（遗传学专业论文）利用creloxp系统的一个markerfree植物表达载体的构建.pdf

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重组已成为获得无标记转基因植物的一个重要工具。c 碍 l o x p 位点特异性重组系统来源于噬菌体p l ，由两部分组成：重组酶c 和它 的识别位点l o x p 。c i r e 重组酶介导重组事件导致两个相邻的同向1 0 】【p 位点之问 的d n a 片段被删除。 本实验利用植物表达载体p r a i ，m c s 构建一个新型实用的可选择性去除标 记基因的植物表达载体和r n 越载体，所有的选择标记基因( 包括组成型启动子 p a d h l 启动的g f p 和c a m v3 5 s 启动的劭r 基因) 插入两个同向的1 0 x p 位点 之间，通过热激诱导，位于h s p l 8 2 启动子下游的c 托l o x p 重组酶系统将被 激活并诱导发生重组反应，所有选择标记基因和重组酶c 障本身的序列将被切 除。 上述植物表达载体和r n a i 载体可广泛应用于培育无选择标记的转基因植 物。 关键词：植物表达载体p r a i ，m c s ，无标记转基因植物，位点特异性重组， c r e 1 0 x p 系统 3 山东大学硕士论文 w i t ht h ed c v e l o p m e n to fp l 卸tb i o t e c h i 吣l o g y ，g e n c t i ct r a n s f o 咖a t i o no fc m p p l a n t si sb c c o m i n gi n c 陀鸹i n 酉y 删t i i l c 锄ds h o w si 协p o t c m i a la p p l i c a t i 帆v a l u ci n c i o pb e d i n g a sw ca l ll 【i i o w ，狮t i b i o t i cr c s i s t a n c cg c n 鼯盯ec o m m o n i yu d 勰 s e l c c t a b l cm a r k e 鹤f o rt h e 辩l e c t i o n0 ft r a n s f o 响a n t sf 如mal a r g e 肌m b c ro f u n n a n s f o 珊e do e l l s h o w e v c r ，o n c ct 瑚s g c n i cp l 柚t sa f cr e g c n e r a t e d ，卸t i b i o t i cf c s i s t a n c cg c n 髓 n ，e u f i l lp u r p o b u tt h e y 鲫1 t i n u et oe x p r e 鼯t h e i r g e n ep r o d u c b 。 c b n s e q u e n n y ，m o a n dm o r ce n v 打伽埘e n t a l 粕dc o n s u m c fc o n c c m sr e g a r d i n gt h e s a f e t y o ft l i e 仃a 璐g c n i c p r o d u c t sc o n t a i l l i n g 辩l e c i a b km a r k e rg c s ( s m g ) i n t 姗s g e n i cp l a l l t s ，a tl e 弱tm e r cw e b et h r c cm a j o fp m b l 锄s ：( 1 ) t h em a r k e rg c m a y h a v en c g a t i v ee 蜀c 。c i so np r o l i f e 翔舡o n 卸dd i 施r e n t i a t i o fp l 卸tc e u s ；( 2 ) t i i e r ci s u n c e n a i n t yr c g a r d i n gt h ee n v i m 姗e n t a ii m p a c to fm 锄y l e c t a b l em a f k e rg e n ：( 3 ) i t i sd i f t i c i i l tt op e r f o 咖m u l t i - d c s i r a b l eg e n c st r a l l s f b 肌a t i o 船u s i n gt h es 枷e i e c t a b l e m a r k c r 1 no r d c rt 0 l v et h e 靶p r o b l e m s ，m a n ya p p r o a c h e sh a v eb e e nd e v e l o p e dt o o b t 血m