（遗传学专业论文）蓝藻hox1基因和pcya基因的克隆、序列分析及表达载体的构建.pdf

；。一 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 、 ( 塍烈 韶a 筻 二3j 名 门oj 名 1 多多飞以旷弋 7 2 第久。 一 名铂 麓 仫黝矿 虬u 乙 砥、1 f 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：张茜签字日期：沙j 。年月斗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：认为导师签字 签字日期：加7 睥月中日签字日期：z o l 口年月q ，日 f j j 、 原酶 ( f e r r e d o x i no x i d o r e d u c t a s e ，p c y a ) 是藻蓝胆素( p c b ) 合成过程中的关键酶，它 们表达的两个酶催化血红素m e m e ) 转化为藻蓝胆素，控制这两个酶合成的基因分 别是亚铁血红素氧化酶i 基因( h o x l ) 及藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因( p c y a ) 。 藻蓝蛋白裂合异构酶e 和f ( c p c e f ) 负责催化p c b 与脱辅基蛋白的连接。只有 结合了色基，藻蓝蛋白才能具有光学活性。随着藻蓝蛋白越来越广泛的应用于生 产生活中，有关h o x l 基因和p c y a 基因的克隆及序列功能分析成为藻蓝蛋白研究 中的热点课题。 本实验应用降落p c r 方法从聚球藻s y n e c h o c o c c u sc e d r o r u m 中扩增出7 17 b p 的h o x l 基因全序列，并与从g e n b a n k 下载1 3 个蓝藻h o x l 基因序列比较，用 m e g a 4 0 进行序列同源性分析及蛋白结构特性分析。结果表明，s y n e c h o c o c c u s c e d r o r u m 的h o x l 基因与聚球藻s y n e c h o c o c c u sp c c 7 9 4 2 和钝顶节旋藻a r t h r o s p i r a p l a t e n s i s 的h o x l 基因序列同源性分别为9 9 9 和9 9 2 ，氨基酸序列同源性分别 为9 9 6 和9 7 9 。还用邻接法和最大简约法构建了系统树并进行了聚类分析。 运用p c r 技术从钝顶节旋藻藻株a r t h r o s p i r ap l a t e n s i sf a c h b 3 14 中克隆得 到7 4 7 b p 的p c y a 基因全序列，并与从g e n b a n k 下载3 个蓝藻p c y a 基因序列比 较，用m e g a 4 0 进行序列同源性分析及蛋白结构特性分析。结果表明， a r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 1 4 的p c y a 基因与集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 韶 的相似性最高达到9 9 9 ，氨基酸序列同源性为9 9 6 。 运用i n - f u s i o n 1 m 试剂盒构建了p u c i8 - h p 质粒和p s b i3 0 h - p 重组质粒， p c r 法和双酶切鉴定结果显示：表达载体p u 0 8 h p 质粒和p s b l 3 0 h p 质粒 已构建成功。 关键词：聚球藻；钝顶节旋藻；h o x l 基因；p c y a 基因：亚铁血红素氧化酶i ； 藻蓝素铁氧还蛋白还原酶；聚类分析；表达载体构建 蓝藻h o m 基因和p 叼叫基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 s y n t h e s i s o fp h y c o c y a n o b i l i n t h e i r e x p r e s s e de n z y m e sc a t a l y z e h e m ei n t o p h y c o c y a n o b i l i n h o x lg e n ea n dp c y ag e n ec o n t r o lt h es y n t h e s i so fh o la n dp c y a c p e e fc a t a l y z et h el i g a t i o no fp h y c o c y a n o b i l i na n da p o p r o t e i n o n l yac o m b i n a t i o n o fc