（遗传学专业论文）马蹄莲、石斛和姜凝集素基因的克隆及分析.pdf

博士指导小组成员名单唐克轩教授沈大棱教授杨金水教授复旦人学博，i ：学位论义摘要凝集素是一类含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质。单子叶植物甘露糖结合型凝集素( m o n o c o tm a n n o s e b i n d i n ga g g l u t i n i n s )是其中比较大的一个家族，其中以雪花莲凝集素为代表的一个亚类显示出良好的抗同翅日昆虫活性，以天麻抗真菌蛋白为代表的另一亚类则具有突出的抗真菌活性，它们在植物抗虫和抗病基因工程中均具有很大的应用潜力。为了挖掘更多更有效的抗病、抗虫基因，本文对植物凝集素基因进行研究，以马蹄莲、石斛和姜为材料，利用r a c e - p c r 技术，成功地从中克隆出了凝集素基因，并对其功能进行了研究，得到如下结果：1 首次从天南星科植物马蹄莲。p 克隆了马蹄莲凝集素基因嬲以z a a 的全长c d n a 为8 7 i b p ，含有一个4 1 7 b p 的丌放阅读框，编码一个出1 3 8 个氨基酸组成的前体蛋白。对z a a 和其他单子叶甘露糖结合凝集素的序列同源性进行了比较，并发现z a a 是一个多基凼家族编码的。半定量r t p c r 表明朋a 在马蹄莲植物的各个部位都有表达，其中在叶柄中的表达量最高。2 克隆了马蹄莲凝集素基囚的包含启动子区、终止予区和全长基因组序列，并对其启动子区基本活性元件和抗病相关的元件以及其它的元件进行了预测。启动子区具有核心启动子，终止子富含a + t 序列，形成发夹结构，具备终l l 二子的特征。3 构建了嬲矗基因的植物表达载体o c a m b i m 3 0 4 一z 船并导入到根癌农杆菌e h a l 0 5中，对烟草进行了转化。4 从兰科植物铁皮石斛中克隆了石斛凝集素基因d o a l 和d o a 2 , d o a l 的全长c d n a为7 6 8 b p ，含有一个4 9 8 b p 的丌放阅读框，编码1 6 5 个氨基酸：d o a 2 的全长c d n a为7 7 7 b p ，含有一个5 1 3 b p 的开放阅读框，编码1 7 0 个氨基酸。5 曲次从姜科 血物姜i t 兜隆了姜凝集岽基因z d “，姜凝集索丛的全妖为7 6 8 b p ，含有一个5 1 0 b p 的丌放阅读框，编码1 6 9 个氨基酸。分析表明，姜凝集素属于单子叶甘露糖结合的凝集素，该研究不仅把这一家族凝集素( 甘露糖结合凝集素)延伸到了姜科，而且有助于进一步研究凝集素的进化关系。6 分别构建了含a h n ( 天南星凝集素) 、如韶初z 基因的原核表达载体，并成功地实现了这三个基因在 ：c o l i 巾的表达，并对其重组的蛋白进行了纯化。从植物中提取了天然的a l i a 和z o a ，作为对照进行了凝j i n 活性实验。结果表明重组斛i a和z o a 具有和天然蛋白一样的凝血活性。抑菌实验表明，重组d o a 2 和z o a 能明显抑制小麦赤霉病菌的生长。马蹄莲、石斛和姜凝集素基因的克隆为深入研究其抗病虫害功能打下了基础，该研究刈获得更多具有自主知识产权的功能基因、为利用基因工程技术改良农作物抗病复丑人学博1 学位论义虫性具有潜在的重要意义。关键词：马蹄莲凝集素( z a n t e d e s c h i aa e t h i o p i c aa g g l u t i n i l l ，z a a ) ，石斛凝集素( d e n d r o b i u mo f f i c i n a l ea g g l u t i n i n ，d o a ) 姜凝集素( z i n g i b e r o f f j _ c i n a l ea g g l u t i n i n ，z o a ) 。r a c e ，重组蛋白，凝血活性分析，抑菌分析，遗传转化复咀人学博。j 学位论文a b s t r a c ta g g l u t i n i n sa r ep r o t e i a sp o s s e s s i n ga t1 e a s to n en o n c a t a l y t i cd o m a i n ，w h i c hb i n d sr e v e r s i b 】yt os p e c i f icm o n o o ro l i g o s a c c h a r i d e s a m o n gt h e mas u b f a m i l yr e p r e s e n t e db yg a l a n t h u sn i v a h s a g g l u t i n i n ( g n a ) i sc h a r a c t e r i z e dw i t he f f e c t i v er e s i s t a n c ea c t i v i t ya g a i n s th o m o p t e r a ni n s e c t s ，w h i l ea n o t h e rs u b f a m il yr e p r e s e n t e db yg a s t r o d i a n i ni sm o r ee f f e c t i v ea g a i n s