（遗传学专业论文）龙芽楤木体细胞胚发生过程中特异性蛋白表达差异的研究.pdf

中文摘要 ， ，植物体细胞在一定条件下可分化为胚性细胞，并通过体细胞胚的发 育形成一个完整的植株，这一过程是基因差别表达的结果。它的本质一直 是植物发育生物学研究的重点问题之一。j 本论文采用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对龙芽楹木体细胞胚发 生过程中愈伤组织形态建成、胚性愈伤转化、胚状体发育和植株再生四个 阶段的可溶性蛋白的动态变化进行分析。根据可溶性蛋白动态变化的特 点，我们建立了龙芽搀木体细胞胚发生过程的蛋白质表达模型，并找到了 一些与体细胞胚发生相关的特异性蛋白。由于体细胞胚胎发生还受到一系 列内外环境因素的调节，所以研究外界因子对特异性蛋白表达的影响也是 研究体细胞胚发生过程分子机制的重要组成部分。我们探讨了植物激素、 活性炭和蔗糖三种外界因子对体细胞胚的调控机理，试图进一步揭示体细 胞胚发生的分子基础。 龙芽橡木体细胞胚发生过程中可溶性蛋白表达模型的建立，从整体 ， 上体现了可溶性蛋白表达的时空特异性。陔模型显示可溶性蛋白的表达活 t 力出现了两个峰值。它们分别对应于体细胞胚发生过程中胚性愈伤形成的 准备期( c 6 期) 和胚状体发育期( e 1 e 5 ) 两个关键时期。并且在胚性愈 伤的转化过程中，能够获得胚性发生能力的愈伤组织其可溶性蛋白含量的 最低阈值为1 1 5 0 5u g m gf w ，总蛋白含量低于或远远高于这一阈值的 愈伤组织其胚性能力丧失或极低。此外，在植株再生阶段，可溶性蛋白的 i 表达呈现明显的器官特异性。_ l 在龙芽摁木体细胞胚发生过程中，我们发现了若干胚胎发生相关蛋 白。正是这些胚胎发生相关蛋白的选择性表达促成了体细胞胚的发生和发 育。首先，在胚性愈伤和胚状体发育阶段特异性表达的蛋白组分有4 9 k d 、 4 0 k d 、3 1 k d 、2 2 k d 和2 0 k d 。其中4 9 k d 在胚性愈伤组织、球形肛和成 熟的子叶胚三个阶段共同表达，3 1k d 在胚性愈伤组织、球形胚和心形胚 三个阶段共同表达。它们可以分别作为胚性愈伤组织、胚状体发育阶段或 其中某一特定时期的分子标记。另外，5 3 k d 蛋白组分的表达量在胚状体 发育阶段明显增加，该种蛋白组分可能也对胚状体的发育起到了促进作 用。其次，7 0 k d 、6 3 k d 、5 5 k d 、4 5 k d 和3 6 k d 的表达都起始于愈伤 组织形态建成阶段，并在整个龙芽搀木离体培养再生体系中动态表达。其 中3 6k d 蛋白组分在胚性愈伤组织和胚状体中表达而在非胚性愈伤组织 和再生植株中不表达，它是直接与愈伤组织胚性发生能力相关的特异性蛋 白。5 5k d 蛋白组分受生长素2 ，4 d 的负调控，并对体细胞胚的发生具有 显著的促进作用。这些早期表达的蛋白组分可能是植物中共同存在的体细 胞胚发生相关蛋白，对胚状体发生的决定起着重要作用。此外，我们还发 现，与愈伤组织增殖有关的4 3k d 愈伤组织特异性蛋白；在胚性愈伤组 织和胚状体发生阶段特异性缺失的3 5k d 蛋白组分，它可能与胚状体发 生能力的丧失有关。 厂 ( 由上述实验结果我们发现，在龙芽榴木体细胞胚发生过程中，任何 发育阶段都不是单个基因作用的结果，而是一组基因在时间和空间上有序 表达的结果。 本实验结果还表明，植物激素、活性炭、蔗糖三种外界因子都是通 过直接或间接调节特异性蛋白组分的开启与关闭即通过调控相应基因的 代谢活性来实现对龙芽楹木体细胞胚发生的影响。 本论文的研究结果将有助于发现与体细胞胚发生相关的特定基因， 揭示体细胞胚发生的分子机理及外界因子对体细胞胚发生的调控机制，为 、 研究植物的合子胚发育提供理论基础。一 关键词：龙芽橡木、体细胞胚发生、特异性蛋白、s d s - - p a g e 、 ： f ) 外界因子、植物激素、活性炭、蔗糖 fj ) 1 1 a b s t r a c t u n d e rt h es p e c i f i cc o n d k i o n so ft i s s u ec u l t u r e ，s o m a t i cc e l l so f p l a n t t r a n s f o r mi n t o e m b r y o n i c c e l l sa n d r e g e n e r a t e e n t i r e p l a n t s v i as o m a t i c e m b r y o g e n e s i s a st h e r e s u l to fd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no f e m b r y o g e n e s i s - r e l a t e dg e n e s ，t h ee s s e n c eo f t h i sp r o c e s sh a sb e e no n eo