待测样品孔。在酶标板上标准品孔中 7 江苏大学硕士学位论文 加入稀释好的标准品5 0 u l ，在样品孔中先加样品稀释液4 0 u l ，然后再加待测样品1 0 u l ( 样品最终稀释度为5 倍) 。轻轻晃动混匀，3 7 c 温育3 0 分钟； 2 ) 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡3 0 秒，甩去洗涤液，用吸 水纸拍干。如此重复5 次，拍干； 3 ) 每孔加入酶标试剂5 0 1 1 l ，空白孔除外。轻轻晃动混匀，将酶标板置于3 7 c 温 育3 0 分钟； 4 ) 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡3 0 秒，甩去洗涤液，用吸 水纸拍干。如此重复5 次，拍干； 5 ) 每孔先加入显色剂a 5 0 u l ，再加入显色剂b 5 0 u l ( 显色剂b 对光敏感，需避光 保存) ，轻轻振荡混匀，3 7 避光温育l o 分钟； 6 ) 取出酶标板，每孔加入终止液5 0 u l ，终止反应； 7 ) 测定：以空白孔调零，在4 5 0 n m 波长下测定各孔的吸光度值( o d 值) ，测 定须在加入终止液后1 5 分钟内进行； 8 ) 根据标准品的溶度和对应吸光值制备标准曲线，在根据样品的o d 值在回归 方程上计算样品溶度。 2 2 2 应用酶联免疫吸附法( e l i s a ) 直接定量测定上清液e 0 s t 2 的含量 ( 一) 实验前准备 1 ) 使用前将盒内各试剂取出，室温放置3 0 分钟。 2 ) 准备各种实验仪器，如微量移液器、灭菌过的枪头、医用蒸馏水等。 ( 二) 操作步骤 1 ) 在标准孔中加入1 0 0 u l 标准品，样品孔中加入8 0 u l 样品稀释液，然后加入2 0 u l 血清样品，2 0 2 5 摄氏度孵育1 小时。 2 ) 弃去液体，甩干，加满稀释后洗涤液，震荡3 0 秒，甩去洗涤液，拍干，重 复4 次。 3 ) 每孔加入1 0 0 u l 检测液室温孵育1 小时。 4 ) 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡3 0 秒，甩去洗涤液，用吸 水纸拍干。如此4 次。 5 ) 加入1 0 0 u l 底物，室温孵育3 0 分钟。 6 ) 加入1 0 0 u l 终止液 8 江苏大学硕士学位论文 7 ) 读数，分别在4 5 0 n m 和6 2 0 n m 波长处检测o d 值，在加入终止液后3 0 分钟内 检测。 ( 三) 计算结果 1 ) 计算每个标准品的平均吸光值 2 ) 以溶度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 3 ) 在标准曲线上读出样品的吸光值所对应的样品溶度，需乘以稀释倍数。 2 3 统计学方法 非正态分布计量数据用中位数( 四分位数间距) 表示，组间两两比较用w i l c o x o n 秩和检验；多组比较采用k r u s k a l w a l l i s 检验，p o s t h o c 分析采用n e m e n y i 法检验； 相关分析采用s p e a r m a n 直线相关分析，p o 0 5 ) ，根据年龄、性别、e f = 2 5 、e f = 4 0 、e f = 5 5 进行分组， 结果显示与年龄、性别、e f 值水平没有明显相关性( 均p 0 0 5 ) ，与尿酸水平正相 关( f o 3 1 2 ，p = 0 0 2 7 ) ，与血清s s t 2 水平负相关，但无统计学意义( f o 2 4 9 ， p = - 0 0 6 5 ) 。 2 4 2 两组患者血浆中s t 2 溶度分析 对照组与d c m 组血浆中s t 2 溶度呈偏态分布，中位数( 四分位数间距) 分别 为0 3 2 ( o 1 7 0 3 9 ) n g m l 、o 7 7 ( o 6 8 - 0 9 8 ) n g m l ，通过w i l c o x o n 秩和检验，与 对照组相比，d c m 组患者血清s t 2 浓度明显升高，差异具有统计学意义( 氏0 0 5 ) 。 2 4 3s t 2 浓度与b n p 、b u n 、l v e f 、年龄及心衰病史之间的关系 通过s p e a r m a n 直线相关分析发现，s t 2 浓度与b n p 、b u n 浓度正相关，与 l v e f 值负相关，与年龄和之前的心衰病史无关( 表2 1 ) 。 