a r k e r 缸et m s g e n i cp l 卸t s ( m f r p s ) ，w h i c hh 勰s h o 、釉at c n d e n c yt o e l i m i l l a t e 姐ym a f k e rg e n ed n a s e q u e i l c c si nt h ef i n a lp r o d l m d n ar c o o m b i n a t i o nm e d i a i c db y ( hr c l n m b i n a s eh 鹊b c c o m e 觚i m p o r t 加tt 蒯 t o g e n e i a l cm a t k c r - 丘t m s g e n i cp l a n t s ( m f i 甲s ) b c c a u i ti st i m c - s p c 宅i f i c ， t i s s u c s p c c i 丘c 如ds 胁s p e c i f i c 1 1 l ec m i o x ps y s t e mo f b a d e r i o p h a g ep 1i s a s i 皓s p e c i f i cr e c d m b i n a t i s y s t c mt h a t n s i s t s0 f 咖啪p o n e n t s ：t h e 似踟曲i n a 辩 ( c l 嘭柚di t sr e c 0 鲥t i o ns i i 嚣( 1 0 x p ) c 佗m e d i a t r e m b i l i a t i 蚰c v e n t sa i l dc a u s e s t h ee x c i s i o no ft h ed n a s e g m e n tb c 腑e c n 细od i r e c t l ya d j a c c n t l o x ps i t 髓 an o v c lp r a c t 砌b i n a r yv e c t o rt o g e tm a r k e r - f r 仃锄s g e n i cp l 卸t w 勰 c 0 邶t r i i d e db ym o d i f m gt h cp l a n te x p r c 豁i o nv c 咖p ra ir m c s 皿eh e a t s h o c k j n d u d b l ec l o x pd n a c o l n b i n a t i o ns y s t e mw 舔a d o p t e di nt h i ss y s t e mb y u s i n gt 量l ep m m o t c fo f 一，w 6 坳缸历口此口，mh e a ts h o c kp m t e i n1 8 2 a us c l e c t a b l e m a r k c rg e n e s ( g f p 柚d & r ) 粕dc ”c l i z y m cg e n el o c a t c db c m e 佃oi d e n t i c a i 4 山东大学硬士论文 嘶e n t a t i o l ll o x ps i t e sc o u l db c 懿c i s e d 仃咖t h ct 删l s g e n i cg c m cb yn ( r c e x p 础s i 伽t h e l c c t a b l cm a d 【e fg e n 髓：g f p 硒db a r w e r eu n d e rt h e 咖仃o lo f t w o o o n s t i t u t i v ep m 加o t e 璐：a d h lp 姗咖柚dc a m v3 5 sp 舳o t 盯s p c d i v e l y t 1 i ca h d v cn e w l ya e a t e dp i a mc x p r e 姆i o nv e c t o 晤c a nb eu dt od c v c l o p s e l e d a b l em a r k e r 崩n o v a b l ct m s g c n i cp l 锄t sf o rav 撕c t yo fp u r p 伪 k e yw o r d s ：p l 锄te x p r 髓s i v e c t o rp r a l m c s ，m a r k c r - f b e 仃a 璐g c n i cp l 柚t s ( m 兀甲s ) ，s i l e s p e c i f i c 蚤c 湖l b i n a t i 伽s y s t e m ，c m 1 0 x ps y s t e m b s a c l 气p c 瑚 e d ，i ：a g u s m f i 甲s m c s n p l i i n t p c r s