tp a t h o g e n i cf u n g i ，w i t hb o t h0 ft h es u b f a m i lys h o w i n gg r e a tp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni np l a n tt e n is t a n c ei m p r o v e m e n ta g a i n s ti n s e c t so rf u n g a lp a t h o g e n s t o s e e km o r ee f f e e l i v eg e n e sw i t hi n s e c tr e s is t a n c eo ra n t i - f u n g a la c t i v it i e s ，a g g l u t i n i ng e n e si n e l u d i n gz a a d o aa n dz o aw e r es u c c e s s f u l l yi s o la t e d f r o mz a n t e d e s c h i ai r e t h o p i c a ，b e n & o b i u mo f f c i n a l ea n dz j n g t b e ro f f i c i n a l eb yu s i n g r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( r a c e ) 一p c rm e t h o dr e s p e c t i v e l y ，a n dt h e i rf u n c t i o n sw e r ea l s os t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l 】o w s ：1 t h ef u l1 1 e n g t hc d n ao fz a ag e n ew a so l o n e df i r s t l yf r o mza e t h j o p j c a ，w h i c hb e l o n g st oa r a e e a of a m i l y t h ef u l 卜l e n g t hc d n ao f 朋aw a s8 7 1 b pw i t ha no p e n i n gr e a d in gf r a m e0r4 1 7 b pe n c o d i n gap r o t e i nw i t h1 3 8a m i n oa c i d s s e q u e n c eh o m o l o g ya n a ly s isw a sa l s oc a r r i e do u ta m o n gz a aa n do t h e rm o n o c o tm a n n o s e b i n d in gu 9 9 1 1 3l n in s s o u t h e r nh l o t t i n gr e s u l t sr e v e a l e dt h a t 朋aw a se n c o d e db yam u l t i p l eg e n ef a m il y s e m i q u a n t i t a t i v er t p c ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tz a am r n ae x p r e s s i o nc o u l db ed e t e c t e di n a 1 1 t h et e s t e dt is s u e sa m o n gw i t ht h eh i g h e s te x p r e s s i o nb e i n gf o u n di np e t i e l e 2 r h ep r o m o t e rr e g i 0 1 3 t e r m in a t o rr e g i o na n dt h eg e n o m i cs e q u e n c eo f 朋日w e r ea l s oc l o n e d t h ec o r ep r o m o t e r ，b a s i ca c t i v em o t if ，m o t i fr e l a t e dt oa n t i d i s e a s ea n do t h e rm o t i f sw i t h i np r o m o t e rr e g i o nw e r ea n a l y z e d t h et e r m i n a t o rw a sr i c hi na + ta n di tf o r m e das t e ms t r u c t u r e 。