表2 is t 2 浓度与b n p 、e f 、b u n 、年龄及之前的心衰病史之间的关系 t a b2 1t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t 2c o n c e n 仃a f i o n sa n db n p ，b u n ，e f ，a g ea n dh i s t o r yo fh e a r t 9 江苏大学硕士学位论文 f a i l u r e 2 4 4s t 2 浓度与n y h a 心功能分级的关系 k r u s k a l w a l l i s 检验发现随着n y h a 心功能分级增高，血清s t 2 浓度也明显升 高，并且心功能分级不同组之间两两比较，差异均有统计学意义( p o 0 5 ) ( 图2 1 ) 。 i i 级( ，一1 2 ) l i i 级( n 一1 i 奎m i a 分组 图2 1s t 2 浓腰与n y h a 心功能分级的关系 a ：与i i 级相比，p o 0 5 ；b ：与j i i 级组相比，p 0 0 5 ) ，同时我们发现两组患者i l 3 3 m r n a 、 s t 2 l m r n a 的表达量呈明显正相关( r = o 7 5 6 ，p = 0 o o o ) ( 图3 2 ) 。 表3 1 两组患者i l 3 3 m r n a 和s t 2 l m r n a 的c t 值 t a b l e3 1t h ec tv a l u eo f l l - 3 3 m r n aa n ds t 2 l m r n ao f b o t hg r o u p s d c m 组n c 组 i l 一3 3 s t 2 l 3 1 3 6 o 0 93 1 2 8 0 0 7 3 0 5 2 o 1 2 3 0 6 9 o 0 5 6 4 2 1 8 0 6 o 4 0 2 0 i l - 3 3s t 2 图3 1 两组患者i l 3 3 m r n a 和s t 2 l m r n a 相对表达值 f i g3 1t h er e l a t i v ee x p r e s s i o no f l l 一3 3 m r n aa n ds t 2 l m r n ao f b o t hg r o u p s 1 1 1 0 趔艘水圈郴捉罢 江苏大学硕士学位论文 s t 2 图3 2i l 3 3 m r n aa n ds t 2 m r n a 相关性 f i g3 2t h er e l a t i v i t yo f i l - 3 3 m r n aa n ds t 2 m r n a 3 5 讨论 s t 2 最初于1 9 8 9 年在鼠成纤维细胞中被发现，属于i l 1 r 家族成员之一【1 6 】。s t 2 一度被成为孤儿受体，是因为经过数十年都没有发现它的功能配体【1 7 】。s t 2 存在2 种亚型，可溶s t 2 ( s o b u l es t 2 ，s s t 2 ) 和跨膜形式的s t 2 ( t r a n s m e m b r a n es t 2 ，s t 2 l ) ， 二者来自于一个促进m r n a 差异表达的双重启动子。s t 2 l 仅在t h 2 和肥大细胞表面 表达，而在t h l 或其他免疫细胞不表达【1 8 1 ，因此s t 2 l 可能是t h 2 细胞的效应标志物。 2 0 0 5 年从狗的大脑c d n a 文库中发现一个新的i l 1 相关蛋i 兰t t 2 1 】，现在被称为 i l 3 3 ，证实是s t 2 l 的功能配体，这才使研究s t 2 的信号传导、功能反应及其在慢 性炎症疾病和免疫性疾病中的作用成为可能【l9 1 。本研究发现，s t 2 l m r n a 水平在 d c m 组患者与n c 组没有明显差别，分析其可能机制是扩张型心肌病以心肌细胞 凋亡为主，不涉及细胞膜的破坏，对膜上的生物标记物不产生影响，所以跨膜型s t 2 江苏大学硕士学位论文 水平在扩张型心肌病患者不产生明显变化。虽然检测血清中s s t 2 水平在d c m 组 明显升高，但二者并不矛盾。s t 2 l 和s s t 2 来自于一个促进m r n a 差异表达的双 重启动子，在机体内部s s t 2 和s t 2 l 是独立调控的【4 9 5 0 1 。 i l 3 3 m r n a 在人和鼠的多种器官和细胞类型中表达【捌；有人通过实时定量p c r 的方法得到的结果表明i l 3 3 在呼吸道、消化道等与外界接触的粘膜系统具有较高 表达水平f 3 ，在肺脏和真皮纤维细胞经t n f q 和i l 一11 3 刺激后可以诱导表达。因为 i l 3 3 也具有与i l o l a 和h m b g l 类似的核表达功能及由坏死细胞分泌的性质，所以 在细胞水平，i l 3 3 主要在成纤维细胞【4 、上皮细胞【蜘和内皮细胞【4 2 删中表达，人 的单核巨噬细胞和树突状细胞只能低表达i l 一3 3 4 1 1 。 