d s t h s g f p 符号说明 b o v i n es e f u ma l b u m l n 删i p h p h a t 撇 ( q i l fi n t e s t i n e ) c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i 枷i n e 1 b 仃艄c e t ia c i d 8 一g l u c u 删d a m a r k c r 舭e 仃蜀m s g e n i cp l 柚t s m u l i i p l ec l o n es i t e s n 锄y c i np h o s p h a t ct f a 船f c f 勰ei i n u c l c o t i d c p o l y m e r 舔ec h a i n a d i o n s 0 d i 岫d o d c c y ls u l f a t c t | j m y b d x ) m l e t h y la m j l l o m e t b a n e g e nn u o “强c c n tp r o t e i n 5 牛血清白蛋白 牛胰碱性磷酸酶 十六烷基三甲基溴化铵 乙二胺四乙酸 b 一葡糖苷酸酶 无标记的转基因植株 多克隆位点 新霉素磷酸转移酶i i 核苷酸 聚合酶链式反应 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷 绿色荧光蛋白 山东大学硕士论文 第一部分利用c r e l o x p 系统的一个m a r k e r f r e e 植物表达载体的构建 i 文献综述 1 转基因植物中的标记基因研究进展 随着全球人口数量的急剧膨胀和环境的日益恶化，必须大幅度提高农作物 的产量和品质，以满足人们生活水平不断提高对农作物的要求，而作物改良的现 代农业技术植物基因工程日渐显示其重要性。植物基因工程特别是植物遗传 转化技术以它的独特优势已成为解决全球粮食问题和环境危机的有力工具。自 1 9 8 3 年首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了飞速的发展，人们已 经能用多种方法将外源基因导入植物体内。由于已推广的转基因作物具有优良的 农艺性状，如丰产、抗病、抗虫、抗除草剂等，使得全世界范围内转基因作物的 种类和产量都迅速增加。自1 9 9 6 年始，全球转基因植物研究发展迅速，许多转 基因植物逐渐进人大田，并形成规模化商业种植，种植面积为1 7 0 万公顷：到 2 0 0 1 年底，全球共正式批准1 2 0 多个转基因品种( 品系) ，在1 5 个以上国家种植， 面积达5 2 6 0 万公顷；2 0 0 4 年，全球获批准的转基因作物种植面积为8 1 0 0 万公 顷，种植国家为1 7 个“。2 0 0 4 年全球转基因作物的市场价值( 转基因种子的销 售价加上服务技术费) 约为4 7 o 亿美元；在1 9 9 6 _ _ 2 0 0 4 年的9 年期间，其累加 的全球价值为2 4 0 亿美元；2 0 0 5 年，全球生物技术作物的价值预计将超过5 0 亿 美元。 但是，随着转基因作物产品的应用，人们对转基因植物的生物安全性提出了 许多质疑，最主要的问题是多数转基因系统用抗生素基因、抗除草剂基因等作 为选择标记。这些选择标记基因导入植物体内，赋予转化细胞对某种选择剂的抗 性，在选择剂的作用下，非转化细胞被杀死，而转化细胞由于获得标记基因所赋 予的抗性而存活下来，并进一步增殖和分化，形成转基因植物。选择标记基因的 存在方便了植物转化体的选择，但一旦获得转化植株后，特别是在转基因产品的 产业化过程中，标记基因的存在是多余的，甚至是有害的。其潜在的危险主要有 几个方面即1 ： 山东大学硕士论文 1 转基因作物本身可能变为杂草或通过花粉漂移、杂交等方式使野生近缘 种变为超级杂草。 2 标记基因可能扩散到物种中而造成生态失衡，如产生超级病虫害等。 3 在健康领域，人们担心转基因食品的标记基因及其产物可能对人或动物 健康产生危害。 4 标记基因可能被转移到人或动物肠道共生菌中而产生耐药性，降低或丧 失某种抗生素的治疗作用。 另外，由于转基因植物中标记基因的存在，若要对该植物进行多次遗传操作 则将会受到一定的限制，若标记基因与目的基因由同一启动子驱动，还可能造成 目的基因的失活脚虽然有的抗生素基因如印f i i ，己通过安全性评价嗍，但还 是不能彻底消除人们对转基因植物的担忧。 因此现代育种学家发展了一些新的手段来克服这些问题，其中包括从转化植 物中剔除这些标记基因、采用更加安全的标记基因和没有标记基因的直接转化 等。近年来已经诞生了一批无不安全选择标记的转基因植物，这些转基因植物已 开始取代传统的转基因植物，正在得到社会的承认和接受，具有广阔的应用前景。 