w h i c hw a st h et y p i c a lf e a t u r eo ft e r m i n a t o r 3 ap l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 4 一z 3 ac o n t a i n i n gz a ag e n ew a sc o n s t r u c t e da n di n t r o d u c e din t od g r o b a c t e r i u mf u m e f a g l e n ss t r a i ne h a l 0 5 3复丑人学博i 学位论史s u b s e q u e n t1y ，t h iss t r a i nw a su s e di nt o b a c c ot r a n s f o r m a t i o n 4 9 0 a la n dd o n 2w e r ec l o n e df r o m 口o f f i c l n a e , as p e c i e so fo r c h i d a c e a ef a m i l y t h ef u l l l e n g t hc d n ao fd o a lw a s7 6 8 b pw i t ha no p e n i n gr e a d i n gf r a m eo f4 9 8 b pe n c o din gap r o t e i nw i t h1 6 5a m i n oa c i d s t h ef u l l l e n g t he d n a o fd o n 2w a s7 7 7 b pw it ha no p e n i n g r e a d i n gf r a m eo f5 1 3 b pe n c o d i n gap r o p r ol e jnw i t h1 7 0 a m in oa c i d s 5 z o aw a sf ir s tis o l a t e df r o mzo f f i c i n a l e ,w h i c hb e l o n g st oz i n g i b e ：a c e a e f a m i l y t h ef u l l 一l e n g t hc d n ao fz 0 8 w a s7 6 8 b pw i t ha no p e n i n gr e a d i n gf r a m eo f5 1 0 b pe n c o d i n gap r o t e i nw i t h1 6 9a m i n oa c i d s t h ei d e n t it i c a t i o no ft h ez o f n c i n a l e 、e c t l na sam e m b e ro ft h em o n o c o tm a n n o s e b i n d i n gl e c t i n sn o to n l ye x t e n d st h eo c c u r r e n c eo ft h i sl e c t i nf a m il yt ot h ez i n g i b e r a c e a eb u ta l s oc o n t r i b u t e st oaf u r t h e ru n d e r s t a n d i n go ft h e ifm 0 1 e c u l a re v o l u t i o n 6 1 h ec o d i n gs e q u e n c e so ft h em a t u r e 爿h e t e r o p h y i i u ma g g l u t in i n ( a i m ) 以o l y ) c i n a l ea g g l uli n i n2 ( d o a 2 ) a n dzo l y t c i n a l ea g g l u t i n i n ( z o a ) w e r ei n s e r t e di n t ot h eb a c t e r i a le x p r e s s i o nv e c t o rw i t ht h er i g h to r f s t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n si nt h er e s u t i n gv e c t o r sw e r es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di n 叵c o ia n dp u r i f i e d t h er e c o m b i n a n ta i ma n dz o ah a dt h es a m ea g g l u t i n a t j o na c t i v i t i e st o w a r d sr a b b i tr e dc e l l sa st h en a t i v ea i ma n dz o ai s o l a t e df r o m t h ep 1 a n t s a n t i - f u n g a la s s a yr e v e a l e dt h a tt h er e c o m b i n a n td o a 2a n dz o ac o n ldin h i b i tt h eg r o w t ho fg i b b e r e l i az e a e t h ec 1 0 n i n go fz 