（遗传学专业论文）人类rbbp10和bimα3的克隆和功能研究.pdf

复旦大学博士学位论文人类r b b p l 0 和b i m 3 基因的克隆和功能研究 摘要 细胞增殖和细胞凋亡是多细胞生物控制组织细胞稳态的重要机制。细胞周 期和细胞凋亡异常是多种人类疾病的根本原因。r b 及b c l 一2 家族蛋白为细胞周 期和细胞凋亡的核心控制成分，它们各有其功能特点又彼此协调。用r b 口袋区 结合蛋白保守功能域l x c x e 和b c l 2 凋亡关键功能域b h 3d o m a i n 作为线索扫 描新基因文库，我们分离到了一个新的r b 结合基因一r b b p l0 和2 个新的b i m 异构体一b j m a3 及b i mb5 。 r b b p l 0 编码1 8 2 个氨基酸，广泛低表达于多种人类组织，在肿瘤组织中 表达水平较高。酵母杂交分析提示其具有和r b 结合的能力，同时也可能与肿瘤 标志蛋白p r x1 及人类新基因y r d c 产物相互结合。在h e k 2 9 3 细胞作正，反义过 表达发现，r b b p l 0 和y r d c 可能有正性调节细胞周期作用( 反义过表达导致细 胞增殖下降，对照：3 8 2 5 1 9 8 ；r b b p l 0 ：3 0 6 7 4 - 1 4 2 ：y r d c 一：3 3 5 3 1 0 0 ) ，而p r x1 可能有负性调节细胞周期作用( 正义过表达导致细胞增殖 下降，p r x1 + ：3 0 9 5 1 6 3 ) 。免疫组织化学研究发现r b b p l 0 特异性表达 于乳腺癌的癌巢肿瘤细胞而不表达于癌旁细胞，提示其可能是一个新的肿瘤标志 基因。 b i m q3 编码7 9 个氨基酸，在h e k 2 9 3 细胞其与b i ml ，s q2 有相似的 亚细胞定位特性，过表达引起的细胞凋亡水平与b i m d2 相似( b i ma2 ：3 0 1 4 2 6 6 ：b i m q3 ：3 2 0 5 6 4 2 ) 。提示b h 3d o m a i n 为b i m 获得线粒体定位 及导致细胞凋亡的充要条件。b i m 05c d n a 长3 4 9b p ，用人工导入k o z a k 序 列的对比分析，鉴定了一个新的翻译起始点，确定b i m b5 编码3 6 氨基酸且含 b h 3d o m i a n 。同时人工构建编码2 8 氨基酸且含b h 3d o m i a n 的b i m 日6 。转染 h e k 2 9 3 细胞可导致细胞凋亡，强度比b i m d 3 弱( b i mb5 ：2 8 1 7 ：h i m b 62 8 1 3 ) 。研究首次在细胞水平证明b h 3 核心序列可导致细胞凋亡，并提示 b i m 蛋白b h 3d o m a i nn 侧序列可能有一个加强h i m 导致细胞凋亡的多肽片段。 b i m 的表达谱分析提示b i m 的异构体表达谱可能作为组织细胞分化和组织特性的 标志。b i ml 的酵母双杂交分析发现b i m 主要与m i f 等抗凋亡蛋白结合，没有发 现其与其他b c l2 蛋白结合的证据。 a d 2 9 3 与h e k 2 9 3 对b i m 具有完全不同的反应特性。差减分析发现a d 2 9 3 高表达p a r v i n 、a c t i n 等黏附蛋白及p m s a 3 等抗凋亡蛋白，提示改变细胞黏附 特性可以改变细胞对b i m 介导的细胞凋亡的反应特性。 复旦大学博士学位论文人娄r b b p l 0 和b i m q3 基因的克隆和功能研究 a b s t r a c t c e l lp r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i sa r ee s s e n t i a lf o rd e v e l o p m e n ta n dt i s s u e h o m e o s t a s i st h ei m b a l a n c eb e t w e e np r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i sh a sb e e n l i n k e dt oan u m b e ro fd i s e a s e s r ba n db c l 一2p r o t e i nf a m i l yp l a yac r i t i c a lr o l e i nt h eb i o l o g i c a l b a l a n c e b ys c a n n i m gh u m a nc d n al i b r a r yf o re i t h e rr b b i n d i n gd o m a i no rb h 3d o m a i nc o n t a i n e d n o v e