1 1 解决由标记基因引发的转基因植物安全性的主要策略 标记基因的安全性问题是近年来国际上关注的热点，目前解决转基因植物安 全性的策略主要有：( 1 ，开发使用非抗性的安全基因标记或对抗性基因标记进行 一定修饰；( 2 ) 在利用传统的抗性标记基因获得转基因植株后采取措穷苣消除标记 基因；( 3 ) 研究开发无标记基因、无载体骨架的转化方法。 1 2 选用安全的标记基因 鉴于世界范围内公众对转基因植物安全性的忧虑，许多研究者已在安全标记 基因的探索中取得了一些进展。使用这类基因作选择标记的转化选择系统与传统 的转化系统不同“”“，它不是将非转化细胞杀死，而是使转化细胞处于某个有利 的代谢或发育条件下，从而筛选出转化植株。这种方法的主要优点在于选择剂的 无毒副作用，且在多数情况下有利于转化植株的再生从而提高转化效率。已经报 道的有糖类代谢酶、与激素代谢相关的选择标记基因、耐胁迫酶基因和对转化细 胞或组织进行实时监控的绿色荧光蛋白基因等。 1 2 1 糖类代谢酶基因“厶脚 7 山东大学硕士论文 有关糖代谢途径的基因中，可用于选择标记的主要有甘露糖磷酸异构酶 ( p h o s p h o 眦n n o s ei s 伽e r a s e ，脚国基因和木糖异构酶( x y l o s ei s o m e r a s e ，删 基因和核糖醇操纵子等。脚编码6 一磷酸甘露糖转移酶，其产物可催化6 一磷 酸甘露糖转变为6 一磷酸果糖。在含甘露糖的培养基上，植物内源己糖激酶依赖 a t p 催化甘露糖磷酸化为6 一磷酸甘露糖，非转化细胞由于不能利用6 一磷酸甘 露糖，造成6 磷酸甘露糖积累并大量消耗a t p ，长期处于饥饿状态，生长处于 停滞状况，只有整合了外源脚基因的转化细胞才能继续代谢6 一磷酸甘露糖， 避免了6 一磷酸甘露糖的大量积累并产生a t p ，为细胞正常生长提供能量，因此 在含有甘露糖的培养基上只有转化细胞能正常生长，而非转化细胞将被淘汰“”。 目前，脚基因已广泛用于水稻、玉米、小麦、大麦和甜菜等植物的转化系统“。 该选择系统用于农杆菌转化玉米幼胚，转化率高达3 0 以上 缈朋基因编码木糖异构酶，其产物能催化d - 木糖与d - 木酮糖互变异构，是 另一种理想的选择标记基因。在以d - 木糖为主要碳源的培养基上，转化细胞因 能利用d 一木糖而获得优势生长，非转化细胞因碳源供应不足而使生长受到抑制。 h a l d r u p 等用d - 木糖作惟一碳源的培养基上筛选转化植物细胞【，在许多植物中 都获得了成功，得到了较理想的效果。用五儿4 基因作选择基因转化马铃薯，其 转化效率比用印t 作选择标记时高9 倍。 核糖醇是自然界中广泛存在的五碳醇之一，一般不能被生物细胞利用，而大 肠杆菌c 菌株却能很好利用，这是因为其中有a 和，f ，州两个紧密串联的操纵 子作用的结果。f a y e t t e 等“”构建成了以r f j 操纵子片段为标记的质粒载体，然 后转化大肠杆菌k 1 2 菌株，转化菌株能够在以核糖醇为碳源的培养基上生长。虽 然目前尚未见到该操纵子转化植物的报道，但是，f 操纵子作为一种非抗生素选 择标记很可能代替抗性基因应用于植物遗传转化中。 作为安全基因标记，虽然这类糖代谢酶的研究已取得一些进展，但不可否认 它们还有许多问题需要解决“”。糖类代谢酶类作为安全基因标记具有巨大的应 用潜力。 1 2 2 与激素代谢相关的选择标记基因 与激素代谢相关的选择标记基因包括印 ( 异戊烯基转移酶) 基因、妇甜( 吲 哚一3 一乙酰胺水解酶) 基因。助f 基因是从农杆菌的1 - _ d n a 中克隆得到的异戊烯 8 山东大学预士论文 基转移酶，与i 从代谢有关。e b i 叫毗嘲用c a m v 的3 5 s 启动子驱动该基因转化烟 草，使生长迟缓型的受体转化成生长正常的株系，这是由于发生了审 - a c d s 的转座作用的结果。k u n k e l 将如t 用地塞米松( d e x a t h a s o n e ) 诱导表达的启动 子驱动劫f 基因转化烟草和莴苣，得到了无安全隐患的转基因植株嘲助t 基因 己广泛用作选择标记，与位点特异性重组的酶系统或转座子系统相结合构建高效 去除选择标记基因的安全转化系统捌j 8 翻( i n d o l 一3 一a c e t 锄i d eh y d r o l y a s e ) 是另外一种与i a a 激素合成代谢相关的选择标记基因嘲，它也是通过调节植物体 内i a 激素的合成代谢而使转化细胞与非转化细胞的生长与分化造成一定差异， 进一步达到筛选出转化细胞的目的。但所有的与激素代谢相关的标记基因作选择 标记时都会因为激素的过量合成而使转化植株呈现畸形，因而它们最终都需要被 剔除或失活田1 1 2 3 耐胁迫基因 这种标记基因的作用和传统的抗性标记基因相似，标记基因编码的产物是一 种酶，可使对细胞生长有毒或有胁迫作用的化合物转变成无毒且对生长有益的化 合物，从而使转化细胞能在含有有毒或有胁迫化合物的培养基中生存，而非转化 细胞则被杀死。 ( 1 ) 甜菜碱醛脱氢酶( b a d h ) 基因。