日h ，d o na n dz o ap r e y i d e sab a s i sf o rf u r t h e rin v e s t i g a t i n gt h e i fi n s e c ta n dd i s e n s e r e s i s t a n c ef u n c t i o n s t h iss t u d yi so fp o t e n t i a li m p o r t a n c en o to n l yf o r t h eo b t a i n i n go fi n t e l l e c t u a lp r o p e r t i e so fm o r ea n t i in s e c ta n dd i s e a s eg e n e sb u ta l s of o rt h ei m p r o v e m e n to fc r o p sf o ri n s e c ta n dd is e a s er e s isl a n c e sb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g k e yw o r d s：z a n t e d e s c h i aa e t h i o p i c aa g g l u t i n i n ( z a a )，) e n d l l o b i u mo f t y c i n a l ea g g l u t i n i n ( d o a ) ，z i n g i b e ：o f f i c i n a l ea g g l u t i n i n( z o a ) ，r a c e ，r e c o m h in a n tp r o t e i n ，h e m a a g g l u t i n a t i o na c t i v i t ya n a l y s i s ，a n t i f u n g a la n a l y s i s ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 4复口人学博i j 学位论文引言统计数字显示，1 9 9 9 年全世界人口数己达到6 0 亿，到2 0 5 0 年将达到9 0 亿。几乎所有增长的人口都出现在发展中国家。与此同时，人均可耕地却在逐年减少。在下一个5 0 年，可耕地还将减少一半。如何持续稳定地增加粮食产量、改良粮食品质直接关系到人类的健康和发展，己成为各国政府和科学家所面临的严峻挑战。二十世纪七十年代初建立并发展起来的基因工程，经过2 0 多年的不断进步和发展，已在生物学领域中起着越来越重要的作用。自1 9 8 3 年世界上首例转基因植物问世以来，基因工程越来越受到世界各囡的关注并得以飞速发展，已育成了一大批耐除草剂、抗病、抗虫、抗病毒、抗寒的高产、优质农作物新品种和植物材料，并逐渐在农业生产上大面积推广应用。据统计，到目前为止转基因在1 2 0 种植物上获得了成功，有3 0 0 0 多例转，因植物进入问试验，在荚国年1 1 ) t l l 拿大有5 0 多种转基因植物进入商品化生产。植物凝集素是一类特异结合糖类的蛋白质，在农业、医学等领域极有应用前景。近年来，越来越多的分子生物学、生物化学、细胞学、生理学及进化学上的证据表明，许多植物凝集素在植物生长发育的各个阶段以不同的方式保护植物免受病虫的侵害，在抗病虫基因工程方面具有潜在的应用价值。本论文采用c d n a 本端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s ，r a c e ) 技术，肖次从马蹄莲、石斛和姜巾克隆出凝集素基因，并对其进行了序列分析和功能预测；成功地构建了含石j | 1 ； 、姜和天南星凝集素基因的原核表达载体在大肠杆菌中实现了其表达并对其蛋白进行了纯化及功能分析。此外，还构建了含马蹄莲凝集素基因的植物表达载体并转化了烟草，为深入研究该基因的抗病虫功能奠定了基础。复口人学博i 学位论义第一章文献综述凝集素是一类与糖专一结合的蛋白质或糖蛋白，出于它的生物学和化学特征使其在细胞生物学、生物化学、免疫学等许多研究领域有着广泛的用途。凝集素广泛分布于自然界中，几千种凝集素已经分离到。1 1 凝集素的定义一般来况，凝集素是一类可逆地结合特异单糖或寡糖的蛋白质。早期凝集素( 1 e c t i n ) 的定义是指许多能选择性凝集人血中红细胞的特异结合碳水化合物的蛋白质，l e c t i n 来源于拉丁文l e g e r e ，意思是选择。l e c t i n 还有两个同义词，h a e f l l a g g l u t i n i n ，a g g l u t i n i n 都被用以描述凝集素，其中l e c t i n 一词使用相对较多。随着凝集素家族成员的增加及对其结构、功能研究的深入，使得原先凝集素的定义需加以重新修证。1 9 9 5 年p e u m a n s 和v a nd a m m e 将凝集素定义为“p r o t e i n sp o s s e s s i n ga tl e a s to i q en o n c a t a l y t i cd o m a i e ，w h i c hb i n d sr e v e r s i b l yt os p e c i f i cm o n o o ro l i g o s a c c h a r i d e s ”即：含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质( p e u m a n se ta l ，1 9 9 5 ) 。