f r e m a r k a b l ei s s u e si nt h e p l a n td e v e l o p m e n t a lb i o l o g y i nt h i sp a p e r , as t a b l ea n do p t i m a lr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fa r a l i ae l a t e ( m i q ) s e e m v i as o m a t i c e m b r y o g e n e s i s w a sa c h i e v e d a r a l i a e l a t e ( m i q ) s e e mi sak i n do fu n c u l t i v a t e dv e g e t a b l ef r o mt h em o u n t a i nc h a n g b a i t h e p r o c e s s o fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i si n c l u d e sm o r p h o g e n e s i ss t a g eo fc a l l i ， c o n v e r s i o ns t a g eo fe m b r y o n i cc a l l i ，e m b r y o g e n e t i cs t a g ea n dr e g e n e r a t i o n s t a g eo f p l a n ti n a r a l i ae l a t e ( m i q ) s e e m t h ee m b r y o g e n e t i cs t a g ec o n s i s t so f g l o b u l a rs t a g e ，h e a r ts t a g e ，t o r p e d os t a g ea n dc y t o l e d o ns t a g e t h ed y n a m i c c h a n g e so fs o l u b l ep r o t e i n so c c u r r i n gi na f o r e s a i ds t a g e sw e r ea n a l y z e db y s d s - p a g e w ee s t a b l i s h e dae x p r e s s i o nm o d e lo f s p e c i f i cp r o t e i n so c c u r r i n g i ns o m a t i ce m b r y o g e n e s i so f a r a l i ae l a t e ( m i q ) s e e mo nt h eg r o u n d so f t h e s d s p a g er e s u l t f u r t h e r m o r e , s o m ee m b r y o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n sw e r e f o u n d w ea l s os t u d i e dt h er e g u l a t i o no f t h r e ef a c t o r si n c l u d i n gp l a n th o r m o n e ， a c t i v a t e dc h a r c o a la n ds u c r o s ed u r i n gs o m m i ce m b r y o g e n e s i so fa r a l i ae l a t e ( m i q ) s e e mi n o r d e rt o e x p l a i nt h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fs o m a t i c e m b r y o g e n e s i s i nt h e l i g h t o ft h e e x p r e s s i o nm o d e l ，m a n y s o l u b l e p r o t e i n s w e r e e x p r e s s e dd y n a m i c a l l yi na ns p e c i a l l yt e m p o r a l s p a t i a ls e q u e n c e t h e r ew e r e t w op e a k so fe m b r y o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n s e x p r e s s i o ni nt