lg e n e ，an o v e lr bb i n d i n g g e n er b b p l 0 a n dt w on o v e li s o f o r m so fb i mw e r ei s o l a t e d ， r b b p l0e n c o d e sa18 2r e s i d u e s p u t a t i v ep r o t e i n a n d e x p r e s s e s u b i q u i t o u s l yi nm a n y h u m a nt i s s u e si naq u i t el o wl e v e l ，a n dt h ee x p r e s s i o ni s h i g hi nt u m o r t i s s u e s y e a s tt w oh y b r i d i z a t i o nr e v e a l e dr b b p l0c a nb i n dr b ， pn ( 1a n dan o v e ih u m a ng e n e - - y r d c o v e re x p r e s s i o no fp n ( 1r e s u l t si n r e d u c t i o no fsp h a s ec e l l s ( c o n t r o l ：3 8 2 3 1 9 8 ：p 1 + ：3 0 9 5 1 6 3 ) a n t i s e n s e so v e 卜e o r e s s i o no fr b b p l0o ry r d cr e s u l t si nr e d u c t i o no fs p h a s ec e l l s ( r b b p i o - ：3 0 6 7 1 4 2 ：y r d c 一：3 3 5 3 1 o o ) t h c w i t h r b b p l0s p e c i f i ca n t i b o d yr e v e a l e dr b b p l0e x p r e s s e di nb r e a s tc a n c e rc e l l d o m et h er e s u l t ss u g g e s tr b b p 10m i g h tb ea p o t e n t i a l m a r k e ro ft u m o r d i a g n o s i s b i m d3 e n c o d e s7 9r e s i d u e s p r o t e i n c o n t a i n e dab h 3d o m a i n e g f p b i m 3f u s e d p r o t e i ng a i n e d t h es a m es u b c e l l u l a rl o c a t i o na s3 c l a s s i c a ib i mi s o f o r m si nh e k2 9 3c e l c e l la p o p t o s i ss i m i l a rt ob i m a2 ( b i m o v e r e x p r e s s i o no fb i m 3r e s u l t si n d2 ：3 01 4 2 6 6 ：b i m q3 ：3 20 5 6 0 4 2 ) u s ea r t i f i c i a ik o z a k c o n s e n s u ss e q u e n c e w er e v e a l e db i m05u s e sa n o v e lt r a n s l a t e di n i t i a ia t ga n de n c o d e s3 6r e s i d u e sw i t hab h 3d o m a i n a s y n t h e s i sc d n a b i m b6e n c o d e s2 8r e i s d u e sw i t hb h 3c o r es e q u e n c ew a s b u i l t o v e r - e x p r e s s i o no fb i m b5o rb i mb e t a6r e s u l t si nc e l ia p o p t o s i s ( b i m0 5 ：2 81 7 ：b i mb6 ：2 8 13 ) t h er e s u l t sr e v e a l e d b h 3d o m a i ni sb o t h e n o u g ha n dn e c e s s a r y f o rm i t c h o n d r i a ll o c a t i o na n da p o p t o t i ca c