本实验中，我们发现i l 3 3 m r n a 表达水平在两组患者没有明显差别，原因可 能是( 1 ) i l 3 3 主要在冠状动脉血管内皮中高表达，我们取材于外周血单个核细胞， i l 3 3 m r n a 在其中低表达；以后我们可以取材血管内皮或是成纤维细胞，探讨其 中的m r n a 表达；( 2 ) 关于心血管系统中i l 3 3 表达和分泌的具体机制尚不清楚， 也许为了证实i l 3 3 的生物作用和调控它产生的分子机制需要进行体内研究。 i l 3 3 是s t 2 l 的功能配体，其功能的发挥需要s t 2 l 的存在，实验中我们发现， 在外周血单个核细胞中i l 一3 3 m r n a 与s t 2 l m r n a 表达量具有明显的正相关性， 表明在这些细胞中二者是高度共调控的，与b a r t 吼e k 【5 2 】等的研究结果一致。 3 。6 小结 1 i l - 3 3 m r n a 和s t 2 l m r n a 表达量在d c m 组和n c 组没有明显差别。 2 i l 一3 3 m r n a 和s t 2 l m r n a 表达量高度正相关，高度共调控。 1 9 江苏大学硕士学位论文 第四章w e s t r e nb l o t 法检测两组患者p b m c s 中i l 3 3 和s t 2 l 蛋白水平 测定原理：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白质样品，再转移到固相载 体( 例如硝酸纤维素薄膜) 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电 泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色 或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 4 1 材料 4 1 1 实验试剂 蛋白酶抑制剂p i 0 0 3上海奇康生物科技有限公司 p v d f 膜美国r o c h e 公司 m o u s em o n o c l o n a li l 3 3a n t i b o d ys a n t ac r u z 公司 m o u s em o n o c l o n a ls t 2 a n t i b o d y s a n t ac r u z 公司 p r e s t a i n e dp r o t e i nm o l e c u l a re i g h tm a r k e r美国m b i 公司 m o u s em o n o c l o n a lg a p d ha n t i b o d y博士德生物工程有限公司 4 1 2 实验仪器 超声匀浆仪 核酸蛋白定量仪 双光束紫外分光光度计 垂直蛋白电泳仪 分子成像系统 4 2 实验方法 b r a n s o e p p e n d o r f 美国p e 公司( l a m b d ab i 0 2 0 型) 美国b i o r a d 公司 美国b i o r a d 公司 4 2 1 样品蛋白浓度的测定：采用b c a 蛋白浓度测定法 根据样品数量，按5 0 体积b c a 试剂a 加l 体积b c a 试剂b ( 5 0 ：1 ) 配制适量b c a 工作液，充分混匀。 用0 9 n a c l 完全溶解蛋白标准品，取1 0 1 x l ，用0 9 n a c l 稀释至1 0 0 p 1 ，使终 江苏大学硕士学位论文 浓度为0 5 m g m l 。 将标准品按0 ，1 ，2 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，2 0 p l 加到9 6 孔板的标准品孔中，加0 9 n a c i 补足至l j 2 0 1 t l 。 加适当体积样品到9 6 孔板的样品孔中，加0 9 n a c l 到2 0 p l 。 各孔加入2 0 0 1 db c a t _ 作液，3 7 c 放置3 0 m i n 。 用5 4 0 5 9 5 n m 之间的波长分光测定，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 4 2 一电泳样品的制备 用4 电泳加样缓冲液将所有样本蛋白浓度稀释至1 p p l ，9 5 。c 的水浴箱水浴加 热5 1 0 分钟，迅速用碎冰淬火，样本待测。 4 2 3s d s p a g e ( - - ) s d s p a g e 凝胶制备： 将玻璃板、样品梳、电泳槽用洗涤剂沈净，用d d h 2 0 冲洗数次，再用乙醇 擦拭，晾干。 装好玻璃板，将配制好的1 0 分离胶5 m l ( i l 3 3 分子量约为3 1 k d ，s t 2 分子 量约为6 3 k d ，配方见表1 ) 混匀；向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层去离子水， 大约2 0 m i n 后胶即可聚合。 将5 浓缩胶2 m l 混匀；滤纸吸干分离胶上层去离子水，灌制浓缩胶，立即插 入样品梳。 