h i sm o d e l o n e c o r r e s p o n d e dt ot h ep e r i o do fc 6i nw h i c h t h e r ew e r es o m ep r e p a r a t i o n sf o r f o r m i n ge m b r y o n i cc a l l i ，t h eo t h e rc o r r e s p o n d e dt ot h ee m b r y o g e n e t i cs t a g e i nt h ec o n v e r s i o no fe m b r y o m ec a l l i ，t h el o w e s tt h r e s h o l dv a l u eo ft o t a l p r o t e i nc o n t e n t i ne m b r y o m cc a l l iw a s11 5 + 0 5u m gf w s u p p o s e d t h a tt h e t o t a l p r o t e i nc o n t e n to fc a l l i i s b e y o n d o ru n d e ri t ，t h ec a l l is h o u l db e n o n e m b r y o n i cc a l l i o rt h ec a l l iw i t ha l lr a t h e rl o wf r e q u e n c eo fs o m a t i c e m b r y o g e n e s i s ，i na d d i t i o n , s o m es o l u b l ep r o t e i n so c c u r r e dr e s p e c t i v e l yi n c o r r e s p o n d i n go r g a n so f r e g e n e r a t e dp l a n t s f u r t h e r m o r e ，w ef o u n d s o m e e m b r y o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n sd u r i n g s o m a t i ce m b r y o g e n e s i so f a r a l i ae 舰( m i q ) s e e m , w h i c hp r o m o t e d t h eo c c u r a n d d e v e l o p m e n t o fe m b r y o i d s f l r s f l y , t h e r e a r ef i v e s p e c i a lp r o t e i n s 4 9 k d ，4 0 k d ，3 1 k d ，2 2 k d ，2 0 k de x p r e s s i n g i ne m b r y o m cc a l l ia n d e m b i y o g e n e t i cs t a g e a m o n gt h e m , t h ep r o t e i n4 9 k d e x p r e s s e d i nt h ee m b r y o m ec a l l ， g o l u b l ea n d m a t u r ee ”o l e d o ns t a g e s ，w h i l et h ep r o t e i n3 1 k d i nt h ee m b r y o m c c a l l i ，g o l u b l ea n d h e a r ts t a g e s t h e ya r et h em o l e c u l a rm a r k e r so fe m b r y o m c c a l l ia n de m b r y o g e n e t i es t a g ec o r r e s p o n d i n g l y b e s i d e s ，t h ec o n t e n to f 5 3 k d i n c r e a s e di nt h ee m b r y o g e n e t i cs t a g e , w h i c hi m p l i e dt h a tt h ep r o t e i n5 3 k d 1 i g h tc o n t r i b u t et ot h ed e v e l o l ： m e n to fe m b r y o i d s s e c o n d l y , t h ep r o t e i n so f 7 0 k d ，6 3 k d ，5 5 k d ，4 5 k d ，3 6 k de x p r e s s e di nm o r p h o g e n e