t i v i t yo fb i m ， a n dt h ea m i n oa c i d sj u s tb e f o r eb h 3d o m a i nm i g h te n h a n c et h ea p o p t o t i c a c t i v i t y o fb i m t h ee x p r e s s i o np a t t e r n o fb i mi s o f o r m si s s p e c i f i c f r o m d i f f e r e n tt i s s u e sa n dd i f f e r e n td i f f e r e n t i a t i o ns t a t e s u c ha ne x p r e s s i o np a t t e r n m i g h tb e a m e a n i n g f u lm a r k e r f o rd e t e r m i n i n gt h et i s s u ed i f f e r e n t i a t i o n ， i i 复旦大学博士学位论文人类p 3 b p l 0 和b i mo3 基因的克隆和功能研究 o v e r - e x p r e s s i o n o fb i mlr e s u l t si nh e k 2 9 3c e l ia p o p t o s i s w h i l ea d 2 9 3 c e l l sd on o t a p o p t o s i sa n y m o r e as s hb e t w e e na d 2 9 3a n d h e l 2 9 3 p r e s e n t sa d h e r i np r o t e i ns u c ha sp a r v i na n da c t i n a n t i a p o p t o s i sp r o t e i ns u c h a sp m s a 3a n db t fw e r eu p r e g u l a t e di na d 2 9 3 t h er e s u l t s s u g g e s tt h e c h a n g e da d h e r i na n da p o p t o s i sp r o t e i ne x p r e s s i o na r er e s p o n s i b l ef o rt h e d i f f e r e n ta p o p t o s i ss t a t er e s p o n s et ob i m 1 1 1 星星查兰堡圭兰竺堕苎鲞堕! ! ! ! 塑望! ! ! 茎里塑塞堕塑望! ! 竺壅 缩写词表 b l a s t ：b a s i cl o c a l a l i g n m e n ts e a r c ht o o l ，同源性检索工具 d i g ：d i g o x i g e n i n ，地高辛 e b ：e t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 e s t ：e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，表达序列标签 h u g o ：h u m a ng e n o m e o r g a n i z a t i o n ，人类基因组组织 r b ：r e t i n o b l a s t o m a ，视网膜母细胞瘤 b c l ：bc e l ll e u k e m i ab ，细胞白血病 b h 3 ：b c l2h o m o l o g y3b c l2 ，同源功能域3 r b b p ：r b b i n d i n gp r o t e i n ，r b 结合蛋白 m t c p a n e l ：m u l t i p l e t i s s u ec d n a p a n e l ，多组织c d n a 板 m t n ：m u l t i p l e t i s s u en o r t h e r nb l o t ，多组织n o r t h e r n 杂交膜 o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放阅读框 p a g e ：p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，聚丙烯酰胺凝胶电泳 a p a & l ：a p o p t o t i cp r o t e a s e a c t i v a t i n gf a c t o r1 ，凋亡蛋白酶激活因子1 p b s ：p h o s p h a t e b u f i e r e ds