o l o r - b a s e d ，p h y c o c y a n i nc a nb eo p t i c a l l ya c t i v e o n l yw h e np h y c o c y a n o b i l i na n d c h r o m o p h o r ec o m b i n e dt o g e t h e r , c 凋t nb ep h y c o c y a n i no p t i c a l l ya c t i v e a l o n g 、航廿lt h e m o r ea n dm o r ee x t e n s i v ea p p l i c a t i o no ft h ep h y c o c y a n i n ，t h ec l o n i n go fh o x lg e n e a n d p c y ag e n ea n dt h e i rs e q u e n c i n ga n a l y s i sb e c o m e t oh o tt o p i c s t h ec o m p l e t eh o x lg e n ei n c l u d i n g717 b pw a sc l o n e df r o ms y n e c h o c o c c u s c e d r o r u mb yu s i n gt o u c h d o w np c rt e c h n o l o g y h o m o l o g ya n a l y s i sb a s e do n c y a n o b a c t e r i ah o x lg e n es h o w e dt h a tt h es i m i l a r i t yi s9 9 9 b e t w e e ns y n e c h o c o c c u s c e d r o r u ma n ds y n e c h o c o c c u sp c c 7 9 4 2a n d9 9 2 b e t w e e ns y n e c h o c o c c u sc e d r o r u m a n da r t h r o s p i r ap l a t e n s i s t h es i m i l a r i t yo fd e d u c e da m i n oa c i di s9 9 6 ( b e t w e e n s y n e c h o c o c c u sc e d r o r u m a n ds y n e c h o c o c c u sp c c 7 9 4 2 ) a n d9 7 9 ( b e t w e e n s y n e c h o c o c c u sc e d r o r u ma n da r t h r o s p i r ap l a t e n s i s ) r e s p e c t i v e l y t h ep h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p sa m o n ge i g h tc y a n o b a c t e r i a w e r ea s s e s s e d b y t h em e t h o d so f n e i g h b o r - j o i n i n g ( n j ) a n dm a x i m u mp a r s i m o n ym 研 t h ec o m p l e t ep c y ag e n ei n c l u d i n g7 4 7 b pw a sc l o n e df r o ma r t h r o s p i r ap l a t e n s i s f a c h b 314b yu s i n gp c rt e c h n o l o g y h o m o l o g ya n a l y s i sb a s e do nc y a n o b a e t e r i a p c y ag e n e s h o w e dt h a tt h es i m i l a r i t yi s9 9 9 b e t w e e na r t h r o s p i r ap l a t e n s i s f a c h b 31 4a n ds y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 t h es i m i l a r i t yo fd e d u c e da m i n oa c i di s 9 9 6 ( b e t w e e na r t h r o s p i r ap l a t e n s i sf