甜菜碱醛脱氢酶( b e t a i n ea l d e h y d e d e h y d r i g e n a s e ，b a d h ) 能催化有毒的甜菜碱醛转变成无毒的甜菜碱，因此，该基 因可用作安全基因标记并有很大的优势。d a n i e l l 等嘲在这方面的有益尝试表明 了甜菜碱脱氢酶基因完全可用作安全的标记基因。 ( 2 ) 汞离子还原酶腮删基因。土壤中有一种细菌，具有把甲基汞转变成离 子汞、离子汞转变成单质汞、并把它排出体外的能力，目前人们已从细菌中分离 出基因册脚，腮朋来，其中腮棚基因编码汞还原酶( 腿r c u r i cr e d u c t a s e ) ，催 化离子汞转化为单质汞，肥坷基因编码甲基汞裂解酶( t h y l m e r c u r y l y a s e ) ， 催化甲基汞转化为离子汞。两个基因联合作用就会将有机汞转化为气态的单质汞 排放到大气中，而单质汞的毒性最低，这样可使汞的浓度降到安全的范围。将这 两个基因导入植物栅，有望转化水体和土壤中有机汞的状态，对污染的土壤和 水体进行生物修复。腮叫基因也可用于选择标记基因，在培养基中加入离子状 态的汞盐，如氯化汞( h g c l ) 作为筛选剂，转化的细胞具有转化有毒的氯化汞为无 9 山东大学硕士论文 毒的单质汞的能力而存活，非转化细胞则受到毒害而死亡，从而达到选择目的。 y a n g 等利用拟南芥的a c t i n 启动脚叫基因在花生中表达，证实了脚叫基因可 用作选择基因的可行性。 1 2 4 荧光素酶基因和绿色荧光蛋白g f p 基因 荧光素酶( l u c i f e r a s e ) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶 的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工 程方面已成为广泛使用的报告基因。z h a n gc l 利用g f p 作标记转化甜菜后证 明，g f p 不仅可以作为一种重要的无毒害的选择标记，而且还可望用于培育无选 择标记的转基因甜菜嘲。 除上述安全标记基因外，报告基因g u s ( 8 一9 1 u c u r o n i d a s e ) 也有望成为安全 韵标记基因应用于植物的遗传转化睁“。g u s 基因的产物能活化细胞分裂素6 一队 的前体( b e n z y l a d e n i n en 一3 一9 1 u c u r o n i d e ) ，使其释放出有活性的细胞分裂素 ( b e n z y l a d e n i n e ) ，从而刺激转化细胞的生长，但非转化细胞则不受影响。据 j o e r s b o 报道，以g u s 基因为选择标记转化植物细胞，用6 一b a 的前体作选择剂， 其转化效率比用卡那霉素标记基因高两倍嘲。 1 2 5 其它标记的利用 除了以上各种标记基因之外，还有其它一些安全的筛选标记：( 1 ) 生物合成 基因嘶”。生物的某些支链氨基酸( 赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸) 的合 成都要经过天冬氨酸的合成途径。其中赖氨酸是由天冬氨酸激酶和二羟基吡啶二 羧基合酶催化合成的。两种酶都受赖氨酸的反馈抑制，细菌来源的这两种酶由于 对赖氨酸不敏感，因此可以作为植物转化的筛选标记，在含赖氨酸的培养基中转 基因植株不受反馈抑制能够存活，而非转基因植株则因赖氨酸反馈抑制不能合成 支链氨基酸而死亡。( 2 ) 筛选标记基因的失活洲。为了减少抗性基因标记的产物 带来的不安全性，一些研究者采用反义r n a 基因，或采用抗体基因等策略使筛选 标记基因失活。其缺点是没有去掉标记基因，仍存在基因的表达和传播的可能性。 此外有人认为色氨酸脱羧酶基因呻1 也可用于标记基因。色氨酸脱羧酶基因的 作用原理与甜菜碱醛脱氢酶基因相同，转化细胞可以将培养基中有毒的色氨酸类 似物解除毒性，存活的个体进而并发育成完整植株。 山东大学硕士论文 1 3 培育无选择标记转基因植株 培育无选择标记转基因植物的策略主要有共转化系统、转座子介导、同源重 组作用、位点特异性重组系统等。 1 3 1 共转化 现已报到了如下两种共转化的方法( 图1 c ) ：( 1 ) 两质粒法：用两个独立的 质粒，其中一个含有选择标记基因，另一个含有目的基因，同时转化目的细胞， 两个质粒可同时整合进植物细胞内。但两个基因多整合在不同位点，经转化植株 后代的遗传重组，目的基因便可与选择标记基因分开，得到无选择标记基因的转 化植株嗍m c k n i g h t 用两个t d n a 载体共转化烟草，一个含有基因印f ，另 一个含n o s ( n o p a l i n es y n t h a s e ) 基因，在获得的1 1 株印l i 阳性植株中，有3 株亦整合了n d s 基因，且在所有的3 株共整合后代中，两个外源基因都发生了分 离经过对各个转化参数的优化，在某些植物中，共转化法中两个基因同时整 合到受体植物的效率己能达到用单一质粒转化方法的效率m 捌( 2 ) 双t d n a 载 体法：目前一般认为，双卜_ d n a 载体法要比混和菌株法的共转化率高得多。