等待凝胶聚合后，小心拔出样品梳，等待加样。 ( 二) 电泳： 样品处理：2 8 u l 样品中加入上样缓冲液7 u l ，沸水浴5 m i n 。 装好电泳系统，加入电泳缓冲液，将己处理好的样品上样，接通电源， 首先电压1 2 0 v ，直到样品在浓缩胶底部成一直线。 然后电压8 0 v ，至溴芬蓝到达分离胶底部。 ( 三) 转膜： 在电泳结束后，用切胶刀分离胶板，切除加样孔，在 i r i s 甘氨酸缓冲液中漂 洗数秒。 打开电转印夹，每侧垫上一块用转膜液浸泡透的海绵挚，再各覆盖一张转膜 液浸透的滤纸，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将甲醇浸润处理的p v d f 膜平放 2 l 江苏大学硕士学位论文 在凝胶上，去除气泡。 夹好电转印夹，插入加满转膜液的电泳槽中，p v d f 膜- t 贝 j 对应正极，1 1 0 v ， 3 h ，转膜。 ( 四) 膜的封闭： 用1x t b s t 洗液，室温漂洗p v d f 膜3 次x 1 0 m i n ，以尽量洗去p v d f 转印膜上的 s d s 。 室温下将p v d f 膜置于封闭液中( t b s t + 5 脱脂奶粉) ，摇床震荡，室温封 闭1 h 。 再用1x t b s t 洗液室温漂洗3 次x10 m i n 。 ( 五) 抗体杂交： 封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入一抗( i l 3 3 、s t 2 l 、g a p d h 抗体滴度 均为1 ：5 0 0 ) ，4 。c 冰箱过夜。 第2 天用t b s t 在平缓条件下漂洗3 次，每次1 0 m i n 。 膜放入杂交袋中，加入1 ：5 0 0 的内参g a p d h ，4 。c 冰箱过夜。 第3 天用t b s t 在平衡条件下漂洗3 次；每次1 0 m i n 。 加入1 ：5 0 0 辣根过氧化物标记过的的二抗( 二抗均为羊抗小鼠抗体) ，温孵1 小时。 然后用t b s t 漂洗液漂洗3 次，每次1 0 m i n 。 ( 六) 检测方法：用d a b 法 用滤纸尽量吸尽p v d f 膜上的去离子水，加入混合好的d a b 显色液( 按每0 5 m l h 2 0 力 i 显色费t 1 a 、b 、c 各l 滴，混匀) 。 室温平缓摇动显色，观察颜色反应，一旦特异性蛋白带颜色达到要求，即用 去离子水漂洗终止颜色反应，密度扫描并进行拍照。 用b a n d s c a n 软件计算灰度值。 江苏大学硕士学位论文 表4 1 ：各浓度s d s p a g e 凝胶配方 t a b l e4 1 ：p r o t o c o lo fs d s p a g ew i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n 注：分离胶g e lb u f f e r ：1 5 m ir i s h c i ，p h8 8 ：浓缩胶g e lb u f f e r ：0 5 mt r i s h c l ，p r i6 8 4 3 统计学分析 正态分布计量资料以均数标准差表示，组间两两比较采用两样本t 检验；非正 态分布计量数据用中位数( 四分位数间距) 表示，组间两两比较用w i l c o x o n 秩和检验； 多组比较采用k r u s k a l - w a l l i s 检验，p o s t - h o e 分析采用n e m e n y i 法检验；相关分析采 用s p e a r m a n 直线相关分析，p 0 0 5 为差异有统计学意义。 4 4 结果 与n c 组比较，d c m 组患者i l 3 3 蛋白水平没有明显差异；s t 2 蛋白水平明显升 高，差异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。 表4 1 两组患者i l 3 3 、s t 2 l 蛋白检测结果( 娃s ) r i l - 3 3 g a p d hr s t 2 g a p d h d c m 组( n = 3 6 ) o 9 5 o 0 2 1 5 0 o 1 4 奉 n c 组( n = 3 6 ) o 9 3 0 0 41 2 2 0 0 9 注：与n c 组比较，幸p 0 0 5 江苏大学硕士学位论文 3l 蛐 6 3 k d 注：g a p d h 为内参照 图4 1 ：各组患者i l - 3 3 、s t 2 l 蛋白电泳图 f i g4 1 ：e l e c t r o p h o r e s i sp i c t u r e so fl l - 3 3 、s t 2 lp r o t e i n si nd i f f e r e n tg r o u p s 注：与n c 组比较，木p 0 0 5 图4 2 ：两组患者i l 3 3 、s t 2 l 蛋白水平比较 f i g4 2 ：c o m p a r i s o no fl l - 3 3a n ds t 2 lp r o t e i nl e v e l sb e t w e e nt w og r o u p s 江苏大学硕士学位论文 4 5 讨论 在蛋白水平，i l 3 3 主要在人血管内皮细胞，成纤维细胞和上皮细胞表达，人活 化的树突状细胞和单核巨噬细胞低水平表达i l 3 3 ，并且佛波脂能诱导这些细胞中 i l 一3 3 的表达。