a c h b 3 14a n ds y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 ) t h ee x p r e s s i o np l a s m i d sv e c t o rp u c18 h - pa n dp s bi3 0 - h pw e r ec o n s t r u c t e d b yu s i n gi n f u s i o n t mk i ta d v a n t a g ep c rc l o n i n g t 1 h er e s u l t so fp c ra n d r e s t r i c t i o ne n z y m ed o u b l ed i g e s t i o ns h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sv e c t o r p u c 18 一h pa n dp s b13 0 - h ph a db e e nc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y i l l 蓝藻h o x l 基因和p 州基因的克 k e y w o r d s ：s y n e c h o c o c c u s ；a r t h r o s p i r a o x y g e n a s ei ；f e r r e d o x i n o x i d o r e d u e t a s e e x p r e s s i o nv e c t o r i v 一1 h 1 1 2 3 2藻蓝胆素的研究进展。一6 2 1 藻蓝胆素的结构6 2 2 藻蓝胆素的捕获和传递光能的作用7 2 3 影响藻蓝胆素光谱特性的因素8 2 4 藻蓝胆素的生物合成及重组9 3 亚铁血红素氧化酶i 与藻蓝胆素铁氧还蛋白还原酶的研究进展1 0 4实验目的及意义一一1l 4 1b o x l 基因和p c y a 基因的克隆1 2 4 2b o x l 基因和p c y a 基因的序列分析。1 2 4 3 表达载体的构建：。1 3 第二章b o x l 基因和p c y a 基因的克隆和序列分析 1 4 1材料与方法一14 1 1 试验材料14 1 1 1 组织样品l4 1 1 2 菌株与克隆载体：。1 4 1 1 3d n a 分析软件14 1 1 4 主要仪器设备14 1 1 5 药品和酶1 5 1 2 实验方法。l5 1 2 1 聚球藻和钝顶节旋藻的培养15 1 2 2 改进的c t a b 法提取微藻总d n a 1 5 1 2 3p c r 扩增16 1 2 4p c r 产物的克隆19 1 2 5 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化2 0 1 2 6 阳性克隆的筛选及鉴定2 0 1 2 7 测序2l 1 2 8 序列分析和系统树的构建2 1 2结果与分析。一22 2 1 总i n a 的提取2 2 2 2 电泳检测p c r 产物2 2 2 3b o x l 基因和p c y a 基因的测序结果2 3 2 4 开放阅读框分析2 4 2 5g c 含量分析一2 5 2 6 氨基酸序列分析结果2 6 2 7 蛋白质二级结构分析2 8 v 蓝藻h o x l 基因和j p c 叫基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 2 8h o x l 和p c y a 基因的序列同源性分析2 9 2 9 分子系统树的构建3 1 3讨论。一一32 3 1 改良的c t a b 法提取微藻的总d n a 3 2 3 2 降落p c r 3 3 第三章表达载体的构建 ：3 5 1利f料与方法。一一一35 1 1 材料。3 5 1 1 1 菌株及表达载体3 5 1 1 2 试剂- 3 5 1 1 3 主要试剂及培养基的配制3 6 1 1 4 仪器设备3 6 1 2 实验方法3 6 1 2 2h o x l 基因及p c y a 基因与启动子和终止子连接。3 6 1 2 3h 片段与p 片段和p u c ks 载体的连接4 6 1 2 4 表达载体的构建5 0 2 结果与分析 2 1 启动子和终止子的连接5 2 2 1 1 四个插入基因的双酶切结果5 2 2 1 2p c r 筛选鉴定转化子的结果一5 3 2 1 3 双酶切鉴定转化子结果5 4 2 2 两片段与p u c l 8 载体的连接5 5 2 2 1 线性载体的获得5 5 2 2 2h 片段和p 片段的扩增5 6 2 2 - 3 融合实验检测结果。5 6 2 3 表达载体的构建5 7 2 3 1p s b l 3 0 线性载体的获得5 7 2 3 2 转化子的鉴定5 8 3讨论一一58 3 1i n f u s i o n t m 试剂盒的使用5 8 3 2 载体选择策略5 9 3 3 有关酶切体系5 9 参考文献。