双 质粒双菌株、双质粒单菌株的方法不仅共转化率低，而且操作繁琐，需要进 行两次质粒的构建和两次农杆菌的转化。k o l i l a r i 在研究共转化时，发现两个质 粒在转化前经体外同源重组产生了一个含两套t - d n a 的双元载体，其中一套含有 选择标记基因，另一套含目的基因，该双元载体转化的植株，其后代的选择标记 基因与目的基因约有4 0 能独立分离m 但是，k o m a r i 等所进行的t i 质粒的 构建需要在农杆菌内同源重组才能完成，而且质粒非常大，不利于基因克隆； m a t t h e - s 等、x i n g 等“订、b r e i t l e r 等“阳构建的质粒无需同源重组，操作简便， 而且质粒较小，便于基因克隆，是较好的方法。在k o 帆r i 的基础上，l u 等对质 粒的构建方法作了进一步改进，将两个独立的t - d n a 序列改建成含双右边界 t d n a 和一个左边界卜d n a 的序列嘲。用含该t - d n a 的质粒转化水稻，其中3 6 6 4 的转基因后代标记基因与目的基因发生了分离。由于这种质粒比含两个独立 t - d n a 序列的质粒小，容易操作，所以转化频率相对较高。总之，双t d n 矗载体 方法能更高效地获得无选择标记转基因植株。 山东大学硕士论文 踅鼍捧惮记符纂鞫撬雌 c 曩l 攮无嚣挣馨髦赣鼍曩一辨主l 曩 i 转攫乎 羹舟簪簟l 拉威特鼻性童疆熏麓i 以鲥k 为一) 赍肆蔓；c 蕞# 亿肇 - 湛舞悻硭蓐氍l o t 真的l 但；懈j 岱，k 摹曩辨c - t 魁羹碱 量口m 趣鼻t i l 肆童平 毋；：h 任矗 ，im _ 一r 曲_ 和h 钾_ - ，- ￥m _ * b d _ e _ 一f - k - _ _ m - _ - i - “：，- ) ic i 科啊- - - h 目，_ - 誓i - _ - “- 山，一lc i - _ _ l 开 嘲_ h - 黼一o “- 带_ i 1 铆n - 聃i 阳，- m - - 嘲；h 1 3 2 转座子介导转化系统 1 9 5 1 年m c c l i n t o c k 在研究玉米时发现了转座子，转座子成分能够利用保守 的切割粘连机制，从植物染色体中的某个位置转移到新的遗传座位。利用这一特 性可以去除转基因植物中的选择标记基因和其它多余序列( 图1 a ) 。g 0 1 d s b r o u g h 等呻1 把选择标记印f i i 基因插入到玉米转座予成分d s 的反向重复序列之间，把 报告基因f 雌d 构建在d s 反向重复序列之外，然后以此载体转化番茄。结果发现 在转座酶基因a c 作用下，d s 成分连带印f i i 基因转移到植物基因组中新的遗传 山东大学硕士论文 座位。在转基因后代中舒 鲥基因与印f 基因发生了分离，从而获得了只带到鲥 基因而无抗性标记印f 基因的植株。e b i n u 腿等和c o t s a f t i s 等吲利用a c d s 转座子系统分别获得了无选择标记烟草和水稻但是，大多数被修饰过的转 座子因子切除后又重新插入基因组中的其它位置，只有那些发生转座失误的细胞 才能形成表型正常的转基因植株，转化频率很低时，需要大量的筛选工作。 1 3 3 同源重组作用转化系统 这一方法是将标记基因置于重复序列之间，通过重复序列的同源重组作用将 标记基因切除。这些重复序列可以是转基因盒的任何部分，如启动子、终止信号 等，在植物中同源重组发生的频率很低。如在玉米中紧密连锁的正向重复序列之 间的重组频率为0 5 嘲，在叶绿体中同源重组的效率较高。这一方法最近已 被用于从叶绿体基因组中切除标记基因嘲1 。唯一的利用同源重组切除核基因组中 的标记基因的报道是在转基因植物的组织培养时期切除标记基因嘟，这一过程需 要两轮连续的筛选，而且总的效率小于1 。 1 3 4 位点特异性重组转化系统 位点特异性重组始于对 噬菌体溶源化过程的研究。噬菌体通过自身位点 a r t p 和大肠杆菌位点a t t b 的交换整合到宿主染色体上实现溶源化；整合上去的 原噬菌体又可以通过其两侧的a r t l 、a r t r 位点切离下来，形成完整的 噬菌体。 随后，人们对九噬菌体及其它一些位点特异性重组系统的重组酶、重组位点、重 组辅助因子、重组机理等进行了深入的研究。 表14 类位点特异性重组系统的特点 位点特异性重组( 图1 b ) 是指在重组酶的介导下，特异重组位点问发生重 组，导致重组位点间相互交换的一种精确重组形式。位点特异性重组转化系统包 括以下四类：f l p f r t s 、c r e l o x p r r s 及g i n g i x 系统等删能够在植 物中发生重组反应的目前主要是前3 类，其中对c r e l o x p 系统的研究最深入， 山东大学硕士论文 应用也最为广泛。