s i ss t a g e o f c a l l ia t f i r s t ，a n dc o n t i n u e dt h e i re x p r e s s i o n si n t h ew h o l es o m a t i ce m b r y o g e n e s i s a m o n g t h e m t h ep r o t e i n3 6 k de x p r e s s e di nt h ep e r i o do fc 6 ，e m b r y o m ec a l l 0 e m b r y o g e n e t i cs t a g ew h i l en o ti nn o n e m b r y o n i ce a l l ia n d r e g e n e r a t e dp l a n t s - i t ，sac r u c i a l p r o t e i n i nt h ed e t e r m i n a t i o no fe m b r y o m e e a l l ia n dt h e d e v e l o p m e n to fe m b r y o i d s t h eg e n e r a t i o no fp r o t e i n 5 5 k dw a s r e g u l a t e db y 2 , 4 d a n dt h ep r o t e i ni n c r e a s e dt h ef r e q u e n c eo fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s o b v i o u s l y t h e s ep r o t e i n so c c u r r i n g i np r i m e v a lp e r i o d sm i g h tb es o m em u t u a l e m b r y o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n si np l a n t t h e yp l a y e da ni m p o r t a n t r o l ei nt h e d e t e r m i n a t i o no fe m b r y o m cc a l l i i na d d i t i o n , as p e c i f i cc a l l i r e l a t e dp r o t e i n i ” 4 3 k dw e r ef o u n da n di t se x p r e s s i o no n l yo c c u r r e di nt h ep r o l i f e r a t i o no f c a l l i w ea l s of o u n dak i n do fn o n e m b r y o n i cp r o t e i n3 5 k dt h a t e x p r e s s e di n n o n e m b r y o n i cc a l l ia n dr e g e n e r a t e dp l a n t sa n dd i s a p p e a r e di ne m b r y o n i c c a l l i a n d e m b r y o g e n e t i cs t a g e i naw o r d , e v e r ys t a g ei ns o m a t i ce m b r y o g e n e s i so f a r a l i ae l a t e ( m i q ) s e e mw e r ec o m p l e t e dc o o p e r a t i v e l yb yag r o u po fg e n e s ，n o tb yo n l yo n e g e n e m o r e o v e r ，o u re x p e r i m e n t sm a n i f e s t e d t h a tt h et h r e ef a c t o r s ( p l a n t h o r m o n e ，a c t i v a t e d c h a r c o a la n d s u c r o s e ) r e g u l a t e d t h e e x p r e s s i o n o f e m b r y o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n s s ot h a tt oa f f e c ts o m a t i ce m b r y o g e n e s i so f a r a l i ae l a t e ( m i q ) s e e m t h i sw o r