一6 l 致谢 v 1 蓝藻是一类光合原核生物，是藻类中最古老、最原始的门类，在地球上出现 有3 0 多亿年，是海洋中重要的原初生产者之一。蓝藻的主要特征是原核( 原始核) 、 以细胞分裂的方式进行繁殖和体内含有藻胆体。蓝藻在植物进化序列中处于低等 的光合细菌和高等植物之间，它们的光合系统类似于真核藻类和高等植物，具有 光合系统i 和光合系统i i 两个光合反应中心。但是，高等物的捕光天线是类囊体 膜内的叶绿素，而藻类的捕光天线色素主要集中于紧连在囊体膜外的藻胆体( 图 1 1 ) 内。 。言：珏i ：篱：毒鼹篡辍俸叁耄?0鹃缀熬氇索哦c ：黼i 固 蓁麓 图1 1 蓝藻藻胆体及与类囊体连接的模型图 f i g 1 - lm o d e lo f c y a n o b a c t e r i ap h y c o b i l i n s o m ea n di t s c o n n e c t i o nw h t h t h y l a k o i d 蓝藻分子遗传学研究始于上世纪八十年代，这一时期属于开拓阶段，主要任 务是建立基因转移体系，筛选突变株，单个基因的克隆和表达分析。进入九十年 代，其研究则开始着眼于基因调控途径及网络的解析，生物钟和异型胞分化研究 是这 完成 藻集 腥藻 成基 重要 共有 楠，2 0 0 7 ) 。 由于蓝藻特有的生物学特征和特殊的进化地位，是研究光合作用的理想的实 验系统，从分子水平了解光合作用的机制一直是蓝藻分子遗传学的重点。自1 9 8 0 年从鱼腥藻( a n a b a e n av a r i a b i l i s ) 中克隆到n i f h l 基因，至今克隆的各种功能基 因1 3 0 种以上，其中7 0 以上与光合作用有关( 秦松等，1 9 9 3 ) 。 1 2 藻胆体简介 对藻胆体( p h y e o b i l i s o m e s ，p b s s ) 的研究开始于2 0 世纪6 0 年代中期，g a n t t 和c o n t i 在红藻中进行了一系列的实验，从含类囊体膜的叶绿素a ( e h l o r o p h y l la ， c h la ) 外表面和基质层分离出一些外在的小颗粒，并发现这些水溶性分离物质为 藻类的色素蛋白( g a n t t & c o m i ，1 9 6 5 ，1 9 6 6 a , 1 9 6 6 b ) 。由此引发的一系列的相关研究 表明，蓝藻和蓝绿藻共生体中含有藻胆体( l e f o r t , 1 9 6 5 ；e d w a r d se t a 1 ，19 6 8 ；e d w a r d s & g a n t t ，19 71 ；w i l d m a n & b o w e n ，19 7 4 ) 。 在蓝藻、红藻和部分隐藻的捕光系统中，作为一种高度有序的超分子复合体， 藻胆体排布在类囊体膜表面，分子量范围在7 x1 0 6 - 1 5 x 1 0 6 d a 之间，形状和大小 与藻体类别密切相关( g l a z e ra n ，1 9 8 4 ) 。依据形态可将藻胆体分为四种：维管束 状( b u n d l e s h a p e d ) ( g u g l i e l r n ig e ta l ，1 9 8 1 ) 、半圆盘状( h e m i d i s c o i d a l ) ( b r y a n tdae t a l , 19 7 9 ) 、半椭球状( h e m i - e l l i p s o i d a l ) ( g a n t te ，19 8 0 ) 和块状( b l o c k - s h a p e d ) ( g a n t tee t a , 1 9 7 4 ) 。在红藻和蓝藻中，藻胆蛋白通常以较高的聚合态( 三聚体和六聚体) 严格组装起来，形成半盘状或半椭圆形的藻胆体颗粒( r e u t e rw e ta , 19 9 3 ；z h a ok he ta 厶2 0 0 0 ) 。半盘状藻胆体是最常见的藻胆体类型，也是迄今为止研究比较清 楚的一种( m a c c o l lr 1 9 9 8 ) 。它一般长约7 0 n m ，高3 0 5 0 n m ，宽1 4 - - 1 7 n m ，与 2 蓝藻h o x l 基因和p c y a 基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 类囊体膜朝向细胞质的一面相连( z h a okh e ta l ，2 0 0 0 ；t o o l e yaje ta , 2 0 0 2 ； f u g l i s t a l l e r p e t a l ，1 9 8 3 ) 。