植物凝集素最早发现于1 8 8 8 年，s t i l l m a r k 在蓖麻( r i c i n u so o m m u n i sl ) 籽萃耿物中发现了一种细胞凝集因子，它具有凝集红细胞的作用。以后多种凝集素不断得到发现。植物凝集素分布很广泛，高等植物中约有1 4 的植物含有凝集素，目前已从豆科、茄科、大戟科、汞本科、百合科、石蒜科、天南星科等植物中发现了1 0 0 0多种植物凝集素，其中豆科植物凝集素达6 0 0 多种，其种子内的植物凝集素含量最高，达种予蛋白质总含量的1 0 左右。植物凝集素存在于许多植物的储藏器官和繁殖器官中，分布于种子的胚乳和胚轴中、子叶，以及营养器官如叶片、茎、茎皮、鳞茎、块茎、球茎、根状茎、根、果实、花子房、韧皮部汁液和花蜜中都有分却。1 2 植物凝集素的分类1 2 1 从总体结构划分根据亚基的结构特征，凝集素可分为部分凝集素( m e r o l e c t i n ) 、全凝集素( h o l o i e c t i n ) 、嵌合凝集素( c h i m e r o l e c t i n ) 和超凝集索( s u p e r l e c t i n ) 四类。部分凝集素只含一个糖结合结构域，它们不能沉积复合糖和凝集细胞。全凝集素也只糖结合结构域组成，但包含至少两个完全相同或非常相似的糖结合结构域，它复b 人学博i j 学位论文们可以凝集细胞和沉淀复合糖。绝大多数具凝集功能的植物凝集素属此类。嵌合凝集素是一类融合蛋白，由一个或多个糖结合结构域及一个具有酶活性或其它生物活性的结构域共同组成。该类凝集素的典型代表是i i 型核糖体失活蛋白。超凝集素的糖结合结构域不完全相同或相似，它们识别结构不同的糖类( p e u m a n se ta l ，1 9 9 5 ) 。1 2 2 从进化和结构相关性划分根据氨基酸序列的同源性及其在进化上的关系划分，植物凝集素可分成7 个不同家族：豆科凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素、包含橡胶素( h e r e i n ) 结构域的几1 一质结合蛋白、i i 型核糖体失活蛋白( r i p ) 、葫芦科韧皮部凝集素、木菠罗素( j a c a l i n )家族、苋科凝集素( p e u m a n se ta l ，1 9 9 8 ) 。1 2 2 1 豆科凝集素目前已经从7 0 多种植物中纯化了豆科凝集素，其中对大约4 0 多种凝集素的基因进行了序列分析。大部分豆科凝集素来自种子，凝集素在豆科植物种子中的含量特别丰富，它们是在种子成熟过程中合成的，随后在种子萌发和苗的生长过程中被降解，为营养器官的发育提供营养物质。在豆科植物的其他组织如叶、茎、果实、树皮、根中也分布着一些和种子凝集素高度同源的凝集素，它们和种子凝集素有类似的氨基酸序列和糖结合特异性，但是仍然是出不同基因编码的蛋白( v a nd a m m ee ta l 。1 9 9 5 ，1 9 9 7 ) 。所有的豆科凝集素都山2 个或4 个3 0 k d a 的原体( p r o t o m e r ) 组成。豆科凝集素的糖结合特异性差异很大，大部分属于甘露槠葡萄糖和半乳糖n 一乙酰半乳糖胺结合凝集素，有些识别l 一岩藻糖，n e u 5 a ca ( 2 ，3 ) g a l g a l n a c 。豆科植物凝集素结合糖需要二价阳离子。伴刀豆球蛋白有两个会属结合位点，m n “或z n ”结合到位点1 ，然后促使c a 结合到位点2 ，c a 结合到凝集素上后能协调糖基结合部位的氨基酸和底物之间的相互作用，将金属离子移去后伴刀豆球蛋白不能再结合糖基。1 2 2 2 单子叶植物甘露糖结合凝集素单子叶植物 j 露糖结合凝集索存在于石蒜科、天南星科、兰科、百合科、凤梨科、葱科、鸢尾科这些单子叶植物中( v a nd a m m ee ta l ，1 9 9 5 ，2 0 0 0 ) ，共同的特点是由1 2 k d 的亚基组成同源二聚体或四聚体，可特异结合。一d - 甘露糖，每个原体有1 至3个活性结合位点。它们属于同一个进化相关蛋白的超家族，不仅序列上具有同源性，复q 人学博小学位论文分子模型的总体结构也非常相似。石蒜科、天南星科、兰科的许多种植物凝集素的c d n h序列同源性很高，但是特定科内的序列同源性要比科与科之间的序列同源性高。单子叶植物甘露糖结合凝集素是出大的基因家族编码，这些基因在氨基酸水平上的相似性高达8 0 以上，同一植物的不同组织中分靠着同源性很高的凝集素蛋白，通常认为它们是同工凝集素( 1 e c t i ni s o f o r m ) ，推测是由相同的前体蛋白经过不同的翻泽后加工产生的( v a nd a m m eela l ，1 9 9 7 ) 。啦予叶甘露糖凝集索一般出一个结构域组成。少数甘露糖凝集素的蛋白含有两个同源的结构域，翻译后切割成两个亚基，或者不切割连在一起形成多聚体。郁金香凝集素也是有两个结构域的四聚体蛋白，两个结构域有2 0 的相似性。