上述4 类位点特异性重组系统的特点见表1 。各系统的作用原 理一样，都是由特异重组酶及其靶序列组成，利用单一的多肽酶催化两个短的、 特异的d n a 序列发生重组，从而剔除位于两靶序列之间的标记基因 f l p f r t s 系统 f l p f r t s 系统是创建最早的位点特异性系统，该系统来自酿酒酵母2i l 环状 质粒，f l p 是2i l 环状质粒编码的特异性重组酶。有功能的f l p 基因识别一段3 4 b p 的d n a 序列，其结构与l o x p 相似，所不同的是野生型的f l p 基因在3 4b p 的d n a 序列侧翼还有一段1 3b p 的反向重复序列，该序列可以增强f l p 介导的重组反应， 在体外它可以影响重组过程中的切口形成和链交换。1 9 8 9 年，c r e g g 和鼢d d e n 克隆了位于酵母r f l 重组酶作用位点( f r t s ) 之间的船基因，将4 神r t 结 构引入酵母中，经筛选得到了a r g + 转化株，然后二次转化导入f l p 重组酶，又获 得了a r g 。的转化子，从而证明了重组事件的发生嘲很快，该重组系统被证明在 多种动植物中都是有效的“”。 r r s 系统 r r s 系统是从接合酵母( 纫d 船c c 加r 锄即船r 口叫环形质粒p s r l 分离 而来，包括重组酶r 和2 个重组酶识别位点r s 。r s 是一段3 lb p 的d n a 序列， 由2 个1 2b p 的反向重复序列和1 个7b p 的不对称间隔序列组成。在重组酶r 的作用下，特异位点r s 发生同源重组，切除2 个r s 位点间的标记基因。1 9 9 5 年，0 1 1 0 u c h i 等用含r 重组酶基因的转化植株与含标记基因( 位于两r s 位点间) 的植株进行有性杂交，获得了无标记基因而只含报告基因的拟南芥转基因植株 i 咖 o c r e 1 0 x 系统 c r e l o x 系统是所有重组酶系统中用得最广，最完善的转化系统。c r e 基因 可通过转化或有性杂交的方式导入植物体时。朋1 ，二者都可高频率的去除位于 1 0 x p 位点间的选择标记基因。h o h n 等认为可直接将c r e 重组酶导入植物细胞就 可以使其作用于靶位点，从而达到剔除标记基因的目的嘲o d e l l 等删将一个多 聚腺苷酸信号序列置于2 个同向位点之问，再将上述结构置于印f l i 编码区与启 动子之间，l o x p 位点间存在的多聚腺苷酸信号序列有效地封闭了印f i i 基因的表 达，再通过二次转化或有性杂交的方式将c r e 基因导入，c r e 重组酶有效地将多 1 4 山东大学硕士论文 聚腺苷酸信号序列切除，印t u 基因得到表达，重组效率高达9 0 以上。( 关于 位点特异性重组转化系统及其代表c r e 1 0 x 系统将在下面做进一步的综述。) 除上述方法外，z u o 等还构建了化学诱导的位点特异d n a 切除系统，将标记 基因的切除设置在紧密的控制之下，同时也显示出极高的切除效率嘲另外，在 以叶绿体为受体的转化体系中，研究人员也已经能够获得无标记基因的转化质体 佃h 妇 综上所述，无标记和可去除标记的转基因技术为解决世界日趋严峻的粮食问 题展现了一个美好的前景，随着转基因产品的推广和人们对转基因产品的接受， 这种安全的转基因技术将在世界粮食生产中发挥着决定性的作用。 2 位点特异性重组系统及其应用 随着植物转基因技术的进步，人们对于转基因作物的期望更加苛刻，例如实 现目的基因的定点整合、定时定量表达，而且表达产物本身无毒、无致过敏作用， 也不使受体植物产生有毒有害物质。转基因农作物的精确性和可预见性变得越来 越重要。目前提高植物基因转化质量的方法就是利用农杆菌介导的转化方法( 不 同于其它物理化学方法转移d n a ，例如基因枪、p e g 法等) ，因为使用农杆菌有许 多优点，例如较低转基因的拷贝数，基因更易整合进转录活性区，较少的基因沉 默等，许多以前认为不能被农杆菌转化的物种现在可以实现农杆菌的转化。尽管 使用农杆菌有诸多优点，整合位点仍然是随机的，这可导致转化后基因表达的多 变性 为了增加转基因整合精确性和基因表达的稳定性，人们将同源重组和位点特 异重组相结合的方法应用于哺乳动物和昆虫，特别是小鼠胚胎干细胞以及果蝇， 这已成为染色体和基因工程的有力工具。在大多数情况下，外源d n a 片段会通过 同源重组整合进特定的染色体位点，随后位点特异重组系统对转基因进行修饰。 位点特异性重组技术通过对蹦a 的特定序列进行准确切割和重新连接，从而在基 因或染色体水平上对生物进行遗传改造( 例如基因打靶技术g e t a n 驴n g ，即g e n e k n o c ki na n dk n o c ko u t ) 。