藻胆体的核心部分是别藻蓝蛋白，由核心向外放射状排 有藻红( 藻红蓝) 蛋白和藻蓝蛋白构成的天线杆( 图1 2 ) 。藻胆蛋白之间通过连 接多肽( 1 i n k e rp o l y p e p t i d e s ) 按照一定次序组合在一起，其中藻胆蛋白的主要作用 是吸收光能，而连接多肽的作用是组织稳定藻胆体的结构，并调节藻胆蛋白吸收 光的范围，两者分别约占藻胆体总量的8 5 9 0 和1 0 1 5 ( t a n d e a ue ta l ，1 9 7 7 ； s l i d l e r , 19 9 4 ) 。 腻k 廷阑i l 图1 - 2 藻胆体结构的假想模式图 f i g 1 - 2h y p o t h e t i c a lm o d e lm a po fp h y e o b i l i s o m e ss t r u c t u r e p e 藻红素；p c m 藻蓝素；a p c 一别藻蓝素 p e p b y c o e r y t h r o b i l i n ；p ( 卜巾h y c o c y a n o b i l i n ；a p c - - - a l l o p h y e o c y a n i n 从藻胆体内部结构来看，其能量传递顺序是严格的。藻胆蛋白的发色基团被 严密地固定和包装在盘状结构中，这些盘顺次堆迭在一起，构成高度有序的藻胆 体，加上连接蛋白的调节作用，使得能量只能单向地传递。通过比较p e 、p c 、 a p c 和叶绿素a 的吸收光谱和荧光发射光谱，它们之间依次具有较强的荧光发 射和吸收重迭。这表明能量在光合作用系统内的传递顺序为p e p c a p c c h l a ( a i l i n s k a sbr e ta i , 1 9 8 6 ) 。每个藻胆体通常含有3 0 0 - , 8 0 0 个藻胆蛋白。光能 首先在不同的藻胆蛋白之间传递，最后传递给位于类囊体膜上的反应中心叶 绿素分子。能量在藻胆蛋白内部之间的传递则遵循着由能量高的向能量低的色素 体传递的规律，藻胆蛋白的这一传递能量过程在体内的效率接近1 0 0 ( g l a z e ra n ，1 9 8 4 ) 。藻胆体可以吸收4 6 0 , - , 6 7 0 n m 范围内的光，吸收的激发能量以接近1 0 0 的量子效率传到了类囊体膜的中心体上进行光合作用( g l a z e r a n ，1 9 8 9 ) 。 1 3 藻胆蛋白简介 3 利 即 入 e t a l ，1 9 9 3 ；m a c c o l l ，1 9 9 8 ) 。( a p c ) ，在大部分的蓝藻和红藻中，都存在有p e ，p c 和a p c 。在不同的藻种中，提取得到的藻胆蛋白在结构上会有一些微小的差别， 在光谱性质上也不尽相同。藻胆蛋白由q 和o 亚单位组成，少数还存在y 亚单位。 每个亚单位含1 _ 4 分子发色基，而一种胆蛋白至多只有两种发色基。发色基即是 被称为“藻胆素 ( p h y c o b i l i n s ) 的开链四毗咯化合物( 0 6 k d ) 。 具有光学活性的藻胆蛋白特别是藻蓝蛋白成为近些年的研究热点，例如连接 有藻蓝胆素的藻蓝蛋白具有抗氧化抗炎症作用、抗肿瘤活性、可以作为天然色素 和饲料添加剂在日常生活和生产中广泛被使用。 抗氧化抗炎症作用：许多研究表明( h i r a mt e ta t , 1 9 9 9 ；h i r a t ate ta l ，2 0 0 0 ； p i n e r oe s t r a d aj ee ta l ，2 0 0 1 ) 藻胆蛋白具有抗氧化活性，在体内和体外都可以防 止脂质体过氧化，保护d n a 不受破坏，同时还具有消除炎症的功能，并且藻胆 蛋白的抗氧化活性随其纯度的增加而增加，表明藻胆蛋白清除自由基的能力主要 与藻胆蛋白中的藻胆素有关。在各种体外和体内实验模型中，藻蓝蛋白通过清除 轻基、烷氧基和过氧化物等活性氧物质来实现抗炎症活性。进一步研究表明，抗 炎症活性并不依赖于皮质幽类物质的释放。藻蓝蛋白能抑制f e 3 + 抗坏血酸维生 素c 诱导的过氧化反应。口服藻蓝蛋白提取物( 5 0 3 0 0 m g k g ) 导致显著的抑制活 性。( r o m a yc e ta l , 2 0 0 0 ；b h a tv be ta l , 2 0 0 0 ；m a c d o n a l dt me ta l , 2 0 0 3 ) 抗肿瘤活性：1 9 8 6 年，哈佛医学院的s c h w a r t z 和s h k l a r 报道了藻蓝蛋白对 消化系统肿瘤有抑制作用。1 9 8 9 年，美国的一篇专利介绍了应用藻胆蛋白作为 光敏剂处理动脉粥样硬化的离体实验和移植肿瘤的动物实验，结果表明，藻胆蛋 白对血管内硬化斑具有显著的清除作用，对移植癌细胞有显著的抑制作用和杀伤 效果。沈海雁等( 2 0 0 0 ) 运用半固体琼脂培养法和m t t 检测测定螺旋藻藻蓝蛋白 对人血癌细胞株h l 6 0 、k - 5 6 2 和t 1 9 3 7 生长的影响。