a l i n e ，磷酸盐缓冲液 p c r ：p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，多聚酶链式反应 e r k ：e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e l a t e dk i n a s e ，细胞外信号相关激酶 j n k ：cj u nn t e r m i n u sk i n a s e ，j u nn 端激酶 r t - p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，逆转录p c r t n f ：t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ，肿瘤坏死因子 3 - u t r ：3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，3 非翻译区 5 - u t r ：5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，5 非翻译区 g r b l o ：g r o w t h f a c t o rr e c e p t o rb i n d i n gp r o t e i n1 0 ，生长因子受体结合蛋白1 0 m i f ：m a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r ，巨嗜细胞移动抑制因子 i h c ：i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，免疫组织化学 t c r ：tc e l lr e c e p t o r ，t 细胞受体 s s h ：s l e c ts u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n ，差减杂交 b i m ：b c l 2i n t e r a c t i n gm e d i a t o ro fc e l ld e a t h 一一 塞呈丕兰竖主兰坚堡兰叁鲞塑! ! ! ! 璺i ! 娈! ! 堕塞堕塑堡! ! 堡窒 基本实验流程 口袋区结合序列l x c x e - - r b b p l 0 酵母 双杂 交 筛 选 胎 脑 文 库 y r d c ， p r x l 等 验 证 与 r b 结 a 表达 谱及 亚细 胞定 位分 析，过 表达 及反 义与 细胞 周期 原核 蛋白 质表 达 多克 隆抗 体制 备 肿瘤 免疫 细胞 化学 人 工 a 口 成 相互作用结构域一b h 3 一h i m a3 酵母双杂交筛选胎心文库 g r b l 0s h 2d o m a i n 等2 7 条基因 袭达谱过表达 反义，细胞凋亡 a d 2 9 3 ，h e k 2 9 4s s h 酵母杂交( 交 配实验) l s 2 3巧f幅me舭舭邯邮邮溅然董蕈 墨呈查兰竖主兰堡堡壅垒鲞堕! ! ! ! 塑塑竺! ! 堕塞堕塑兰! ! 塑窒 i ir b b p 与细胞周期调控 第一章前言 r b b p 和b i m 研究概述 r b ( 视网膜母细胞瘤蚤白) 基因是最早发现的肿瘤抑制基因，r b 基因的失活或缺 失会导致视网膜瘤或骨肉瘤等多种人类肿瘤形成，大约9 0 人类肿瘤有r b 功能状态 改变( f r i e n d ，e ta l1 9 8 6 ，l e e e ta l1 9 8 7 ，b o o k s t e i ne ta l1 9 9 0 ，l i p i n s k ie ta l1 9 9 9 ， l e f e v r ee ta l2 0 0 1 ，g u oe ta l2 0 0 1 ，m a l u m b e r sa n db a r b a e i d2 0 0 1 ) 。表明r b 在肿瘤发 生中起重要作用。r b 功能的缺失会导致细胞增殖失控，而野生型r b 的导入能抑制 细胞生长和肿瘤发生( s w a n t o n2 0 0 4 ) 。 r b 基因家族包括3 个成员：r b 、p 1 0 7 年d p l 3 0 ( f r i e n d e ta l 1 9 8 6 ，l i p i n s k ie ta l1 9 9 9 ， l i p i n s k ie ta l2 0 0 1 ，c l a s s o n a n dd y s o n2 0 0 1 ) 。其中r b 基因是一种被广泛研究的肿瘤 抑制基因。r b 为一种细胞周期依赖性核蛋白。低磷酸化的r b 存在于细胞周期的g l 期。r b 磷酸化在g 1 晚期开始，延续到m 期。低磷酸化的r b 代表活性形式，可与其 它核蛋白或d n a 结合( 如细胞周期转录因子e 2 f 家族) 。