该技术将对基因组d n a 序列的操作提升到了一个前 所未有的新高度。 位点特异性重组系统可在重组酶的参与下，介导特异性位点间的d n a 发生切 除、整合或易位，该系统可克服传统基因工程技术的一些局限性，对基因进行定 山乐大学硕士论文 时、定位的改造，并可进行大片段的染色体改造工程。该系统有很多种，目前已得 到应用的有c r e l o x 系统、f l p f r t 系统、r r s 系统等，c r e l o x p 和f l p f r t 系统就是两个应用较广的位点特异重组系统。尽管植物中还未将同源重组和位点 特异重组相结合，但f l p 和c r e 已被用于将新的外源基因整合进基因组已有的转 基因位点上，这说明精确的转基因替换是可行的。随着技术的不断进步，它在农 作物生物工程中的应用必将越来越重要。 2 1 位点特异性重组系统重组机理 位点特异重组系统常在原核生物和低等真核生物中发现。该系统的天然功能 包括噬菌体整合进宿主基因组( 噬菌体 、链霉菌噬菌体巾c 3 1 ，l a c t o c o c a l 噬 菌体t p 9 0 卜1 ) 、维持拷贝数( 噬菌体p 1 的c r e l o x p 系统) 以及变更宿主范围 ( 噬菌体m u 的g i n g i x 系统) 另外，转座予也会利用位点特异重组产生转座的 终产物( i i 类转座因子，如t n 3 ) 自主复制的质粒d n a 在复制过程中，s s t d n a 通过重组作用会使本应收敛的复制叉解偶联并释放环状s s t d n a ，从而加速复制 过程( 酵母的f l p f r t 系统) ( 图2 ) m 1 ，细菌还会用位点特异重组来改变细胞 表面组分( 例如鼠伤寒沙门氏菌的h i n 系统) 。 图2 重组、复制 相互促进作用 机制示意图 山东大学硕士论文 这里所举的例子仅代表了上百种位点特异重组系统的一部分。位点特异重组 系统可被分为整合酶、溶解酶和解偶联酶。重组反应的复杂性和特异性在不同类 型之间变化很大然而，一般认为，溶解酶和解偶联酶比整合酶的选择性更强 c r e l o x 系统、f l p f r t 系统、r r s 系统是已经得到应用的三类位点特异性 重组系统。这三类位点特异性重组系统的重组酶c r e 、f l p 和r 均属于 整合酶 家族，均为单链多肽，且具有极高的结构相似性，重组位点结构也具有相似性。 三类系统的重组机理也相似。整个重组过程没有d n a 的合成和丢失，重组可分以 下几步进行( 图3 ) ： ( 1 ) 重组酶识别并结合重组位点的反向重复序列区，每一反向重复序列结合 一个重组酶； ( 2 ) 在重组酶的作用下，两个重组位点间发生同向联会； ( 3 ) 联会后两个重组位点的d n a 的一条链在重组酶的作用下断裂，通过 3 一p o 。与重组酶的t y r 的游离一0 i 相连。这是一个转酯过程，保存了d n a 链断裂 时的能量，因而重组过程不需要附加能量； ( 4 ) 重组酶相连的断裂链与另一位点处断裂链的5 一0 端相连，此时两d n a 链中的一条分别与对方交叉相连； ( 5 ) 交叉相连的d n a 链经旋转形成h o l i d a y 中间体； ( 6 ) l i d a y 中间体分支迁移数个碱基后，另一条链再断裂并与对方的断裂 链重接，这时就完成了重组过程，实现了交换。 图3c r 卅o x p 定位重组系统 的作用机制 ( g o p a u l ，1 9 9 8 ) 山东大学硕士论文 在这三类重组系统中的必须因子就是重组酶和重组位点( 具有长3 1 或3 4 b p 的基本结构) 即可行使功能，三类单链多肽的重组酶在重组过程无需高能辅助物， 这些优点使植物中研究位点特异性重组有许多优势。 2 2c r e l o i p 重组系统的结构与功能 c r e 重组酶是由噬菌体p l 基因组中1 0 2 9 b p 的一段序列编码的蛋白质，由3 4 3 个氨基酸组成，分子量为3 8 5 k d m l 。它不仅具有催化活性，而且同限制酶相似，识 别特异的d n a 序列并进行特定的剪切和拼接。在水溶液中该酶以单体形式存在。 c r e 重组酶的最适反应温度为3 7 ，甚至在4 6 仍有活性，因此c r e 重组酶适合 在生长于这个温度范围内的宿主中使用，在哺乳动物的遗传操作中c r e l o x p 这 一定位重组系统得到广泛的应用”“。 1 2 3 4 5 6 7 8 k ? t g t k t gc 1 黼坻肇 图4c r e 重组酶识别的l o x p 位点 f i g 4t h e1 0 x ps i t er e c o g n i z e db yc r er e c o m b i n a s e c i k3 铀ph ps 虹k 唧o s c do f t 帅1 3 却s y m m c 时c k m 曲扭蛐r m d i 唱越& b p 稿”n m c 啊cf e g i o n ) c r e 重组酶所识别的特定