大蒜凝集素( a l l i u ms a t i v u ma g g l u t i n i n ) 的两个结构域有8 5 的相似性，由一个前体切割成两个亚基。从野风信子( 5 0 i l l ac a s p a n u a t a ) 的球茎中分离的凝集索含有两个结构域，结构域有5 5 的相似性。两个结构域都出1 2 条b 链折叠成b 棱镜结构，含有三个糖结合位点，形成四聚体( w r i g h te ta l ，2 0 0 0 ) 。甘露糖在植物中的分锕很少，但是却广泛分札于病毒、细菌、真菌的表面，以及动物肠胃道的上皮细胞。因此，推测结合甘露糖的凝集素在植物抵御病原微生物、害虫和植食性动物中起重要作用。已经证实这类凝集素中的雪花莲凝集素( 6 a l a n t h u sn i v a i l sa g g l u t i n i n ，g n a ) 对刺吸式害虫有抗性。1 2 2 3 几丁质结合凝集素许多几丁质结合凝集素均包含有一个或多个橡胶素( h e r e i n ) 结构域。橡胶素是从橡胶树的乳液中分离的，由4 3 个氨基酸组成的小分子量蛋白，属于具有一个几丁质结合位点的单凝集索。 - - i | j i 已经在禾本科、荨麻科、罂粟科、商陆科和茄科中发现了几丁质结合凝集素的存在，它们具有高度的序列同源性( g a oe ta l 。2 0 0 0 ) 。1 2 2 4 i i 型核糖体失活蛋白1 i 型核糖体失活蛋白存在于大戟科、忍冬科、寄生科、毛茛科、樟科、西番莲科、鸢尾科和百合科的植物中，具有特异的r r n an 一糖苷酶活性能够催化失活真核细胞的核糖体。所有i i 型核糖体失活蛋白的序列都高度相似，折叠和三维结构也高度相似，然而。- c t f 的催化活性、底物特异性和细胞毒性却差异很大。i i 型核糖体失活蛋白由l 、2 或4 个相同的亚基组成，每个亚基包括两个在结构和功能上都不同的多肽，即a 链和b 链，两条链通过一个二硫键共价连接，a 链具有n 一糖营酶活性，b 链具有糖结合活性，主要识别半乳糖或n 一乙酰半乳糖胺。b 链有凝集素的特性，能使i i 型核糖体失复口人学博i 学位论义活蛋白结合于哺乳动物细胞表面的糖蛋白，触发受体介导的细胞内吞作用，进入细胞后，a 链选择性地水解真核尘物2 8 s 核糖体r n a 第4 3 2 4 位腺嘌呤的糖苷键，这是r r n a上延伸因子结合位点的一个关键碱基，使6 0 s 亚基不能结合延伸因子2 ，从而抑制蛋白质合成过程中的延伸步骤，去嘌呤的r n a 也很容易被降解( l a n g e re ta l ，1 9 9 6 ) 。1 2 2 5 木菠萝素( j a e a l i n ) 家族木菠萝素是从木菠萝果的种子中分离的可与半乳糖特异结合的凝集素。在桑科的其它植物中也发现了类似的凝集素后来在旋花科的一些植物中发现了与之序列高度同源的凝集素，于是把它们归为一个木菠萝素超家族。1 2 2 6 葫芦科韧皮部凝集素铂：多葫芦科植物韧皮部汁液中含有一种二聚体的几丁质结合凝集素。可结合g l c n h c 的寡聚体，是由两个完全相同的2 4 k d 的亚基组成的二聚体蛋白，成员间序列高度同源，但与其它植物凝集素却无明显的序列同源性，因此把它们归为一个小的凝集素家族。s o u t h e r nb l o t 杂交分析表明它们由一个小的基因家族编码( b o s t w i c ke ta l1 9 9 4 ) 。1 2 2 7 苋科凝集紊苋科凝集素是一个小的凝集素家族，只存在于苋科的一些植物中，对g a l n h c 具有特异性。它们在氨基酸序列和三维结构上都和其它植物凝集素不同( r a i n ae ta l ，1 9 9 2 ) 。1 3 植物凝集素的性质植物凝集素是一类具高度特异性糖结合活性的蛋白，这是它们区别于所有其它植物蛋白的标志。植物凝集素的糖结合特异性具有以下几个特点：1 凝集素可以特异结合的糖类的范冈是非常大的，虽然一种凝集索类型不能识别所有不同的糖类，但是目l m 所知的所有表面糖类几乎都可以为某种凝集素所识别。2 不同结构的凝集素可能识别相同的糖类。植物凝集素的糖结合特异性主要由结合位点的三维结构决定，不同凝集素家族成员的结合位点的总结构可能相同，因此它们可以识别同一利糖，如甘露糖可同时为豆科凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素、木菠萝素家族中的某些成员所识别。3 大多数凝集素对寡糖具有更高的亲和力。尤其是与复杂的寡糖相比，单糖或双糖需更高的浓度才能抑制凝集素。这是因为凝集素的糖结合位点与寡糖或复杂寡糖复q 人学博i ：学位论_ ! ：c =更为互补的缘故。4 大多数凝集索的特异性通常不是针对植物细胞内的糖分子，而常常是引。对微生物或害虫的内表面或外表面的聚糖。而且除了几丁质酶、葡聚糖酶和糖苷酶等几种酶外，凝集素是目前发现的唯一的一类可以识别并结合微生物( 如细菌和真菌) 外表面或植物害虫肠胃表面的糖复合物的植物蛋白。虽然凝集素可以结合像葡萄糖、甘露糖或半乳糖这样的单糖，但它们却通常对植物中并不常见的甚至在植物中不存在的寡糖有更高的亲和力和特异性，例如，所有的壳多糖结合凝架素都识别一种在植物中不存在却大量出现在真菌细胞壁和无脊椎动物中的糖类。植物凝集素另一大特性是它罕见的稳定性。大多参与植物抗性机制的蛋白都很稳定。