r b 与e 2 f l 结合导致e 2 f 1 由活性正调控状态变为负调控状态，r b e 2 f 1 d n a 复合物可抑制其它序列特异性 d n a 结合蛋白与其附近的启动子片段结合，最终通过抑制转录而抑制细胞生长 ( s k a p e k e ta l1 9 9 6 ) 。 ：鬻 p r o l i l e r a l i n 9 r e v e r s i b l e t e r m i n a l c e l lc y c l ea r r e s t d i f f e r e n t i a t i o n 图1 ：r b 与其他蛋白质的相互作用及对细胞周期的影响( a ：e 2 fo r l i k e ；bd - t y p ec y c l i n ：c m i t o z i n ， p p i k r b k ；d ：m y o d o r l i k e s ，e ：s u c h a sp u l ，e l b l r b p 4 8 4 8 ，a d p o t f r o ms k a p e kc ta l1 9 9 6 ) 复旦大学博士学位论文八类r b b h 0 和b i mo3 的克隆和功g 研究 r b 的失活可以是突变产生的，也可由于结合了病毒原癌基因产物( 如s v 4 0 大 t 抗原) 而导致失活( l e e e ta l1 9 9 8 ，r o b i n s o ne ta l2 0 0 1 ) 。这种失活发生在r b 蛋白 的口袋区。失活的r b 会释放e 2 f 1 ，游离e 2 f 1 则活化转录，能导致细胞的异常 生长，许多因子包括病毒性原癌蛋白，都通过与r b 口袋区结合控制r b 蛋白的功 能，从而控制细胞周期及肿瘤发生( l e ee ta l1 9 9 8 ，w o i t a e he ta l1 9 9 9 ，r o b i n s o ne ta l 2 0 0 1 ，f a ne ta l2 0 0 l ，h e l i ne ta l2 0 0 l ，w e ne ta l2 0 0 1 ) 。 到目前为止，已经发现了4 0 多个r b 结合蛋白( l i p i n s k a n dj a c k1 9 9 9 ) 。结合 e 2 f 蛋白质是r b 调节细胞周期的核心环节( h e l i n1 9 9 2 ，n e v i n s1 9 9 8 ) 。低磷酸化的 r b 可以结合e 2 f ，而高度磷酸化的r b 则释放e 2 f 从而使细胞越过g l 限制( h e l i n e ta l1 9 9 2 ，h i e h e ae ta l1 9 9 2 ，s e l l e r se ta l1 9 9 5 ) 。而调节r b 磷酸化的蛋白质在肿瘤中 也常见突变( h a l la n dp e t e r s1 9 9 6 ) 。 另一方面，有一些r b 结合蛋白质如：大t 抗原、e 1 a 、h p ve 7 ，虽然功能和 蛋白质大小有差异，但都与e 2 f 一样有一个保守的r b 结合域一l x c x e ，他们通过 l x c x e 与r b 的口袋区结合并置换出e 2 f ( d y s o n e ta l1 9 9 2 ，w e na n d a o2 0 0 1 ) 。l x c x e 具有与r b 结合的充分条件，但不同的r b 结合蛋白的l x c x e 保守序列的周围序列 对结合的强度合特异性有一定影响。极性氨基酸和疏水氨基酸可增加结合力，而l y s 和a r g 则其相反的作用( f i g g e e ta l1 9 9 3 ，l e ee ta l1 9 9 8 ，w e l c ha n dw a n g1 9 9 2 ，w e n a n da o2 0 0 1 ) 。r b o g 和人类r b b p 9 是新近克隆的两个r b 结合蛋白。他们通过 l x c x e 序列与r b 结合并可以引起细胞转化( w o i t a c h e ta l1 9 9 9 ，w o i t a c he ta l1 9 9 8 ) 。 r b t t 9lpfi lete lhcdext i i q b o g lpf ete lhcdekti 。stdd 砰w 甑7dlqpet tdlycyeq lnd sses s v 4 0l y耳 f 冀e e 再lfcse 丑一奠p ssdde 曲5e 1 a hlvp 五vidltcheagfpp s 立坠e 图2 ：r b b p l 0 的r b 结合区域以及酪蛋白激酶磷酸化结合位点与其它r b 结合蛋白的序列比对。 其中阴影部分为r b 结合蛋白区域( l x c x e ) ，下划线部分为酪蛋白激酶磷酸化结合位点 1 2h i m 与细胞凋亡 在细胞因子和激素对细胞的增殖水平和凋亡的影响方面，现在一般都基本能确 定相应的受体和最后的结果。而对信号传导的途径的认识程度差异较大。