体外培养条件下用不同浓 度的藻蓝蛋白处理这3 种肿瘤细胞，结果显示螺旋藻藻蓝蛋白对这3 种肿瘤细胞 均有不同程度的抑制作用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。蔡心涵等 4 蓝藻h o x l 基因和j 弦基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 用钝顶螺旋藻中提取的藻蓝蛋白处理人大肠癌细胞株h r 8 3 4 8 后，经6 3 0 u n l 铜 激光辐照，癌细胞存活率显著降低。给5 1 8 0 移植瘤小鼠分别注射2 m g 或口服 2 0 m g 藻蓝蛋白后，再用铜激光辐照1 5 d ，有效杀死率分别为6 0 和5 3 。结果 说明藻蓝蛋白的确具有光敏作用和良好的的抑癌作用，且藻蓝蛋白无毒无副作 用，是一种理想的光敏剂。： 抗辐射能力：蓝藻的一个重要生物学属性是它能够有效抵抗紫外线和其它电 离射线辐射。藻蓝蛋白，蓝藻中的活性成分之一，能显著抑制血细胞的减少。造 血干细胞的损伤或修复在造血功能型辐射疾病中至关重要。( r o m a y ce t 以1 9 9 8 ； i 妯 p o v l me t a l , 1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) 而藻蓝蛋白能降低造血干细胞的光敏感性，防止干细胞 减少，促使细胞进入增殖状态，有助于造血功能的恢复。腹腔注射藻蓝蛋白能缓 和辐射引起的鼠外周血核骨髓细胞损伤，加速鼠外周血白细胞、骨髓核细胞和多 功能造血干细胞的修复。在6 0 c oy 射线照射实验中也能观察到c 一藻蓝蛋白核多 糖参与的白细胞和骨髓成核细胞的损伤修复。藻蓝蛋白能降低6 0 c o y 射线照射 和腹膜盐酸苯脐注射联合处理小鼠的贫血水平。 天然色素和饲料添加剂：由于藻胆蛋白有鲜艳的颜色且易溶于水，可作为工 业理想和安全的天然色素添加剂，用于食品、化妆品和染料等。现代医学发现， 化工合成色素有增加人类致癌机率的危险，因此有关天然色素的开发利用日益受 到科学家的重视。m i y a g a w a k a z u k i 和k a t a m i n o t a k a s h i 等就成功的提取了藻蓝蛋 白作为食品和化妆品色素添加剂。作为一种蛋白，它还可以添加到食品和饲料中 充当营养强化剂；大日本油墨公司开发出商品名为l i n a b l u e a 的钝项螺旋藻藻蓝 蛋白产品作为蛋白质营养强化剂应用于食品和饲料中。在美国，藻胆蛋白被食品 药品管理局( f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n ，f d a ) 列为安全性产品；大日本油墨公 司开发出商品名为l i n a b l u e a 的钝项螺旋藻藻蓝蛋白产品用作食物色素及化妆 品( 张成武等，1 9 9 5 ) 。 生物化学示踪剂：由于藻胆蛋白有以下特点：( a ) 含有多胆色素发色基团及 在较宽的光谱范围内有较高的吸收系数；( b ) 在较宽的p u 值范围内有较高的荧光 产率；( c ) 从4 4 0 n m 处开始有较强的可见光吸收波长，并从5 5 0 n m 处开始有强烈 的发射波长一直延伸到红光区；( d ) 它们的荧光不因其它生物分子的存在而消失； ( e ) 它们在水溶液有较好的溶解性；( d 以液体或固体状态存在时都极为稳定且能 蓝藻h o x l 基因和p 鲥基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 保存较长时间。因此它们在荧光显微术( f l u o r e s c e n e e m i e r o s e o p y ) 、免疫检测 ( i m m u n o a s s a y s ) 、和流式细胞仪技术( f l o w e y t o f l u o r i m c t r y ) 方面是很好的生物化学 示踪物( b i o e h e ：n i e a l t r a e e r ) 。 其他功能：藻蓝蛋白能抑制溶血作用，作用方式与维生素衍生物和抗坏血酸 维生素c 相似，不同的是藻蓝蛋白的抗氧化能力要强得多( 1 7 倍 - - - 2 0 倍) 。这种 保护作用可能是由清除水相中相关基团引起的。利用c f u - e ( c o l o n yf o r m i n g u n i t - e r y t h r o i d ) 技术体外培养小鼠胚胎肝脏细胞，相继的研究证实c 一藻蓝蛋白和 多糖能影响特定的造血祖母细胞的分化和增殖。具体的机制还不清楚，可能是通 过调节造血细胞分化增殖所需因子的产物来实现的。另外，藻蓝蛋白的还有重要 的药用价值。