kw i l lc o n t r i b u t et oe x p l a i nt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f s o m a t i c e m b r y o g e n e s i s ，f m ds o m ee m b r y o g e n e s i s - r e l a t e dg e n e s ，a n de s t a b l i s h e dt h e b a s i so f t h e z y g o t i ce m b r y o g e n e s i s r e s e a r c h k e yw o r d s ：a r a l i ae l a t e ( m i q ) s e e m ；s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ；s p e c i f i c p r o t e i n s ；s d s p a g e ；t h e e f f e c to ff a c t o r s ；p l a n th o r m o n e ； a c t i v a t e dc h a r c o a l ；s u c r o s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师 范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：纽日期：塑： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：赶 日期：垫! ： 指导教师签名：篮基 日期：羔翌5 ：g 引言 发育生物学( d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y ) 是应用现代生物学技术研究生物 发育本质的科学。它主要研究多细胞生物体由生殖细胞开始，经过受精、 胚胎发育、生长、衰老、直到死亡的过程，即生物个体发育中生命过程发 展的机制【l 】。早在古希腊时代，人们已经开始了对生物发育的研究，在经 历了十六世纪的胚胎学复兴后，在二十世纪染色质及基因的发现进一步推 动了发育生物学的发展。今天，随着分子生物学的迅速发展，发育生物学 进入了分子生物学时代，并取得了长足的进展 2 1 。人们已经认识到，任何 生命现象都是遗传信息按一定的时间和空间次序表达的结果，即按照发育 的遗传程序展开的结果。发育具有严格的次序性，它是众多基因表达在时 间和空间上的联系和配合。因此，现代发育生物学的主要任务是研究生物 体发育的遗传程序及调控机制。 早期的发育生物学主要是以人和动物为研究对象。随着发育生物学 的发展，对植物发育的研究因其在农业和园艺上的重要意义而逐渐得到关 注。虽然植物发育生物学的研究起步较晚，但植物发育具有许多特殊性并 在一定程度上为植物发育的研究提供了新的突破口。例如植物细胞具有全 能性，即在离体条件下，体细胞可以通过器官发生途径或体细胞胚胎发生 途径形成再生植株 3 】。因此，人们就可以通过植物组织培养技术获得植物 体细胞再生植株，从而为研究植物胚胎发育的组织结构和分子机理提供了 理想的研究模型。 早在2 0 世纪初，德国著名植物学家h a b e r l a n d t 根据细胞学说的理论 就曾预言，植物细胞具有全能性。也就是说每个体细胞都象胚胎细胞一样， 在适宜的条件下具有被诱导生长、分化形成完整植株的潜力。由于当时科 学发展和技术条件的限制，直到3 0 年代，w h i t e 用番茄根组织离体培养 获得成功，才建立了第一个无性繁殖系，也称“克隆”。最初，细胞离体 培养一直被认为是通过分别诱导芽和根等器官发生而形成再生植株的。但 是到了5 0 年代末，s t e w a r d 等和r e i n e r t 几乎同时发现了某些植物的体细 胞可以在形态上转变为与合子胚相似的结构，其发育过程也与合子胚类 似，并可由此形成完整的再生植株，且可开花结果。由于该结构是从体细 胞分化而来，因而称之为体细胞胚( s o m a t i ce m b r y o ) 。目前，人们已经发 现一些植物的体细胞在一定条件下可分化为胚性细胞，并通过体细胞胚发 育形成完整植株【州。 体细胞胚的发现在植物胚胎发育研究中具有十分重要的意义。体细 胞胚与合子胚相比，不仅其形态结构和发育过程极其相似，而且两者存在 许多共同的调控因子。因而通过对体细胞胚发育过程中生物大分子动态变 化机制的研究，可以在一定程度上反映自然状态下植物合子胚的基因调控 过程。另外，体细胞胚较易从母体分离，减少了细胞之间的相互制约，而 且还可在人工控制的条件下，按预期的目标设置多单因子及其多水平实 验处理，探索其对植物体细胞胚胎发育的影响。这些特性都为植物发育机 理的研究提供了便利。 由于植物体细胞胚发生的研究对植物细胞的生长和分化机制、胚胎 发生和基因表达调控等重大理论问题的研究具有重要意义，因此，这一领 域的研究受到国内外科学家的广泛关注。