细胞因子 介导的细胞凋亡一般通过两条途径。一方面，以n 师为代表的细胞因子通过激活细 胞表面死亡受体而启动c a s p a s e 级联反应导致细胞凋亡，该途径对有对应受体的细胞 翌查兰! 垦主兰垡堡塞一鲞塑! ! ! ! 塑! 塑! ! 塑塞堕塑塑! ! 婴塞 具有良好的一致性，所以细胞膜凋亡途径研究相对较清楚( g u p t ae ta l2 0 0 f ) 。 另一方面，大部分细胞因子调节细胞凋亡通过线粒体途径，最初被描述为细胞 因子撤离引起得细胞凋亡，虽然该途径中从b c i 2 - b a x 功能状态改变导致线粒体释放 c y tc 等线粒体源性凋亡因子到细胞凋亡的过程也基本清楚。但对于信号如何传导到 线粒体表面，尤其是同一信号分子如何发挥完全相反的作用的机制还不能明确解释 ( h i l d e m a n e ta l2 0 0 2 ) 。显然在受体下游具备产生差异的分子背景。 在线粒体途径中，线粒体蛋白质b c l 2 被认为是核心分子。该途径中的许多分子 都与b c l 一2 存在部分功能域的同源性。而在b c l 2 家族蛋白质中，他们可能是线粒体蛋 白质，也可能是细胞浆蛋白质；不同的分子可能作为凋亡信号的感受器，也可能是 凋亡的执行者：他们即可能是凋亡分子，也可能是抗凋亡分子( a d a m sa n dc o r y1 9 9 8 g r o s se ta l1 9 9 9 ，s c o r r a n o ila n dk o r s m e y e rs j2 0 0 3 ) 。而最近一个对该家基因的突 变分析提示他们是密切相关的( p u t c h ae ta l2 0 0 2 ) 。 b i m 最初被鉴定为一个b c l 2 相关的凋亡分子，其与b c l ，2 只有个同源区一为 b h 3 - o n l y ( b c l 一2h o m o l o g d o m a i n3o n l y ) 蛋白，是目前认识到的线粒体凋亡途径的最 早的一个功能分子( o c o n n o re ta l1 9 9 8 ，h s ue ta l1 9 9 8 ) 。h i m 对维持白细胞稳态 及淋巴细胞激活凋亡功能是必须的( b o u i l l e t e ta l1 9 9 9 ，y o k o y a m ae ta l2 0 0 2 ) 。该基因 在正常免疫系统发育及免疫缺陷疾病的产生中有重大意义。有研究发现，h i m k n o c k o u tt 细胞可在体外抵抗由t c r 引起的细胞凋亡，而b i mk n o c k o u t 小鼠则失去 了在体内自动剔除超抗原激活t 细胞的能力( b o u i l l e t e ta l2 0 0 2 ，s o h ne ta l2 0 0 3 ) 。也 有报导b i m 在前列腺癌和老年性痴呆中有异常表达，提示其可能与退行性疾病及肿 瘤发生有一定关系( e n g i d a w o r k e ta l2 0 0 1 ，l i ue ta l2 0 0 2 ) 。 有报导b i m 的表达是由f k h r 。l i 调控的( d i j k e r s e ta l2 0 0 0 ) 。n o r t h e r n 分析 发现其有3 个不同的转录本，但到目前为止没有研究揭示这些转录本与h i m 异构体 及蛋白质表达的关系( h s u e ta l1 9 9 8 ，l i ue ta l2 0 0 2 ) 。到目前为止，9 个哺乳动物b i m 异构体已有研究报道。3 个经典异构体( b i me l ，b i mla n db i ms ) 都含有b h 3 d o m a i n 、c 端疏水d o m a i n 。b i ms 没有d y n e i n b i n d i n gd o m a i n 为致凋亡作用最强的 异构体( o c o n n o re ta l1 9 9 8 ，m a m ie ta l2 0 0 1 ) 。2 个b i ma 异构体含b h 3d o m a i n 与 d v n e i n b i n d i n gd o m a i n ，没有疏水d o m a i n ，可定位于线粒体，但致凋亡能力较3 个经 典异构体低。4 个b i mo 异构体没有b h 3 d o m a i n ，无法定位于线粒体，也没有致 凋亡能力( m a m ie ta l2 0 0 1 ) 。b i m 可能通过激活b a x 而发挥致凋亡作用( m a r a n i e ta l 2 0 0 2 ) 。 目前一般认为b h 3d o m a i n 为b i m 的核心功能域，d y n e i n - b i n d i n gd o m a i n 可能通过l c 8 与微管蛋白结合而使b i m 通常处于失活，疏水d o m a i n 则可能与线粒 4 复旦大学博士学位论文人类r b b p l 0 和h i ma3 的克隆和功能研究 体定位和加强致凋亡能力有关( r o d r i g u e z c r e s p o e ta l2 0 0 1 ) 。 