i i j i m a 等认为藻蓝蛋白能促进免疫系统，以抵抗各种疾病；哈佛医 学院s c h w a r t z 和s h k i a r 等也发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有抑制作用；浙 江医科大学曾苏等把从螺旋藻中抽提取出藻蓝蛋白作为一种新型治疗癌的新药 物。 2 藻蓝胆素的研究进展 2 1 藻蓝胆素的结构 在红藻和蓝绿藻的光合作用天线系统中，藻胆色素是吸收光能和传递激发能 的重要光合色素( v a nc r r o n d e l l e re ta l ，1 9 9 4 ) 。与叶绿素( e h l ) 、细菌叶绿素( b c l 由 和胡萝卜素( c a r ) 等其他光合色素不同，藻胆色素是一类线性四吡咯化合物( 分 子量约6 0 0d a ) ，它的结构与哺乳动物的色素( b i l i n s ) 相似，并以共价键硫醚键 与多肽链相连接。目前已知的藻胆色素有8 种( l a e m m l iuk ，1 9 7 0 ) ，其中在蓝藻 中有4 种，它们是藻红胆素( p h y c o e r y t h r o b i l i n ，简称p e b ) ，藻蓝胆素 ( p h y c o c y a n o b i l i n ，简称p c b ) 、藻尿胆素( p h y c o u r o b i l i n ，简称p u b ) 、藻紫藻 素( p h y c o v i o l o b i l i n ，简称p v b ) 。结构如图1 3 所示。 6 瞳 列 图1 3 藻胆色素的结构简图 f i g 1 - 3s 觚c t u r ed i a g r a mo fp h y e o b i l i n 2 2 藻蓝胆素的捕获和传递光毹的作用 早在十八世纪八十年代研究植物的光合作用的过程中科学家们就观察到一 个有趣的现象：以颤藻为材料进行光合作用放氧实验，用一个显微分光镜将光色 散成红、橙、黄、绿、青、蓝等不同波长的光，并将其照射在藻丝体上，再把好 氧性细菌放在藻丝体的周围，最终细菌将会移动到放氧作用最强烈的藻丝体部位 上。我们可以观察到这个部位就是光波为5 7 0 - - - 6 3 0 n m 的绿、黄光到红色光的区 域。进一步对藻胆体中的各种藻胆素的吸收光谱进行研究，可测出藻红素的最大 吸收在5 6 5 - 5 7 0 n m ；藻蓝素在6 1 0 - - 6 2 0 n m ，别藻蓝素在6 5 0 n m 。这些吸收高峰 位置恰恰是上述光合作用放氧实验中最有效的照射光位置。后来在测定荧光光谱 时又发现，藻红素吸收的光能够引起藻蓝素和叶绿素a 发射荧光，这表明藻红素 吸收的光能可以被传递到藻蓝素和叶绿素a 上，藻蓝素吸收的光能可以传递到叶 表1 1 藻胆素在可见光中的最大吸收和最大荧光发射 t a b l e l 1t h em a x i m u ma b s o r b a n c ea n dt h em a x i m u m f l u o r e s c e n c ee m i s s i o no f p h y c o b i l i ni n v i s i b l el i g h t 名称最大吸收( i 珊)荧光最大发射( 姗) 藻红素 5 6 5 5 7 05 7 7 藻蓝素 6 1o - 6 2 06 3 7 别藻蓝素 6 5 06 6 0 绿素a 上。从表1 1 中所列数据可以看到各藻胆素在可见光范围内的最大吸收和 最大荧光发射之间存在着一定的顺序性，而叶绿素的最大吸收在6 6 0 - - 一6 6 6 n m ， 恰好排列在藻胆素的后面( 方昭希，1 9 8 4 ) 。据以上分析可以推测藻胆素在藻类 7 蓝藻h o x l 基因和脾4 基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 细胞起捕获光能和传递光能的作用，通过一系列的传递，最后将光能传到叶绿素 a ，进行光合作用。传递的顺序是：藻红素一藻蓝素一别藻蓝素一叶绿素a 2 3 影响藻蓝胆素光谱特性的因素 藻胆色素是藻胆蛋白的辅基色素，是一类线性四吡咯化合物。藻胆色素的吸 收光谱受双键的位置、共轭程度的影响很大，一般来说，共轭双键数越多，最大 吸收峰越向红移。另外，藻胆色素的光谱还主要受6 个因素的影响： ( 1 ) 构象影响游离的藻胆色素在溶液中是卷曲构象，其吸收光谱特征是紫 外部分吸收与可见部分吸收比值大于或接近于l ( s c h e e rhe t 以1 9 9 7 ) ，如果藻胆 色素处于伸展构象，则其吸收光谱特征是紫外部分吸收与可见部分吸收比值远小 于1 ，脱辅基蛋白的作用就是使色素保持伸展状态，从而获得对可见光区域的最 大吸收。 ( 2 ) 与脱辅基蛋白的连接方式藻胆色素以单键或双键的形式与脱辅基蛋白 上的半胱氨酸残基通过硫醚键的连接也改变了色素的吸收特性。 ( 3 ) 周围微环境的影响藻胆色素与其周围的微环境的相互作用也极大的影 响其能量态。如藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，虽然都是与藻蓝色素共价连接，但是它 们的吸收光谱却显著的不同：藻蓝蛋白三聚体的吸收峰在6 2 0 h m ，而别藻蓝蛋白 三聚体在6 5 0 n t o 。即使是藻蓝蛋白本身，q1 3 单元上的三个色素也是具有不同的 能量。 ( 4 ) 聚集状态的影响藻胆蛋白的聚集状态对其光谱也有很大的影响。单聚 体和三聚体的藻蓝蛋白有不同的吸收光谱和荧光光谱。 ( 5 ) 藻胆色素之间的影响相邻藻胆色素之间也有影响，例如两者之间不同 的能量状态的影响。多种光谱学的研究还表明，藻胆蛋白中的色素分子可以分为 两类，一类起供体作用，称为敏化型或s 型( s e n s i t i z i n g ) ；另一类起受体作用， 称为荧光型或f 型( f l u o r e s c i n g ) 。对于藻胆蛋白，q1 3 ( 藻胆蛋白单聚体) 的吸 收光谱只是q 和1 3 吸收光谱的简单迭加，但q1 3 更进一步的聚合形成( q1 3 ) 3 ， 则会导致它们吸收峰红移，并伴有吸收强度增加。 ( 6 ) 连接多肽的影响连接多肽的存在与否也影响藻胆蛋白的光谱特性，这 是因为连接多肽的存在可以改变藻胆蛋白之间的聚集状态。 8 蓝藻h o x l 基因和p c y a 基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 2 4 藻蓝胆素的生物合成及重组 藻胆蛋白只有结合了色基具有了光学活性，用于肿瘤光动力学治疗和诊断以 及免疫学等医学研究的藻胆蛋白必须结合有色基。色基的生成和连接到脱辅基蛋 白的过程是一系列酶促反应过程( t o o l e yaje ta l ，2 0 0 1 ；f a i r c h i l dcde t 以 1 9 9 4 ) 。脱辅基藻胆蛋白，需要在酶催化作用下与其他方法提取的色基于体外连 接后才具有光学活性。如果能够将合成色基的相关基因同时转入重组菌，则可以 直接在体内表达能够发光的藻胆蛋白。 l 弧m 睡h o l o - o k p b y c o c y a n l n p c y a 撩i 梳棚l l l 馐_ 弦p h y 驴聃b 啦n 4 - a p o - l x - p h y c o c y a n i n 鼹l 图l 一4 藻蓝胆素的生物合成途径及其与藻蓝蛋白q 亚基的连接 f 适1 - 4m i n i m a lb i o s y n t h e t i cp a t h w a yf o rt h ep r o d u c t i o no fp h y e o c y a n o b i l i nf r o m h e m ea n di t sa d d i t i o nt ot h ec - p h y c o e y a n i na p o - qs u b u n i t b e a l e ( 1 9 9 1 a ) 对体外合成具有光学活性的藻胆蛋白进行了初步研究。他 用从单细胞红藻c y a n i d i u mc a l d a r i u m 中得到的无细胞提取物在体外合成了色基 前体。实验表明：与叶绿素一致，藻胆蛋白色素生物合成的前体物质也是氨基乙 酰丙酸，数步反应后至原卟啉时发生分叉。倘若反应液中含有m 矿十螯合酶， 反应的终产物是叶绿素；倘若反应体系中主要由f e 2 + 螯合酶催化，反应的终产物 将会是藻胆色素。藻胆色素的合成过程如下：藻蓝胆素来源于血红素，血红素 被氧化而共轭环断裂形成胆绿素，这一过程是在亚铁血红素氧化酶i ( h e i n e o x y g e n a s e l ，h o x l ) 催化下完成的( j u a nc o m e j o e ta t , 1 9 9 7 ) ，胆绿素在藻蓝素铁 氧还蛋白还原酶p c y a 的催化下形成藻蓝胆素( r h i ege ta l ，1 9 9 2 ；r h i ege t 9 蓝藻h o x l 基因和p 州基因的克隆、序列分析及表达载体的构建 讲，1 9 9 5 ) 。在相应的连接酶催化下，藻蓝色素与多肽链上的保守c y s 残基形成硫 醚键共价连接( 如图1 _ 4 ) 。 c o r n c j o ( 1 9 9 8 ) 克隆了与藻胆素合成的相关基因，并在大肠杆菌中表达了该基 因，加入底物中性血红素( m e s o h e m e ) 生成了藻胆素前体物质中性胆绿素i x q ( m e s o b i l i v e r d i ni xa ) 。 c a i 等( 2 0 0 1 ) 在鱼腥藻a n a b a e n as p p c c7 1 2 0 中表达带各种标签的重组c 藻 蓝蛋白亚基，重组蛋白亚基在藻体中表达后，与藻体相应亚基聚合成具有天然藻 蓝蛋白