大多数病原相关蛋白，如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂、抗真菌蛋白等都可以在通常使细胞内蛋白失活的条件下和很大的p h 范围内保持活性和稳定，对很多蛋白酶不敏感且耐高温。植物凝集素与之类似，它们中的大多数不会被动物或昆虫胃肠的蛋白酶降解，在很大范围内稳定，比其它蛋白如胞内酶更具热稳定性；还有一些凝集素甚至是完全稳定的蛋白。1 4 植物凝集素的功能迄今，人们已经从豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科等众多植物类群中分离鉴定出几百种植物凝集素，并对它们的性质、分子结构及功能作了大量的研究，许多工作已深入到基因水平。同类凝集素的氨基酸序列同源性极高，这种保守性l 暗示着凝集素在生物进化过程中以及植物生命过程中起着重要作用。例如，凝集素作为贮藏蛋白用束包装和运输物质，作为植物细胞的促有丝分裂因子，在多酶体系中结合糖蛋白，参与细胞壁的延伸、细胞f n j 的识别、生长调节以及碳水化合物的运输等。尤其是凝集素防卫功能的发现及证实，引起了人们极大的关注，些植物凝集索的基i 刖兜隆已应川f _ j i ：f l ! f 物执痫虫丛因上程。近年来。越来越多的分子生物学、生物化学、细胞学、生理学及进化学上的证据表明，大多数植物凝集素在植物生长发育的各个阶段，以不同的方式保护植物免受病虫的侵害。1 4 1 抗病毒生物医学研究表明，许多单子叶中结合甘露糖的凝集素对人类及动物反转录病毒( 包括h t v ) 翮q - 有效抑制作用，另外许多凝集素也具有间接防治病毒作用。例如，具杀虫性的凝集素防止或减少了昆虫传播的病毒病。1 4 2 抗细菌0复q 人学博士学位论空由于细菌细胞壁阻止了细胞膜上糖缀合物与结合碳水化合物的蛋白质之间相互作用，也防止了凝集素蛋白穿透细胞膜进入细胞质，因此凝集素不能改变细胞膜结构或渗透细胞膜，进而扰乱侵入微生物的正常细胞进程。m l l i 是桑树叶子中的一种凝集素，有抗细菌的活性。它能诱导桑树致病细菌的聚集( r a t a n a p oe ta l ，2 0 0 1 ) 。刺苹果种子凝集素可使细菌运动能力丧失，萌动种子释放凝集素可阻止幼根受到强致病细菌的侵害( p e u m a n se ta l ，1 9 9 5 ) 。1 4 3 抗真菌植物凝集素作为微生物与植物的共生介质，可防止植生病菌对植物的危害。结合几丁质的凝集素在植物防御真菌和害虫中起重要作用。已有实验证明，植物凝集素能结合真菌细胞，抑制孢子萌发和菌丝体生长。植物凝集素常积累于病原菌易侵染的部位。棉花种子中凝集素含量与棉花抗枯萎病能力呈正相关，分离纯化的棉花凝集索能明显凝集枯萎病菌的分生孢子，并抑制其萌发，显著抑制菌丝的生长。麦胚凝集素抑制绿色木霉的孢子萌发和菌丝生民。狭叶荨麻凝集素抑制狄葡萄孢、钩状木霉和布拉克霉的生长( b r o e k a e r te ta l ，1 9 8 9 ) 。从天麻中分离得到的天麻抗真菌蛋白g a f p 一1 。属于单子叶植物甘露糖结合凝集素家族成员，它对一些真菌有明显抗性。它能抑制一些病原菌菌丝的生长，包括7 a l s aa m b i e n s 、r h i z o c t o n i as o l a n i 、g i b b e r e l l az e r o 、6 a n o d e n o ai u c i d u m 年hb o t k v t i sc i n e r e a e ( x ue ta l ，1 9 9 8 ) 。商陆叶和种子中的核糖体失活蛋白可抑制立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 的生长。马铃薯凝集素能抗青桔假单胞菌。从无患子科植物t a l i s i ae s c u e n t a 的种子中分离的凝集索能抑制f u s “r i u mo x y s p o r u m 、c o e t o t r c f i u ml i n d e m u t f l i a n u m 和s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e三种致病真菌的生长( f r e i f ee ta l ，2 0 0 2 ) 。d o e s 等将荨麻凝集素( u r t i c ad i o i c aa g g l u t i n i n ，u d a ) 基因转入烟草，从烟草中纯化的u d a 可以抑制b o t r y t i sc i n e r e a 、t r i c h o 幽e r m av i r i d e 和c o e t o t r i c h u ml i n d e m u t h i a n u m 的生长( d o e se ta l 。1 9 9 9 ) 。从橡胶树( h e v e ab r a s i l i e n s i s ) 中分离的橡胶蛋白( h e v e i n ) ，是一种结合几 。质的凝集索，具有抗真菌活性，可以抑制病原菌的侵染和生长，对真菌生i 炙的抑制作用具有广谱性，对真菌生长的抑制作用与其结合几丁质的特性有关。h e r e i n 可用于控制致病真菌a l t e r n a r i ab r a s s i c a e 在十字花科植物中引起的病害。