与t 细胞抗原激活的凋亡不周，大部分分化细胞凋亡为默认的程序一如果没有 外界存活因子的信号，细胞将进入凋亡程序。在体外培养细胞中的血清撤离而导致 的细胞凋亡和损伤时导致的神经和肌肉细胞凋亡是实验和临床上常见的事件。有研 究表明，在神经退行性疾病的神经元凋亡和糖尿病后期的的1 3 细胞凋亡都可能与细胞 接受的存活信号不足有关( e n g i d a w o r k e ta l2 0 0 1 ) 。最近有研究报道n g f 刺激在短 期可磷酸化b i m 蛋白质而长期可降低b i m 的表达水平，首次在分子水平提示生长因子 可能通过影n l 自b i m 的功能状态而影响组织细胞的凋亡水平( b i s w a sa n dg r e e n e2 0 0 2 ， g i t l e ye t a l2 0 0 3 ) 。在更广泛的范围内，有研究发现血清存在导致细胞e r k l 2 激活， 通过磷酸化抑带o b i m 功能，从而使细胞存活( l e y r e ta l2 0 0 3 ) 。该结果可能提示存 活因子可能通过相近的途径而使不同细胞取得存活能力。 1 3 r b 与b e l 2 的功能关系 细胞周期控制和细胞凋亡控制是维持组织细胞稳态的两个方面。控制这两个生 物学功能的许多基因往往在两个功能图景中都发挥作用。一般认为细胞周期激动性 基因抑制细胞凋亡，而凋亡激动性基因抑制细胞增殖。但最近研究法发现在细胞周 期和凋亡调控中，有些基因的作用与预期有所不同。m y c 可以促进细胞增殖，同时 也有抑制细胞分化和促进细胞凋亡的作用( e v a ne ta l1 9 9 2 ) 。转基因动物研究发现 b c l 2 可以抑制细胞增殖，而低磷酸化的r b 可以通过脱氨基作用抑制b c l x l 的失活， c d k s 则又促进细胞凋亡的作用。这些实验表明无论是细胞周期激动基因还是凋亡 激动基因，都有与相对应的反面相互作用和自我限制作用的特性( d e v e r m a ne t a l 2 0 0 2 ，k o n i s h ie ta i2 0 0 2 ，b o n n e f o y b e r a r de ta l2 0 0 4 ) a 过表达b c l 2 使细胞逃脱t f d g i 起的细胞凋亡，也明显延迟重新得到细胞因子刺 激时进入细胞增殖周期。在肿瘤中如果高表达b c l 2 则肿瘤的增殖能力较低，r t i j b c l 一2 缺陷的肿瘤增殖力较高( v a u x e ta 1 1 9 8 8 ，m a r v e le ta t1 9 9 4 ，l i n e t t e e t a l1 9 9 6 ) 。且b c l 一2 及其病毒同源蛋白都有相近的作用( b o n n e f o y b e r a r d e t a l2 0 0 4 ) 。另一方面，b a x 过 表达的肿瘤细胞具有较高的增殖水平，且这种作用可以被过表达b c l 一2 年t r 。有研 究表明，b a x x 蝴胞周期的调控可能是通过加决c d k i 蛋自p 2 7 的降解实现的( b o m e r 1 9 9 6 b r a d y1 9 9 6 ) 。硼_ b a x 过表达可以加剧p 5 3 缺陷的组织肿瘤发生( k n u d s o n 复旦大学博士学位论文人类r b b p l 0 和b i mq3 的克隆和功能研究 2 0 0 1 ) 。在已知的b c l 2 功能域中，与凋亡有关的关键结构突变不仅影响其抗凋亡活 性，也影响抑制细胞增殖的能力。般认为，b c l 一2 家族蛋白质发挥不同的主要作用 可能与蛋白质的磷酸化水平有关( b o n n e f o y b e r a r d e ta l2 0 0 4 ) 。然而，在b h 4 的部 分氨基酸突变已经分离到了保持抗凋亡活性而丢失细胞周期抑制作用的突变体，这 种变化被认为与肿瘤恶化有关( v a i r o e ta l1 9 9 6 ) 。 r b 为细胞周期限制的核心蛋白质。研究发现r b 也在细胞凋亡中起重要作用。 r b 缺陷小鼠的部分神经元和晶体细胞凋亡增加( w h i t e1 9 9 4 ) 。而c a s p a s e 降解r b 被认为是细胞凋亡的一个重要限制标志( t a na n dw a n g 19 9 8 ) 。一般认为r b 缺陷造 成e 2 f 游离，从而激活p 1 9 a r f 表达，后者结合m d m 2 f f f f , 造_ 成p 5 3 降解下降，引起细 胞凋亡( c h e na n dt a n2 0 0 0 ) 。事实上，在r b ，p 5 3 联合缺陷的细胞也表王见出细胞对 凋亡诱导因素敏感。