目前，比较成熟的体细胞胚胎发 生体系有胡萝h 、芹菜和苜蓿掣剐。 植物在离体培养条件下，经脱分化、再分化阶段发育为完整植株的 过程是受细胞内外多种因子调控的，其实质是调节体细胞内特定基因表达 的结果。有很多基因表达的最终产物都是蛋白质，所以在植物组织培养过 程中，体细胞的分化与发育必然伴随着特异性蛋白的出现与消失。因此， 对体细胞胚胎发生过程中特异性蛋白质的研究具有十分重要的意义。 有关体细胞胚发生中可溶性蛋白质含量和组分的变化已有大量的研 究报道。在可溶性蛋白质含量上，各种材料( 如胡萝卜、小麦、马唐等) 2 嚣注愈穆缓缀鹣矮壹袋含量秘套或逮搴遴意予 菸爆愈绕缀缓，这褒赘蓠 者的代谢活性高于后者。对与前刁柏的体细胞胚发生相关蛋白质禽嫩的分 辑表裙，球形蕊潮可溶往蚤台震含薰畿嵩。 9 霹 在髂纲胞脎发生申不仅蠢鬃自疑含量的变让，掰且有特异性胚牲蛋 融的表达。1 9 7 9 年，z e e 等醣申国芹浆为材料研究了体鲴臆胚形成肇期酶 瑶溶洼蘩鑫组分熬交绽。越鑫，s u n g ( 1 9 8 1 ) 、c h e n ( 1 9 8 7 ) 、s t i m 1 9 8 7 ) 、 f r a n z ( 1 9 8 9 ) 等姘究鬻分别在胡萝卜、水稻、豌氨和玉米等植物的体细 嚣蕺驻发生过程中发现寄4 5 5 5 k d 静释精褥勇经蚤囱豹澎成# b 挣】。采长露 簿 的总蛋白含量2 7u g m gf w 相差不大，都低 于后期( c 5 、c 6 ) 的总蛋白含量5 4 u g m g f w ，并且在此时愈伤组织形态 建成阶段的总蛋白含量达到最高点，随后在胚性愈伤转化时期( c ，) 总蛋 白的含量( 4 2u g m gf w ) 稍有下降，并且剥离胚状体后的老愈伤( c 8 ) 的总蛋白含量( 6 7 u g m gf w ) 明显高于未产生过胚状体的愈伤组织的总 蛋白含量( 2 7 5 4 u g m gf w ) 。 在胚状体发生阶段( e l e 5 ) 总蛋白含量急剧增长，球形胚总蛋白含 量最高，达8 7 u g m gf w ，约相当于愈伤组织阶段平均总蛋白含量( 3 4 u g m gf w ) 的2 6 倍。随着胚状体的发育，总蛋白含量逐渐减少，但即使 在胚状体发育后期的子叶胚阶段其总蛋白含量仍达到3 3u g m gf w ，相当 于愈伤组织阶段平均总蛋白含量的1 0 倍。 另外，在再生植株的不同器官中总蛋白含量也有变化。叶的总蛋白 含量( 8 7u g m gf w ) 和幼苗的总蛋白含量( 8 4u g m gf w ) 较高，其它 依次为叶柄( 6 5u g m gf w ) 、茎( 4 2 u g m gf w ) 和根( 2 1 u g m gf w ) 。 2 、特异性蛋白组分含量的变化 在电泳上样量基本相同的情况下，我们发现某些蛋白组分的含量也 发生了变化。 在愈伤组织发育阶段( 图2 ) ，4 5 k d 蛋白组分在c 2 期出现，随着愈 伤组织的生长其含量逐渐增加，在c 6 期达到最高。3 2 k d 蛋白组分，在整 个愈伤组织形态建成过程中均有表达，但在c 6 期含量陡然增加。这两种 蛋白组分在c 6 期表达最多，与之呼应的是c 6 期的总蛋白含量对照愈伤组 织生长的其它时期也有明显增加，这都说明c 6 期的基因表达是十分活跃 的。由此暗示c 6 期可能对愈伤组织的胚性形成非常关键。 在胚状体阶段( 图3 ) ，5 3 k d 蛋白组分含量较其它生长阶段( 图2 、 图4 ) 有明显增加，推测这可能与胚状体的形成有关。 1 4 在再生植株中( 图4 ) ，可溶性蛋白组分的含量也有明显变化。5 5 k d 蛋白组分在叶和叶柄中的表达量远远超过了它在愈伤组织和胚状体中的 表达量。2 7 k d 蛋白组分在根和茎中的表达量也有显著增加。这两种蛋白 组分含量的增加可能与再生植株中器官的分化与建成有关。 ( - - ) 体细胞胚发生过程中可溶性蛋白组分的变化 l 、愈伤组织发育阶段可溶性蛋白组分的变化 mc 8 c 7qc 5 c 4c 3c 2c 1 c o 图2 愈伤组织发育阶段可溶性蛋白电泳照片 ( m 一标准蛋白、c r 一外植体即叶柄、c i 竹愈伤组织形态建成阶段、c l c 2 一前期、c 3 c 广中期、c 5 c 6 一后期、c 厂i 胚性愈伤组织转化阶段、c b - 唰离了胚状 体的老愈伤) 龙芽搀木愈伤组织发育时期可分为两个阶段。第一阶段为愈伤组织 形态建成阶段，又包括诱导期( 即前期) 、生长期( 即中期) 和扩繁期( 即 后期) ，第二阶段为愈伤组织胚性形成期。在愈伤组织发育时期，共有1 0 种特异性蛋白组分显示出特定的时间表达顺序。其可溶性蛋白组分表达的 变化特征如图2 所示。 15 ( 1 ) 愈伤组织诱导期( c l c 2 期) 与外植体( c o 期) 相比，在愈伤组织诱导期多种蛋白组分的表达发 生了明显变化。