转基因植物表现出了明显的抗性：接种时问和潜伏期延长，坏死斑变小，发病指数降低，并延缓衰老。已证实h e r e i n 抗肋t ，v t i sc i n e r e a 、f u s a r i u mc u l m o r u 协、p u s a r i u mo x y s p o r u m和t r c h o d e r m ah a m a t u t t i 几种真菌( 曾r 中，1 9 9 8 ) 。复丑人学博一l 学位论文植物凝集素对真菌的抗生效应可能与它特异结合暴露于真菌细胞壁表面的糖复合物并导致真菌细胞壁及菌体结构形态改变有关。植物凝集索抑制真菌孢子萌发和菌丝生长是由于凝集素与真菌菌丝顶端微纤维交叉结合引起的。1 4 4 抗虫同高等动物一样植食性昆虫消化道表皮膜的主要成分是糖蛋白，因而在肠的内表皮上有凝集素潜在的结合位点。当凝集素随食物进入昆虫肠道后，就可结合到这些糖蛋白的受体上，阻碍昆虫的生长发育，甚至杀死昆虫。如今许多实验表明，来源于毖胚、马铃磬块茎、核桃、沙棘、水稻和刺荨麻的凝集索对豌豆象甲幼虫和豇豆象甲幼虫的生长有抑制作用。麦胚凝集素和紫羊蹄甲种子凝集素在相当低的含量水平就使 ；i j 孵土米螟幼虫致死( c z a p l a & l a n g ，1 9 9 0 ) 。雪花莲凝集素( g a l a n t h u sn i v a l 妇a g g l u t i n i n ，g n a ) 等对咀嚼式昆虫和刺吸式昆虫都有致死作用。在人工饲料中加入0 1 ( w v ) 的g n a ，饲喂水稻害虫，严重影响褐飞虱( n i l a p a r v a t al u g e n s ，b p b ) 的发育和生存，在喂食的第血天就有9 0 的昆虫死亡( f i t c h e se ta 1 1 9 9 7 ) 。g n a 还降低了b p h 成虫分泌蜜露的量，用g n a 处理2 4 小时后昆虫的蜜露分泌量减少了9 6 ( p o w e l le ta l ，1 9 9 5 ) 。有趣的是，让昆虫在转g n a 的植株和对照之间选择，发现b p b 的若虫会避丌转基因植株而选择对照植株( f o i s s a ce ta l ，2 0 0 0 ) 。在大肠杆菌中表达的g n a也有抗虫活性。在大肠杆菌中产生g n a 重组蛋白，通过金属亲和层析纯化c _ 端带有六个组氨酸的g n a 蛋白，纯化的重组蛋白能凝集兔红细胞特异结合甘露糖，掺入到人一l 饲料中。g n a 重组蛋白对b p h 的抗性类似天然蛋白。表明在大肠枰菌中表达的蛋白可以形成活性蛋白，引入的六个组氨酸并不影响其活性( l o n g s t a f fe ta l ，1 9 9 8 ) 。黄大肪等( 1 9 9 7 ) 报道来源于掌叶3 i ，夏和半夏的凝集素对麦长管蚜、禾缢管蚜、棉蚜和桃蚜等有致死活性。在三时半夏、掌时半夏、东北天南星和朝鲜天南星中纯化的凝集索蛋白都有抗虫活性。半夏外源凝集索( p i n e l l i at e r n a t aa g g l u t i n i n ，p t a ) 分子量为4 0 ，山4 个约1 2 k d 相同_ 哑基组成，p t a 粗提取液表现出对刺吸式同翅目害虫棉蚜有显著致死作用。用粗提取液加等量饲料饲喂棉蚜，成蚜4 8 h 致死率为4 0 ，8 4 h 为7 0 ，且产幼蚜率也明显降低( 王志斌，1 9 9 8 ) 。潘映红从掌1 1 r 半夏块茎中分离纯化到一利1 凝集素( p i n e l l i z 2p e d # ? t i s e c t aa g g l u t i n i n ，p p a ) ，p p 在刺吸式口器害虫棉蚜或桃蚜的人工饲料中分别含0 1 2 或0 1 5 时即显示出明显的致死作用，p p a是一种热稳定性较强，亚基分子量】2 k d 的非共价结合的四聚体凝集素( 潘映红，1 9 9 8 ) 。毛雪( 1 9 9 9 ) 从东北天南星( a r i s a o 脚aa m u r e n s em a x i m ) 的叶片中分离到凝集素蛋白( a m a ) 。采用全纯营养液人工饲养技术对a m a 凝集素的抗蚜效应进行了测试。结果表明，天南星凝集素在低浓度( 1 o g l ) 时即对棉蚜有明显的致死性和降低生殖、抑制发育进程的作用。李涧植等( 2 0 0 0 ) 从朝鲜天南星( a r i s a e m ac o n s a r g u d e u m s c h o t t )复q 人学博_ j 学位论文幼叶组织可溶性蛋白质中分离纯化到一种凝集素( a c a ) ，并以含a c a 的营养液饲喂棉蚜，浓度为1 5g l 时刘蚜虫有i 则显的致死活性。取食a c a 营养液的棉蚜生殖力显著低于列照3 0 繁殖力高蜂也明显向后推迟4 天棉蚜生嫡力也明显低于对照。1 4 5 抗癌药物和免疫调节剂有些植物凝集素有重要的药用价值，可用作抗癌药物或者免疫调节剂。槲寄生的提取物是有效的抗癌药物，其中的有效成分是槲寄生凝集素。将人的卵巢癌细胞植入小鼠体内，然后对小鼠注射槲寄生凝集素。8 4 天后，对照组只有1 0 的小鼠存活，而用凝集素处理的小鼠存活率为6 5 ，并且在小鼠体内没有发现肿瘤细胞( s c h u m a c h e re ta l ，2 0 0 0 ) 。槲寄生凝集素激活了细胞凋亡的级联反应，对动物的肿瘤