细胞坏死也能诱导全长的i l 3 3 的释放【2 5 之6 1 ，只是具体的分泌机制尚 不清楚。然而在没有前炎症反应刺激时，i l 3 3 定位于细胞核，i l 一3 3 含有一个推断 的d n a 结合结构域，定位于胞核，具体在异染色质亚结构域和有丝分裂染色体上【捌。 i l 3 3 n 端含进化保守的同源结构域螺旋转角螺旋( h t h ) d n a 结合结构域，是核定 位的充分必要条件，并且参与i l 3 3 诱导的转录抑制【2 2 】。因为i l 3 3 也具有与i l 一1 a 和 h m b g l 类似的核表达功能及由坏死细胞分泌的性质，因此有人认为i l 一3 3 也是一个 警示器【2 4 1 ，这可以用来解释为什么i l 3 3 主要由内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞 盘- 1 ： 2 6 - 2 8 1 ，一 o 本实验中，我们发现i l 一3 3 蛋白水平在两组患者没有明显差别，推测其可能原 因是( 1 ) 人单个核细胞低表达i l - 3 3 ，通过翻译产生的蛋白水平也比较低；( 2 ) d c m 患者以细胞凋亡为主，诱导i l 一3 3 释放的程度比较低；( 3 ) 在没有受到炎症反 应因子刺激时，i l - 3 3 主要定位于细胞核，d c m 患者以慢性炎症反应为主，不足以刺 激i l 一3 3 从细胞核中释放。只是关于i l - 3 3 具体的表达和分泌以及调控机制尚不清 楚，尚需要进一步的研究。 s t 2 l 仅在t h 2 和肥大细胞表面表达，而在t h l 或其他免疫细胞不表达【1 8 】，因此 s t 2 l 可能是t h 2 细胞的效应标志物【5 2 】。这可以用来解释我们的研究发现s t 2 l 蛋白 水平在d c m 组明显升高，其可能原因是d c m 4 1 , 力衰竭发生时，启动机体免疫应答，细 胞免疫被激活，t h 2 细胞的表达和分泌增加，s t 2 l 是t h 2 细胞的效应标志物，其蛋 白分泌量也随着增加；另外心力衰竭时，单核巨噬细胞系统分泌的前炎症反应因子 i l - 1 、i l 6 和t n f a 分泌增加，机体通过负反馈机制抑制其分泌，其中一条可能通 路就是单核巨噬细胞中s t 2 基因处于上调状态，其翻译s t 2 l 蛋白增加，抑制i l 1 、 i l 6 和t n f q 分泌，维持机体稳态平衡。 4 6 小结 1 d c m 组和n c 组患者i l 3 3 蛋白水平没有明显差别。 2 d c m 组患者s t 2 l 蛋白水平明显增加。 江苏大学硕士学位论文 第五章主要结论和展望 5 1 主要结论 本研究旨在初步研究扩张型心肌病患者外周血单个核细胞中i l 3 3 s t 2 表达和 分泌水平，主要通过e l i s a 检测血清中l l 3 3 和s s t 2 水平，w e s t r e nb l o t 检测p b m c s 中i l 3 3 和s t 2 l 蛋白水平及实时定量p c r 检测p b m c s 中i l 3 3 m r n a 和 s t 2 l m r n a 表达量，得出主要结论如下： 1 d c m 患者外周血单个核细胞i l 3 3 的表达和分泌水平没有明显变化。 2 d c m 患者血清中s s t 2 水平和p b m c s 中s t 2 l 蛋白水平明显升高。 3 血清s t 2 是有别于n y h a , t , 功能分级、l v e f 值及b n p 的心衰新的生物标记 物，可用于辅助诊断d c m 4 二, 衰及危险分层。 4 d c m 组患者s t 2 l m r n a 表达量与n c 组没有明显差别，与i l 3 3 m r n a 表达 量明显正相关，高度共调控。 5 2 展望 本论文初步研究和探讨了d c m 患者p b m c s 中i l 3 3 s t 2 信号通路表达和分泌 水平的变化，证实d c m 患者s t 2 蛋白水平明显升高，并且与心衰严重程度密切相 关，而i l 一3 3 的表达和分泌水平在d c m 患者则没有明显变化，由于时间和经费限 制，以上只是一些初步探讨，尚有很多问题需进一步研究。 1 s a l l a d a 【3 9 】等的研究表明i l 3 3 s t 2 l 是一