其中外植体中原有的一些蛋白组分的表达在此期间被暂时 关闭( 如5 5 k d 等) ，而一些新的特异性蛋白组分( 即5 8k d 、4 5k d 、4 3 k d 、2 7 k d ) 分别在c 1 期和c 2 期先后依次进行表达。伴随着这些蛋白组 分的关闭与开启，培养基中的外植体逐渐膨大，愈伤组织开始形成。 ( 2 ) 愈伤组织生长及扩繁期( c 3 c 6 期) 在此期可以看到有4 种特异蛋白组分开启表达，另有2 种蛋白组分 的表达被选择性的关闭。 在c 3 期可见6 3k d 蛋白质组分开始表达，并在以后的愈伤组织扩繁 和胚状体发生过程中均有表达。在c 4 期，7 0k d 蛋白组分起始表达，该 蛋白组分在c s 期作短暂持续表达后，则在此后的愈伤组织中消失。在c 5 期原本在外植体叶柄中表达的5 5k d 蛋白组分似乎经过一段时间的 关闭后，在此期间又重新开始持续表达。在c 6 期蛋白组分的表达有明显 变化。其中7 0k d 蛋白组分的表达被临时关闭，而自从c 2 期就开始表达 的4 3 k d 蛋白组分此时被永久关闭了。与其它发育阶段中的蛋白组分相 比，似乎唯有4 3 k d 蛋白组分是仅存在于愈伤组织中的特有组分，因此可 以将其视为愈伤组织的重要分子标记。在c 6 期的愈伤组织中还有一种新 的蛋白组分( 即3 6k d 蛋白组分) 开始表达，3 6 k d 蛋白组分呈现动态变 化，即在愈伤组织扩繁期( c 6 期) 出现，在胚性愈伤转化初期( c 7 期) 消失，在胚状体和有胚状体发生过的愈伤组织( c 8 期) 中又有表达。 在这一阶段，愈伤组织发生并增殖，同时进行着活跃的蛋白代谢。 ( 3 ) 愈伤组织的胚性形成初期( c 7 期) 及胚状体发育后期( c 8 期) 在愈伤组织胚性形成初期( c 7 期) 没有新的蛋白组分产生。但3 6k d 蛋白组分在此阶段短暂关闭，随后在整个胚状体发育阶段( e r e s ) 和胚状 体发育后期的愈伤组织( c 8 期) 中持续表达。 1 6 我们还发现胚状体发育后期的愈伤组织( c 8 期) 中存在3 3k d 蛋白 组分，该蛋白组分在胚状体发生之前的愈伤组织中是不存在的。 另外，根据电泳结果我们还发现3 5k d 蛋白组分在整个愈伤组织发 育时期组成型表达。 2 、胚状体发育过程中可溶性蛋白组分的变化 e se e 3助e lm 图3 胚状体发生过程中可溶性蛋白电泳照片 ( m 一标准蛋白、e 1 球形胚阶段、e 广一凸形胚阶段、e 3 _ 一鱼雷胚阶段、e 广子叶胚 阶段、e 5 子叶胚2 阶段即长大的子叶胚) 在胚状体发育的各个阶段可溶性蛋白的表达基本相同。但与愈伤组 织胚性形成初期( c ，期) 相比，胚状体发生阶段可溶性蛋白表达的组分 明显增加，在这一阶段共有1 1 种蛋白组分的表达发生变化。 4 0 k d 、2 2 k d 、2 0 k d 和4 9k d 、3 1k d 蛋白组分仅在胚状体发育阶 段表达，是胚状体发生的特异性蛋白。前三者在胚状体发育的各个阶段均 骞表达，但蜃嚣者仪在艇状体发育的特定盼段表达，可作为珏状体发育特 定阶段的分子标记。其中3 1 k d 糙白组分在球形胚和心形胚阶段特异性袋 达，4 9k d 蛋白组分在球形胚和长大的子开艇阶段特异往袭这。 3 3 国、2 9 5 k d 、2 8 。5 k d 三秘蛋囱组分在球形题阶段起始表达，并 在此后的胚状体发育过程中全程液达。同时3 3 k d 还在胚状体发生后期的 老愈伤( c 8 蠲) 中褒达，而上述其它麟胎特辩性蛋国组分在c 8 期的老愈 经组织孛不袭达。冀终，这三移鬃鑫组分分别在秀生萤魏不迥爨囊孛特努 性表边。说明它们可能与愈伤组织再分化和特定器宙的形淼建成有关。 材在c 4 期和c 5 期愈伤组织中短鬻表达的7 0k d 蛋国组分，在球形 艇瓣袋莓次簇凌表这，蒡褒疆软体发旁羧段持续表达，壹剩长大鹣子时瓤 阶段终止。 尤为值得注意的是3 6 k d 和3 5 k d 两种骚白组分表达的变化。3 6 k d 茬c 6 瓣初次袭这，隧君寇c 7 麓关鬻，在球形轻狳袋霉次牙癌著裘整令憝 状体发育阶段和处予该阶段的愈伤组织中持续表达；而在c 6 期以前的愈 伤组织中和群生苗及其各器官中检测不到该鬣白组分的表遮。与之相反， 3 5 k d 蛋自缀劳在憝伤组织发育阶段( e 旷c 8 瓣) 移再生蘩获其羲器宫审 组成型表达，但在熬个胚状体发育阶段却被选择性关闭。 随着上述1 1 种蛋白缎分的出现和消失，脱分化状态的体细胞再分化 为体纲艟胚，并发帮为吴肖完整静子叶耱薤裰结弱秘幼蕾。 3 、再嫩植拨中可溶性蛋巍组分姻变化 由电泳缩果( 图4 ) 可知，在再生植株的不同器官中可溶性灏白的组 分其露很大豹差异。在葫茁和荐生茁酶各器窝孛组箴鳖表遮3 5k d 蛋蠢 组分。薅6 3 k d 、5 9 k d 、5 5 k d 、3 3 k d 、2 9 5 k d 、2 8 ，5 k d 和2 7 k d 七 种蛋白组分分别在再生苗的不同器官中特异性表达。6 3 k d 、5 8k d 、3 3k d 仅在根和茎中表达，5 5k d 仅在叶和叶柄中表达，2 8 5k d 在醉横稀茎中 特巽表达。2 9 5k d