实验研究发现，在这些细胞内氧化应激水平没有明显上升，但 j n k 的磷酸化和活性明显提高。且这种情况可被过表达r b 扭转( l a u r i c e l l a e ta l 2 0 0 1 ) 。而j n k 的激活可以通过提高b i m 等转录调控的b c l 2 家族成员的表达水平而影 响细胞凋亡。神经生长因子等细胞因子也是通过影响j n k 和细胞内其他蛋白质磷酸 化而影响细胞凋亡的( g i l l e y e ta l2 0 0 3 ) 。所以j n k 有可能是r b 与b c l 一2 家族瓦相影响 的共同节点。 研究r b 途径和b c l 2 家族的基因的组成、功能特点及可能的功能途径可以加深对 细胞周其核细胞凋亡的有关机理的了解，对指导i 临床诊断和治疗方案的确定都具有 指导意义。 一一墨里奎兰堡主鲎堕堡苎查鲞些! ! ! ! 塑蔓竺! ! 箜塞堕塑些堕墅塞 1 材料与试剂 l ，1 实验材料 第二章材料和方法 m “l t i p l e t i s s u en o n h e r o 膜，美国c l o n t e c h 公司产品 m p a t i p l e t i s s u ec d n ap a n e l ，美国c l o n t e c h 公司产品 m a t a c h m a k e r l e x a 酵母双杂交系统，美国c l o n t e c h 公司产品 硝基纤维素膜( h y b o n d c ) ，美国a m e r s h a mp h a r m a c i a b i o t e c h 公司产品 n y t r a ns u p e r c h a r g e 膜，德国s c h l e i c h e r & s c h u e l l 公司产品 s m a r t r a c ek i t ，美国c l o n t e c h 公司产品 p c r - s l e c tc d n as u b t r a c t i o nk i t 。美国c l o n t e c h 公司产品 p r o t r a nb a 8 3c e l l g l o s e n i t r a t e 德国s c h l e i c h e r & s c h u e l l 公司产品 c y c l e t e s tp l u sd n a r e a g e n tk i t 美国b e c t o nd i c k i n s o n 公司产品 a p o b r d uk i t ，美国b e c t o nd i c k i n s o n 公司产品 1 2 主要试剂、酶类 m a g a p r i m e rd n al a b e l i n gs y s t e m 标记试剂盒， 美国a m e r s h a mp h a r m a c i a b i o t e c h 公司产品 m i c r o s p i ng 5 0 g 2 5 纯化柱，美国a m e r s h a m p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 r e a l p r e p9 6 孔质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 m p i t i s c r e e n9 6 孔d n a 纯化系统，美国m i l l i p o r e 公司产品 q i a p r e ps p i n 质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c kp c r 纯化试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c k 胶回收试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 t 4d n a 连接酶，英国b i o l a b s 公司产品 d n a 分子量标准d l 2 0 0 0 ，大连宝生物公司产品 中分子量蛋白标准，洛阳华美公司产品 各种限制性内切酶，英国b i o l a b s 公司产品 a d v a n t a g e 2d n a p l o y m e r a s e c l o t e c h 公司产品 t a q p l u sid n a 聚合酶，上海生工生物工程公司产品 7 复旦大学博士学位论文人类r b b p l 0 和h i m d3 的克隆和功能研究 p 如d n a 聚合酶，上海生工生物工程公司产品 t a q 酶，复旦大学遗传学国家重点实验室产品 d n t p s ，上海生工生物工程公司产品 所有引物都由上海生工公司合成 g s t - 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